第四章 酶工程
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
第四章 酶1
• 酶活力的测定（实际就是酶的定量测定）：测定酶促反应 的速度 • 酶反应速度：单位时间内、单位体积中底物的减少量或产 物的增加量来表示，单位：浓度/反应时间 •一般测定产物的增加为好why？ •酶反应速度往往随时间延长而变化？ →常以酶促反应的初速度表示？ 据产物物理化学性质选择适当测定方法（以判断产物增加量） UV-Vis、荧光、同位素测定、电化学方法
2）转移酶Transferase
• 转移酶催化基团转移反应，即：将一个底物分子的基团 转移到另一个底物的分子上 • 例如：谷丙转氨酶催化的氨基转移反应
CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH NH2 CH3CCOOH O O HOOCCH2CH2CHCOOH NH2
• 还有转移碳基、醛或酮基、酰基、糖苷基、磷酸基和含 硫基的酶
• 生物体内辅因子种类有限，而酶的种类繁多 • 每一种需要辅因子的脱辅酶往往只能与特定的辅因子结合， 即：脱辅酶对辅因子的要求有一定选择性 • 同一种辅因子往往可以与多种不同的脱辅酶结合而表现出 多种不同的催化作用 • 如：3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶中，均需辅酶I • 催化不同的底物脱氢
3、单体酶、寡聚酶、多酶复合体
生
物
化
学
第四章 酶
酶——生物催化剂
• 每一种生物过程所必须，生命现象是催化剂催化的多步反应
• 营养素分子的分解、从小分子前体合成生物大分子 • 化学能的贮存和转换
• 细胞为什麽需要酶
• 在生理条件下无催化剂许多反应进行的太慢
• 在细胞环境中没有催化剂时许多生化反应不能进行
• 为什麽要研究酶？
• 酶研究是理解缺陷=遗传紊乱的基础（酶活性为什麽丧失？） • 是理解和治疗一些癌症的基础（为什麽生长控制中酶活性永远 处于“开”状态？） • 可以指示药物的作用靶点（病原体酶进行选择性抑制） • 应用于生物产业（复杂的合成与转化）
酶工程4
组分（酶、溶剂、底物和产物）的а
• 最佳水活度与溶剂的极性几乎无关
w
是相同的。
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表征必需水作用的参数---热力学水活度
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获得恒定水活度的方法：
• 向反应体系中直接加水。 ×
• 用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。 • 直接向反应体系加入水合盐：Na2HPO4（二、七、十 二水合盐）
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3 专一性
枯草杆菌蛋白酶催化在水溶液中催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L
苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应，在二氯甲烷或苯中：丝氨酸>苯丙氨
酸；在吡啶或季丁醇中：苯丙氨酸>丝氨酸 原因：溶剂改变底物分配系数
有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主 导反应。
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酶活性丧失的可能原因：
有机溶剂与底物或产物相互作用
• 直接作用：氯仿显著减少过氧化物酶催化苯酚的氧化，原因在于氯仿 是苯酚基的淬灭剂； • 影响底物或产物的分配
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2 活性
在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性 （Super-activity）。 表面活性剂刚性壳层能缓冲酶结构波动性，保证酶结构的稳定； 保护酶避免与有机溶剂直接接触； 为酶催化反应提供巨大相界面，减小传质阻力
剂（如吡啶或二甲基甲酰胺） 例：在己烷中聚苯酚氧化酶的催化反应，极性的苯醌产物不溶于己烷，
导致在酶周围的水层发生不需要的聚合，该聚合物缠住酶，降低酶活，
食品生物技术基础-酶工程
(1)自然酶
是指由生物材料中分离出来的酶。 主要靠微生物发酵生产，应用于工业和医学。 食品工业、制药工业、制革工业、酿造工业及纺 织工业使用酶制剂后可以大大地改造、革新工艺 流程并降低成本。 主要使用的自然酶，多数使用微生物来源的酶的 粗制剂。
