高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一基本原理⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
⏹原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。
二实验目的⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三实验器材1 菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2 溶液和试剂蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等3 仪器和用品三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四操作步骤1 培养基和试剂的配制（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告
耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告一、研究背景及意义耐热碱性蛋白酶是一种有重要应用价值的酶，广泛应用于医药、食品、皮革、环境保护等行业中。
其特点是能在高温高碱环境下稳定地存在和发挥作用，因此受到了广泛关注。
目前，已经有许多研究针对耐热碱性蛋白酶的产生菌株、分离鉴定及酶学特性进行了探究，但在实际应用中，仍存在一些问题需要解决，如酶的稳定性、效率和产量等方面，因此有必要进一步深入研究。
二、研究内容和方法本研究旨在分离鉴定耐热碱性蛋白酶产生菌株，并研究其基本酶学性质，为酶的进一步研发应用提供参考。
具体研究内容如下：1. 采集多种自然环境中的样品，如土壤、水、植物、动物等，通过培养分离的方式筛选产生耐热碱性蛋白酶的菌株；2. 对所得到的菌株进行形态学特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定，筛选出优良的菌株；3. 通过固体和液体发酵的方法大量制备菌株产生的耐热碱性蛋白酶；4. 研究酶的基本酶学性质，包括最适温度、最适pH值、热稳定性、抑制剂对酶的影响等；5. 对酶的酶动力学特性进行研究，包括酶的动力学常数、Michaelis-Menten方程、反应速率等。
三、预期结果本研究将分离鉴定出优良的耐热碱性蛋白酶产生菌株，并对酶的基本酶学性质和酶动力学特性进行研究，预计能够得到以下结果：1. 获得产生耐热碱性蛋白酶的优良菌株，为耐热碱性蛋白酶的基础研究和产业应用提供了可靠的物质基础；2. 揭示耐热碱性蛋白酶的基本酶学性质和酶动力学特性，为其进一步应用提供理论支持；3. 为该领域的后续研究提供实验方法和实验结果的参考，推动本领域的发展。
四、研究难点及解决思路本研究面临的主要难点在于如何获得稳定、高效率和高产量的耐热碱性蛋白酶，以及如何解决酶在产业应用中的稳定性问题。
针对这些问题，我们将采取以下解决思路：1. 进行大量的筛选和优化实验，从多个样品中挑选最适合的菌株进行培养和发酵；2. 通过改变培养条件、添加助剂等方法，优化酶的产量和活性，使其符合产业应用的需求；3. 在产业应用中，注意酶的保护和稳定性，避免不必要的失活和损失。
一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建 (2)
一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建引言蛋白酶是一类能够催化蛋白质降解的酶，广泛应用于食品工业、制药工业以及生物工程等领域。
本文旨在通过对一株蛋白酶产生菌的鉴定和酶性质研究，以及构建合适的表达载体,为进一步研究和应用提供理论和实验基础。
1.蛋白酶产生菌的鉴定为了找到适合产生目标蛋白酶的菌株，我们采用了一系列的方法进行菌株的筛选和鉴定。
11样品采集和处理从不同环境中采集样品，如土壤、水样、废弃物等。
样品收集后，使用适当的稀释液或生理盐水进行稀释，并进行菌落分离，得到单菌株。
1.2形态学鉴定通过观察菌株的菌落形态、菌落色素、胶质酶分解等特征进行初步鉴定。
1.3生理生化鉴定通过生理生化指标的测定，如代谢产物的产生、碳源利用和氮源利用等，对菌株进行进一步鉴定。
1.4分子生物学鉴定通过16SrRNA基因序列分析或其他分子鉴定方法，对菌株进行进一步确认，并与已知菌株进行比对和分类。
2.蛋白酶性质研究对已鉴定的产生蛋白酶的菌株进行酶性质研究，包括底物特异性、反应条件优化、酶活验证等。