特点：价格低，生产方式简单； 应用方便，不要辅因子参加； 产品种类少，应用范围窄。
第一节 酶工程概述
早期的酶工程技术主要是从动物、植物、微生物材料中提取、分离、 纯化制造各种酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。 ７０年代后，酶的固定化技术取得了突破，使固定化酶、固定化细 胞、生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。
随着第三代酶制剂的诞生，应用各种酶工程技术制造精细化工产品 和医药用品，及其在化学检测、环境保护等各个领域的有效应用， 使酶工程技术的产业化水平在现代生物技术领域中名列前茅，并正 在与基因工程、细胞工程和微生物工程融为一本，形成一个具有很 大经济效益与社会效益的新型工业门类。
1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召 开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了 对微生物细胞固定化的研究。 1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌 细胞生产L-天冬氨酸。 1978年,日本的铃木等固定化细胞生产 α 淀粉酶研究成功。所以说,70年代是固定化细 胞技术取得进展的时期。
（3）酶工程热点——— 酶法转化、折分合成手性药物及精细 化合物 ；
（4）构建新酶——— 抗体酶、核酶及人工合成酶是一个前沿 生长点 。
第二节
食品酶的生产与分离纯化
1、酶的生产
2、酶的制备——分离纯化
3、酶的保存
酶制剂有固态的也有液态的，那这些酶制剂是怎样产生的呢？ 1．可以采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将 酶提取出来。（提取法）
酶工程
酶电极具有测试Biblioteka 一、灵敏、快速、简便、准确的优点，并且稳定性较好，可以使用几十次到几百次
酶在有机介质中的催化特性: 底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性、PH特性
有机介质中酶催化反应的条件及其控制
酶的固定方法主要有五种：吸附法、包埋法、结合法、交联法。
各自概念和特点
1吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
物理吸附法制成的固定化酶，酶活力损失少，但酶易脱落，很少实用价值。
2包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
1.酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。
酶在有机介质中的各种催化反应受到各种因素的影响，主要有酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的种类、水含量、温度、PH和离子强度等。必须控制好各种条件并根据情况变化加以必要的调节控制。
氨基酸置换修饰的作用
1. 通过修饰可以提高酶活力2通过修饰可以增强酶的稳定性3通过修饰可以使酶的专一性发生改变
酶分子的物理修饰：通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰。
固定化酶与一般的水解酶相比具有的优点：
1极易将固定化酶和底物、产物分开；2产物中没有酶的残留，简化了工业设备；3可以反复使用；4可以提高酶的稳定性；5酶反应过程可以加以严格控制；6可以增加产物的收得率，提高产物质量；7酶使用效率提高，成本降低。
酶工程
《酶工程》要点1、酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程。
酶的生产：获得酶的技术——微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离。
酶的改性：改进酶的催化特性技术过程——酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化。
酶的应用：获得所需物质或除去不良物质技术过程——酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用。
2、酶工程的主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
3、酶的催化特点：（1）酶催化的专一性强——绝对与相对（2）酶催化效率高（3）作用条件温和4、影响酶催化作用的因素：（1）底物浓度——催化反应速度先随底物浓度增加而增加，达最大是趋于平衡，过量时反而下降。
（2）酶浓度——成正比。
（3）温度——过高过低影响酶活性，最适温度。
（4）PH——最适PH，极端PH酶分子空间构象改变而失活。
（5）抑制剂——可逆，不可逆。
（6）激活剂。
（7）底物结构类似物。
5、抑制机理：（1）竞争性抑制——抑制剂和底物竞争与酶分子的结合，V m不变，K m变小。
（2）非竞争性抑制——抑制剂和底物分别与酶分子结合，V m变小，K m不变。
（3）反竞争性抑制——抑制剂与中间复合体结合，V m和K m都变小。
6、酶的分类与命名：蛋白类酶——1氧化还原酶，2转移酶，3水解酶，4裂合酶，5异构酶，6连接酶（合成酶）。
四码编号法：第一个号码为六大类酶，第二个号码为亚类，第三个号码亚类中的小类，第四个号码该小类中的序号。
7、酶活力：一定条件下酶催化反应的初速度。
酶活力单位：特定条件下每1min催化1µmol 的底物转化为产物的酶量为1个酶活力单位。
酶的比活力：特定条件下单位质量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。
酶比活力=酶活力/mg蛋白质（RNA）8、酶的生产方法：（1）提取分离法——盐溶液提取、酸碱溶液提取、有机溶剂提取。
第四章 酶工程
丙酮酸+CO2+ATP+H2O 草酰乙酸+ADP+Pi
正反应、逆反应都用同一名称
DH2+NAD+D+NADH+H+
DH2NAD+氧化还原酶
各大类酶的 特殊命名规则
转移酶为供体 受体被转移 基团转移酶
氧化还原酶往往可 命名为供体受体 氧化还原酶，
值得注意的是来自不同物种或同 一物种的不同组织或不同细胞器 的同一种酶，虽然他们催化同一 个生化反应，但它们本身的一级 结构可能并不相同，命名也有所 区别
酶的一级结构
酶的二级结构
多肽链主 链原子的 局部空间 排列
酶的 二级 结构
螺旋结构 β-折叠
没有考虑到它的侧链的构象 或与其它部分的相互关系
酶蛋白的-螺旋结构
酶蛋白的折叠结构
由-螺旋、折叠和随机结构 构成的溶菌酶的空间结构
酶的三级结构
指单一的多肽链 或共价连接的多 肽链中，所有原 子在空间上的排 列
酶活性中心示意图
酶的活性中心构成
酶分子中的 氨基酸残基
酶 的 活 性 中 心
辅酶或辅助因子 或它们的部分 结构
酶的结构
四级结构
二级结构
酶的结构
三级结构
一级结构
酶的一级、二级、三级和四级结构示意图
酶的空间结构
三级结构
二级 结构
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶工程
酶，指具有生物催化功能的高分子物质，在酶的催化反应体系中，反应物分子被称为底物，底物通过酶的催化转化为另一种分子。
几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。
与其他非生物催化剂相似，酶通过降低化学反应的活化能（用Ea或ΔG表示）来加快反应速率，大多数的酶可以将其催化的反应之速率提高上百万倍；事实上，酶是提供另一条活化能需求较低的途径，使更多反应粒子能拥有不少于活化能的动能，从而加快反应速率。
酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。
酶有正催化作用也有负催化作用，不只是加快反应速率，也有减低反应速率。
与其他非生物催化剂不同的是，酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。
虽然酶大多是蛋白质，但少数具有生物催化功能的分子并非为蛋白质，有一些被称为核酶的RNA分子也具有催化功能。
此外，通过人工合成所谓人工酶也具有与酶类似的催化活性，包括人工合成的DNA。
有人认为酶应定义为具有催化功能的生物大分子，即生物催化剂。
酶的催化活性会受其他分子影响：抑制剂是可以降低酶活性的分子；激活剂则是可以增加酶活性的分子。
有许多药物和毒药就是酶的抑制剂。
酶的活性还可以被温度、化学环境（如pH值）、底物浓度以及电磁波（如微波）等许多因素所影响。
一、研究历史1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼（L.Spallanzani，1729—1799）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。
过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。
于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。
但是什么，他不清楚。
1833年，法国的培安和培洛里将磨碎麦芽的液体作用于淀粉，结果发现淀粉被分解，于是将这个分解淀粉的物质命名为Diastase，也就是现在所谓的淀粉酶。