2.2底物特异性研究通过对不同底物进行酶促反应,观察蛋白酶对不同底物的催化效果,确定其底物特异性。
2.3反应条件优化通过调整反应系统中的PH值、温度、底物浓度等条件，优化蛋白酶的酶活和稳定性。
2.4酶活验证采用适当的酶活测定方法，如比色法、荧光法等，对蛋白酶的酶活进行定量测定。
3.表达载体构建为了进一步研究蛋白酶的性质和应用,需要构建合适的表达载体，实现目标蛋白的高效表达。
3.2载体选择选择适合目标蛋白表达的载体，考虑载体的复制起点、选择标记等因素。
3.3基因克隆将目标蛋白酶的基因克隆到选择的表达载体上，使用适当的限制性内切酶进行连接和酶切。
3.4转化和筛选将表达载体输送到宿主菌中，通过转化和筛选得到表达目标蛋白的菌株。
3.5表达条件优化通过调整培养基成分、培养条件等因素，优化目标蛋白的表达水平。
结论通过对一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建,我们为进一步研究W应用蛋白酶提供了理论和实验基础。
蛋白酶生产菌的产酶条件研究
蛋白酶生产菌的产酶条件研究摘要：本文研究了蛋白酶生产菌的产酶条件，包括培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。
结果表明，较佳的产酶条件为：培养基为牛肉膏蛋白培养基，温度为30℃，pH值为7.0，氮源为酵母粉，碳源为葡萄糖，微量元素为FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和MnSO4·4H2O。
关键词：蛋白酶生产菌；产酶条件；培养基；温度；pH值；氮源；碳源；微量元素一、引言蛋白酶是一类水解蛋白质的酶，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
目前，蛋白酶的生产主要依靠微生物发酵。
因此，研究蛋白酶生产菌的产酶条件对于提高蛋白酶产量具有重要意义。
二、实验材料和方法2.1 实验材料实验菌株为产酶能力较强的芽孢杆菌；培养基为牛肉膏蛋白培养基；氮源包括酵母粉、尿素、胰蛋白胨和硝酸铵；碳源包括葡萄糖、麦芽糖、玉米粉和淀粉；微量元素包括FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O 和MnSO4·4H2O。
2.2 实验方法2.2.1 培养条件所有菌株均在37℃下保存，实验前取出，接种到液体牛肉膏蛋白培养基中，培养24小时后进行实验。
2.2.2 测定酶活力取培养液进行离心，取上清液作为酶液，用凝胶电泳法测定酶活力。
2.3 实验设计本实验采用单因素试验设计，探讨培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。
三、结果与分析3.1 培养基对蛋白酶产量的影响本实验选用了牛肉膏蛋白培养基、脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉等5种培养基进行对比。
结果表明，牛肉膏蛋白培养基的蛋白酶产量最高，为1.63 U/mL，而脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉的蛋白酶产量分别为0.84 U/mL、1.22 U/mL、1.09 U/mL和1.05 U/mL。
因此，牛肉膏蛋白培养基是较优的培养基。
3.2 温度对蛋白酶产量的影响本实验选用了25℃、30℃、35℃、40℃和45℃等5种温度进行对比。
一株蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究
２０ ０ ６年 第 ３期
一
株 蛋 白酶产 生 茵 的 筛 选 及 酶 学 性 质 研 究
李林 珂 ， 高玉 千 ， 崔 锦 ， 向东 马
（ 河南农业 大学生命科学 学院 ， 河南 郑州 ４ ０ ０ ） ５ ０ ２
摘要 ： 从牛奶场采集的土壤样品 中筛选得到 １ 株蛋白酶的高产菌株 ， 经鉴定为枯草 芽孢杆 菌， 其蛋
１ ６， ７ ． ４ １ １
本研究 显示 ， 真空渗入浸染 比普通浸染提高 了 烟草转化率 ， 分化芽多 、 健壮 ； 而获得较高转化率 的 关键是 ： 控制合适 的真空恢 复常压 时 。真空恢复 常压 时 问 为 １０ 。 化 率 最 高 ； 于 １０ 时 ， ８ｓ时 转 少 ８ ｓ 进
３ 结论