后来，Diastase在法国成为用来表示所有酶的名称。
1836年，德国马普生物研究所科学家施旺（T.Schwann，1810—1882）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质，解开消化之谜。
《酶工程》王金胜版 1-4章 笔记
酶工程第一节概述一、酶的概念和作为生物催化剂的特点1、酶的概念：酶是由生物产生的具有催化作用的生物大分子，大部分在体内，小部分在体外，具有活性中心和特殊构象2、作为催化剂的特点1）极高的催化效率2）高度专一性——绝对专一性（一种酶只作用于一种底物）相对专一性（作用于一类底物或一种化学键）立体异构专一性（对底物立体构型的特异要求）3）活性可调节性（合成的诱导和阻碍、降解的促进、激活物和抑制物的调节作用，代谢物对酶的反馈调节，酶的变构调节、酶的化学修饰）4）酶的不稳定性（一定的ph和温度）二、酶的化学组成、结构和催化机理1.酶的化学本质和组成：本质是蛋白质（检测高度纯化和结晶的酶一级结构）根据组成分为：单纯酶（组成成分仅为氨基酸的一类酶）和结合酶（蛋白质-酶蛋白+非蛋白的小分子-辅助因子）全酶=酶蛋白+辅助因子2.酶的辅助因子酶蛋白—酶反应的专一性辅助因子—传递电子、原子、某些化学基团酶含有的金属离子—酶活性中心组成部分、连接底物盒酶分子的桥梁、稳定酶蛋白分子构像的必需品：常见的有k，na，mg，cu,Zn,Fe等3.酶结构与功能结构特征：一级结构：酶蛋白的20种氨基酸种类、数目和排列顺序（-sh参与组成酶活性中心）空间结构—维持酶活性中心所必需的构象。
肽链ß折叠—保持酶分子的球状椭圆状为主，折叠结构之间å以及折叠肽段相连功能部位：酶分子表面多种功能性区域。
酶活性中心与必需基团：酶活性中心：活性部位。
由在一级结构上可能很远但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基，集中在一起形成的，具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并催化底物转化为产物。
活性中心的必须基团：分为结合基团、催化基团。
是酶发挥催化作用与底物直接接触的基团。
诱导契合作用：底物接近酶是，诱导酶分子的构象变得能与底物配合，进而催化底物分子发生化学变化。
4.催化机理：降低反应活化能、中间产物学说、酶作用高效率机理（邻近效应、定向效应、底物分子变形或扭曲、酸碱催化、共价催化、金属离子的催化、活性中心的低介电信、协同催化）活化能：从初态到活化态所需的能量5.酶的分类：氧化还原酶（乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶）转移酶类（甲级转化酶、氨基转化酶、己糖激酶、磷酸化酶）水解酶类裂合酶类异构酶类连接酶类三、酶的分类和命名第二节酶促反应动力学（反应速度规律和因素）一、底物反应动力学1.单底物反应动力学-异构、裂解酶（仅底物浓度变化，与酶促反应关系——一级反应-混合级反应-零级反应）米氏方程km米氏常数=酶促反应为最大速度一半时的底物浓度mol／L2.双底物反应动力学（1）序列反应二、抑制反应动力学抑制剂-不变性，活性下降1不可逆抑制作用的抑制剂以共价键与酶的必需基团进行结合专一性不可抑制剂非专一性不可你抑制剂（一类或者几类基团）2.可逆抑制作用抑制剂以解离平衡为基础，非共价结合，物理方法去除后，活性恢复（1）竞争性抑制作用—与底物结构相似，竞争酶活性中心（2）非竞争性抑制作用—与活性中心以外的必需基团结合，不影响酶和底物。
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（五）固定化酶的应用
饮料和果汁
（1）速溶茶: 固定化单宁酶反应器，使速溶茶的 生产更为简单，产品速溶性更高；
（2）啤酒沉淀：用几丁质固定的木瓜蛋白酶可用 于啤酒大罐冷藏或过滤后装瓶进行处理； （3）柑橘类果汁脱苦：利用甲壳素固定化柚苷酶 作用于柚皮苷，生成不含苦味的物质。
乳制品
国外已用固定化黑曲霉乳糖酶处理牛奶生产 脱乳糖牛奶。
等电聚焦电泳
（1）先从阳极顶端扩散装入一种酸（如磷酸），然 后从阴极端扩散装入一种碱（如乙醇胺），用具有不同 等电点的脂肪族聚氨基聚羧基化合物作为两性电介质载 体，当阴阳两极通电以后电介质在一定范围内便形成pH 梯度，当该载体电介质同样品一起电泳时，蛋白质便朝 其各自等电点相等的pH位臵移动而被浓缩； （2）不但可将各种酶精确分开，通过测定各段的pH 还可以了解该酶的等电点。可以分离和检出等电点相差 仅0.02的两种蛋白质成分。
（3）固定化酶：酶分子通过吸附、交联、包埋及 共价结合等方法束缚于某种特定支持物上发挥酶的作 用。它在食品工业上具有较大的应用价值。 （4）人工合成酶：化学合成具有与天然酶相似功 能的催化物质，可以是蛋白质，也可以是简单的大分 子物质。
生物酶工程
也称高级酶工程，是酶学和分子生物学技术结合 的产物。
（3）一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反 应，较少改变酶的高级结构，酶活力的回收率较高； （4）仅适用于小分子底物和产物的酶。因为只有 小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这 种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和酶 活力的降低。
（二）固定化酶的性质
酶活力变化
（1）酶经固定化后，酶分子的构象可能改变，导致 了酶与底物结合能力或催化底物转化能力发生变化；
第四章 酶工程
参考书籍
彭志英主编. 《食品生物技术导论》. 中国轻工业 出版社，2010
罗云波，生吉萍主编.《食品生物技术导论》.化学 工业出版社，2006
施巧琴主编.《酶工程》.科学出版社, 2005
郭勇编.《酶工程原理与技术》.高等教育出版社, 2005
第一节 酶工程原理与技术
一、酶工程分类
可以将加水分解反应转化为其逆反应，如酯的合 成、肽的合成或酯交换反应。 改变酶对底物的专一性，同一种酶在不同的有机 溶剂中可以表现出不同的立体选择性。
（2）对于可作用于小分子和大分子底物的酶，固 定化酶的底物特异性会发生变化。
动力学常数变化
（1）酶固定于电中性载体后，表观米氏常数往往 比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小； （2）当底物与带有相反电荷的载体结合后，表观 米氏常数往往减小； （3）在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。
（三）固定化酶的评价指标
（ 1 ）用带负电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH偏高，反之偏低；
（ 2 ）当反应产物为酸性时，其最适 pH 偏高，反 之偏低。
最适温度变化
酶反应最适温度是酶失活速度与酶反应速度综合 的结果。在一般情况下，固定化后酶失活速度下降， 最适温度也随之提高。
酶作用的专一性
（1）对于作用于小分子底物的酶，固定化酶作用 的专一性通常与游离酶基本相同；
酶反应器是完成酶促反应的装臵，研究内容包括 酶反应器的类型、特性；酶反应器的设计、制造及选 择等。
二、酶的生产与分离纯化技术
酶的生产
（1）经过预先设计，并且通过人工控制而获得所 需酶的过程； （2）酶的生产方法有提取法、发酵法和化学合成 法，常用的是微生物发酵法。
酶的提取
在一定条件下，用适当溶剂处理含酶原料，使酶 充分溶解到溶剂中的过程。常用方法：盐溶液提取、 酸碱溶液提取、有机溶剂提取。
SDS-PAGE
（1）带电粒子在电场中向着与其自身所带电荷相 反的电极移动的过程； （2）在外电场作用下，电泳迁移率主要依赖于酶 的相对分子质量，与所带的净电荷和形状无关； （3）为了减少对流扩散，电泳过程一般在浸透了 缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶上进行；
（4）电泳分离的蛋白质的量通常较小（约数毫 克），常用作分析用。
离心分离法
在酶的提取分离纯化过程中，细胞收集、细胞碎片 和沉淀的分离以及酶纯化等要使用离心分离。
体积排阻法
利用溶液中各组分相对分子质量不同来进行分离的 一种方法。常用凝胶：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂 糖凝胶（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝胶（Biogel）等。
超滤
（1）在一定的正压力或负压力驱动下，将料液强制 通过一定孔径的超滤膜，部分小分子溶质和溶剂透过膜 而成为超滤液，大分子酶和蛋白质等物质被截留，从而 达到分离纯化目的，也可用于酶液的浓缩和脱色； （2）超滤膜截留颗粒直径范围为2～200nm，相当于 相对分子质量1,000～500,000； （3）构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维、尼龙、聚 砜、陶瓷等。
等电点沉淀法
利用蛋白质在等电点时溶解度最低，以及不同 的蛋白质具有不同的等电点这一特性，对酶进行分 离纯化的方法。经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀等 方法一起使用，使其沉淀完全。
有机溶剂沉淀法
利用酶在有机溶剂中溶解度不同而使其分离。 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙酮等。