［］ 杨成丽 ， １ 刘树楠 ， 吉源 ， 高效 烟草遗传转化体系的建 周 等． 立及甜蛋白基因的导入 ［］生物技术 。 Ｏ 。 （）９ １ Ｊ． ２ ４１ ２ －—１ ． Ｏ ４ ｒ］ 々 郭丽红 ， 陈善 娜 ， 明． 龚 根癌农 杆菌 法转化 烟草 的条件 … 探索 ［］云南大学学报 ，０ ３ ２ （ ）１ ８ ５ ． Ｊ． ２ ０ ，５ ２ ：４ —１ ２ 刘艳军 ， 杨静慧 ， 杨恩芹 。 ． 等 提高农杆 菌基 因转化率 方 法的研究 ［］ 西南农 业 大学学 报 ， ０ ３ ２ （ ） １４— Ｊ． ２ ０ ，５ ２ ：４
曹传增 ， 刘凡， 赵泓， 影响不结球 白菜真空渗入转基 因 等． 频率的几个 因素［］华北农学报 ，０３１（）３ —３ ． Ｊ． ２０ ，８３：５ ８
张广辉， 巩振辉， 薛万新， 大白菜和油菜真空渗入遗传 等．
转化法初报 ［］西北农业大学学报 ， ９ ，６４ ： — ． Ｊ． １ ８２ （）１ ４ ９ 闰新甫 ． 转基 因植物 ［ ．北京 ： Ｍ］ 科学 出版社 ，０ ３ ８ ２ ０ ．７
嗜热菌P4的筛选、鉴定及其高温蛋白酶性质研究
算 酶 活 力 Ｊ ．
酶 活 单 位 定义 （Ｊ ：在 一 定 的温 度 和 ｐ Ｉ） Ｈ条 件下 ，ｌ ｎ 水解 酪 素 产生 １ ｇ 氨酸 为一 个 酶 活 力 ｍｉ 酪 单位 ．
２ 结果与分析
０
２１ 热菌 的筛选 ．嗜 本 实 验 分 离 到 嗜 热 菌 （ 长 温 度 大 于 生
５ ５ Ｃ）１ 株 ，其 中在蛋 白酶筛选平板上产透 ｏ ９ 明 圈 的 嗜热 菌 ｌ ，埘 其 中透 明 圈较 大 的 ８ ０株 株菌 进 彳 蛋 白酶 活力 的初 步测 定 （ 图 １． ＝ ｊ 了 见 ）
达 ９ ％． 同时 ，其部分生理生化特征与 《 ９ 伯杰 氏细菌鉴定手册》１ ４ １ 中嗜热芽孢杆菌 （ａｉｕ ｓ ａ — Ｂ ｃ ｌ ｅｒ ｌｓ ｔ ｏ ｔｅｍ ｐ ｉ ｓ ｈｒ ｏ ｈｌ ）一 致 （ 表 ２ ，因此 ，初 步 确定 该 菌株 为 嗜热 脂 肪 地 芽 孢 杆 菌 （ ｅｂ ｃ ｌｓ ｔ ｒｔ ｒ ｕ 见 ） Ｇ ｏ ａｉｕ ｅ ｏ ｅ— ｌ ｓａ ｈ ｍ ｐ ｉ ｓ．『 ：嗜热芽孢杆菌 （ ａｉｕ ｓ ａｏ ｅ ｏｈ ｕ）为嗜热脂肪地芽孢杆菌 （ｅｂｃｌ ｅ— ｏｈ ｕ） 注 ｌ Ｂ ｃｌ ｅｒ ｈｒ ｐ ｉｓ ｌ ｓｔ ｔ ｍ ｌ Ｇｏａｉｕ ｓ ａ ｌ ｓｔ ｒｔｅｍｏｈｌｓ ｏｈｒ ｐ ｉ ）的别 名 ． ｕ １
中 ，６ 水浴 ２ｍｉ，再加 入 预热 好 的 ２ ０ ｎ ％酪 蛋 白溶 液 １ ，摇 匀 后于 ６ ： ｍＬ ０ｃ水浴 １ ｌ ． 反成 完 毕 后 【 ０ｌｉ Ｉｎ 加入 ０４ｍｏＬ＝氯 乙 酸 ２ｍ ． ｌ ／ Ｌ终 止 反应 ． ０ ｍｎ 心 ５ｍｎ １ ０ ０ｒ ｉ离 ０ ／ ｉ，取 七清 ，加 入 （４ｍ １ 酸 钠 ５ｍｌ ） ｏ／碳 ． Ｉ Ｊ ， 再加 入 １ 福林 试 剂 ，摇 匀 置 于水 浴锅 中 ，继 续 保温 发 色 ２ ｉ，测 定 Ｏ … 另 外 ，空 ｒ对 照 在 加 ｍＬ ０ｒｎ ａ Ｄ Ｉ
3株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定(danbai)
应用与环境生物学报 2007,13(4):561～564 C h in J A ppl Environ B iol =ISSN 10062687X 2007208225收稿日期:2006203222 接收日期:20062052113国家科技攻关项目(No .2005DK A21201211)和国家自然科学基金资助项目(No .30400013) Supported by the M inistry of Science and Technol ogy (No .2005DK A21201211)and the Nati onal Natural ScienceFoundati on of China (No .30400013)33通讯作者 Corres ponding author (E 2mail:shenbiao@njau .edu .cn )3株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定3张燕新1 赵印1 许敬亮1 吴莹1 胡冰2 沈标133(1南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,2南京农业大学-天美电镜技术合作示范试验室 南京 210095)摘 要 从云南温泉的污泥样品中分离到3株产蛋白酶的高温菌S B11、S B31和SC5,通过其形态特征、生理生化特征和16S r DNA 序列比对分析等,初步鉴定这3株菌都属于土芽孢杆菌属(Geobacillus ),其最适生长温度为60℃,最适pH 为6.