（二）根据酶分子大小和形状不同的方法
利用酶具有的特异催化功能，对酶结构进行修饰改 造，并借助于生物反应器和工艺优化过程，有效地发 挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术。它包括 酶的提取与分离纯化技术、酶固定化技术、酶非水相 催化技术、酶的蛋白质工程和酶反应器设计等。
化学酶工程
也称初级酶工程，指自然酶、化学修饰酶、固定 化酶以及人工合成酶的研究和应用。 （1）自然酶：由生物材料中分离出来的酶制成的 酶制剂。价格低，生产方式简单；应用方便，不需辅 因子参加；产品种类少，应用范围窄。 （2）化学修饰酶：通过酶分子的化学修饰达到改 性变构的目的。主要用于酶学研究和疾病治疗。
（三）根据酶分子电荷性质的方法
离子交换层析
（1）根据被分离物质与分离介质（离子交换剂）间 异种电荷静电引力的不同来进行物质分离。不同离子交 换剂上可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同 物质分离； （2）离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交 换剂和阴离子交换剂。酶具有两性性质，可用阳离子交 换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。
相对酶活力
具有相同重量酶蛋白的固定化酶与游离酶活力 的比值。它与载体结构、颗粒大小、底物相对分子 质量及酶结合效率有关。相对酶活力低于75%的固定 化酶，一般无实际应用价值。
酶活力回收率
固定化酶总活力与用于固定化的酶总活力百分 比。一般情况下，活力回收率应小于l。
半衰期
在连续测定条件下，固定化酶活力下降为最初 活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。
（四）固定化酶的特点
极易将固定化酶与产物、底物分开；可以在较长时间 内进行反复分批反应和装柱连续反应，酶使用效率提高， 成本降低；在大多数情况下，可以提高酶稳定性，酶反 应过程可以严格控制；产物中没有酶残留，简化了工业 设备，可以增加产物收得率，提高产物质量。
固定化时，酶活力有损失；增加了固定化成本， 工厂投资开始增大；只能用于水溶性底物，而且 较适用于低分子质量底物，对高分子质量底物不 适宜；胞内酶必须经过酶分离过程。
（2）载体的存在给酶活性部位或调节部位造成某种 空间障碍，影响酶与底物的作用；
（3）酶包埋于载体，底物必须扩散进入载体才能和 酶分子接触，扩散速率的不同限制了酶与底物的作用。
酶稳定性变化 （1）增加了酶的耐热性；
（2）增强了酶对变性剂、抑制剂的抵抗能力；
（3）增强了酶的储藏和操作稳定性。
最适pH变化
30343.3
57.10 2.65 531.39 1.22
/
4.95 8.27 / 3.81
比活力 /(U/mg)
壳聚糖酶活力 蛋白酶活力 壳聚糖酶活力
纯化倍数
蛋白酶活力
1
1.22
/
三、酶的固定化
游离酶的缺陷
稳定性差,分离纯化、回收困难。 固定化酶
指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
根据溶解度变化的纯化方法较适宜于早期纯化阶 段，规模较大；而柱层析法或电泳分离更适宜于后期 的纯化过程，规模较小。
某些价格昂贵的层析介质及方法，只用于纯化过 程的最后几步。
（六）酶纯度与酶活力
实验室常用SDS-PAGE来检验酶的纯度。酶分子结构 高度复杂，同一种酶制剂，采用不同方法检验结果可 能不一致，酶纯度应注明达到哪种纯度，如电泳纯、 HPLC纯等。
比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。一般 情况下，酶的比活力随酶纯度的提高而提高。酶纯度 也可用酶的比活力来衡量。
实例一
纯化步骤 壳聚糖酶活力 总活力/U
酶的分离纯化
原酶 206.96 超滤酶 151.32 电泳纯化酶 40.92
蛋白酶活力
总蛋白/mg
41498.1
95.38 2.17 435.10 1
（四）根据酶分子专一性结合的分离方法
亲和层析
酶的底物、底物类似物及酶的竞争性抑制剂同酶之 间有着较高的亲和力，作为配基固定于不溶性载体，选 择性地将酶吸附而同杂质分离。然后通过改变缓冲液离 子强度和pH，也可以使用浓度更高的同一配体溶液或亲 和力更强的配体溶液，将酶洗脱下来。
（五）酶分离纯化的原则
（1）利用基因工程技术大量生产的酶（克隆酶）。
（2）修饰酶基因产生的遗传修饰酶（突变酶）。
（3）设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶。
非水介质中的酶反应