三者的蛋白酶活力分别可达35.6、26.1和26.6U mL -1,最适酶反应温度都在70℃以上,其中菌株S B31的蛋白酶其最适酶反应温度高达80℃,远高于一般动植物来源的蛋白酶.图4表1参11关键词 高温蛋白酶;高温菌;土芽孢杆菌属CLC Q939.106Isol a ti on and Character i za ti on ofThree Therm oph ili c Protea ses 2produc i n g Bacter i a3Z HANG Yanxin 1,ZHAO Yin 1,XU J ingliang 1,WU Ying 1,HU B ing 2&SHE N B iao133(1Key Laborator y of M icrobiological Engineering of Agricultural Envir on m ent,M inistry of Agriculture,N anjing Agricultur al University ,Nanjing 210095,China )(2E lectron M icroscope D e m onstrating L ab of N anjing Agriculture U niversity and Tianm ei Corporation ,Nanjing 210095,China )Abstract Three ther mophilic p r oteases 2p r oducing strains na med as S B11,S B31and SC5were is olated fr om the sludge of a hot s p ring in Yunnan .They were all identified as Geobacillus .according t o their mor phol ogical features,physi ol ogical and bi o 2che m ical characteristics,and phyl ogenetic analysis based on the sequences of 16S r DNA.The op ti m al te mperature and pH for their gr owth were 60℃and 6.0,res pectively .The p r oteases activities of S B11,S B31and SC5were 35.6,26.1,26.6U mL-1,res pectively .The op ti m u m te mperature f or the enzy me activity was 70～80℃,and itwas far higher than that of p r otea 2ses fr om ani m als and p lants .Fig 4,Tab 1,Ref 11Keywords ther mophilic p r oteases;ther mophile bacteriu m;Geobacillus CLC Q939.106 蛋白酶是一类很重要的水解酶类.自1945年瑞士D r .Jaag 等发现微生物碱性蛋白酶以来,蛋白酶由于其广泛的用途,已成为当前国内外研究的热点.据估计,当前世界工业用酶的市场价值约有25亿美元[1],其中蛋白酶销售额可占酶制剂总销售额的60%.微生物是蛋白酶最重要的来源,所产的蛋白酶较动物、植物来源的蛋白酶易于分离、纯化.高温微生物是极端微生物的一种,主要从堆肥、热泉、火山地、地热区土壤及海底火山附近等高温环境中分离得到,与生命起源、系统进化关系密切,具有独特的基因类型、特殊的生理机制及特殊的代谢产物[2],为地球上的边缘生命现象.由于动物、植物和常温微生物产生的蛋白酶热稳定性低,活性温度一般不超过60℃[3,4],而高温蛋白酶由于其显著的耐热性及其对有机溶剂、去污剂和变性剂等具有较强的抗性,所以,在食品加工、医药卫生、片基脱胶、皮革加工等诸多方面具有广泛的用途[5].自20世纪70年代至今,高温蛋白酶因具有良好的热稳定性、简单的生产和使用条件,从而成为酶学领域研究的热点之一.本研究从云南温泉的淤泥中分离出3株高温蛋白酶产生菌,并对其生理生化特性、系统发育以及酶活力进行了初步研究.1 材料和方法1.1 菌株3株菌分离自云南温泉的淤泥,编号为S B11、S B31、SC5.3株菌都能在牛乳脱脂平板上产生清晰可见的水解圈.1.2 培养基①酪素培养基[6]:蛋白胨10g,葡萄糖1g,氯化钠5g,氯化钙0.1g,L 2酪氨酸0.1g,琼脂22g,酪素5g,蒸馏水1000mL,pH 7.2～7.4,112℃,灭菌30m in .②牛乳脱脂培养基:用新鲜牛奶反复加热,除去脂肪.每次加热20～30m in,冷却后用吸管从底层吸出牛奶,弃去上层的脂肪.调节pH 至中性.112℃,灭菌30m in .③富集培养基:酵母膏1g,蛋白胨2g,硫酸铵3g,硫酸钾0.5g,氯化钾0.1g,甘氨酸0.7g,1%氯化锰80μL,1%绷酸钠210μL,1%硫酸锌11μL,0.1%硫酸铜25μL,0.1%钼酸钠15μL,0.1%硫酸钒15μL,0.1%硫酸5μL,0.1%硫酸镍5μL,1mol L -1氯化镁500μL,0.3mol L -1硝酸钙500μL,1%硫酸铁100μL ,0.5mol L -1氯化氢100μL,50%硫酸200μL,蒸馏水1000mL,pH 7.0,115℃,灭菌30m in .④葡萄糖铵盐培养基:葡萄糖10g,硫酸铵1.5g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.5g,蒸馏水1000mL,pH 7.0.⑤发酵培养基(Fd 培养基)[6]:葡萄糖10g,酵母膏2g,蛋白胨0.2g,氯化钠2g,氯化钙2g,磷酸氢二钾5g,磷酸二氢钾1.25g,硫酸镁0.01g,硫酸铁0.001g,蒸馏水1000mL,pH 7.0.1.3 菌株鉴定与系统进化分析菌株的形态特征、生理生化特征鉴定参照伯杰氏细菌鉴定手册.菌体及其芽孢的观察采用透射电子电子显微镜(H -7650,H itachi H igh 2Technol ogies 公司).细菌16S r DNA 的扩增与克隆参照分子克隆手册.所用的5′2端引物为:AG AGTTT 2G AT CCTGGCTCA 23′;3′2端引物为:T ACCTTGTT ACG ACTT 25′.PCR 反应条件为:94℃预变性5m in,95℃变性40s,50℃退火1m in,72℃延伸2m in,共循环30次,然后72℃保持10m in .用凝胶回收纯化试剂盒回收扩增到的目的片段,连接到p MD182T 载体上,挑取转化子测序.测序由联合基因上海联众基因研究院完成.并采用B i oedit,Clustal X 1.8.3,M ega 3.0等软件对菌株进行系统发育分析,采用邻接法构建系统进化树.1.4蛋白酶活力测定[7]取培养后的菌体离心液测定蛋白酶活力.取1mL 样品加入已经预先70℃保温的装有1mL 1%酪蛋白溶液(pH 6.8的磷酸缓冲液配置)的离心管中,于70℃水浴保温10m in,迅速加入2mL 0.4mol L -1三氯乙酸终止反应,于室温静置30m in,离心后取上清液1mL 置于试管中,加入5mL 0.4molL -1碳酸钠溶液及1mL 福林酚溶液,混匀后于40℃保温30m in,测定680n m 吸光度.酶活力单位定义:在pH 6.8的测定条件下,每分钟水解酪蛋白释放1μg 酪氨酸的酶量为一个蛋白酶活力单位(U ).酶活力(Λ/U mL -1)=△D 680n m ×K ×(4/10)×N△D 680n m :样品测定与空白试验光密度值之差;K :吸光常数;每一D 680n m 值所相当的酪氨酸量(μg ),由酪氨酸标准曲线测定计算后得到,本次实验中K =93.1;4:反应试剂总体积(mL );10:反应时间(m in );N :稀释倍数.2 结果与分析2.1 分离菌株的形态特征从云南热泉的淤泥中分离到3株产蛋白酶的高温菌,分别命名为S B11、S B31和SC5(图1).菌株S B11呈椭圆形,(2～3)μm ×(1～2)μm,成链,产芽孢,端生鞭毛,革兰氏染色阳性.菌株S B31为长杆菌,(6～7)μm ×0.5(～1)μm,有芽孢,侧生鞭毛,革兰氏染色阳性.菌株SC5为小杆菌,(3～4)μm ×(1～1.5)μm,产芽孢,周生鞭毛,革兰氏染色阳性.在菌株SC5细胞内有病毒颗粒的存在.图1 菌株S B11、S B13和SC5生物电子显微镜照片和光学显微镜照片Fig .1 I m ages of S B11,S B13and SC5under trans m issi on electr onic m icr oscope and op tical m icr oscope265 应用与环境生物学报 C h in J A ppl Environ B iol 13卷 在固体富集培养基上,于70℃培养18h 后,可以观察到S B11的菌落呈圆形,亮白色,表面干燥;菌株S B31菌落淡白色,略呈圆形,边缘整齐;菌株SC5为圆形,表面可见同心圆结构,由里向外分别为淡黄色、白色,边缘不整齐,湿润.2.2 高温菌株的生理生化特征菌株S B11、S B31和SC5的生理生化特征见表1.3株菌的V.P 反应均为阴性,吲哚试验阳性,柠檬酸试验阳性,不能分解苯丙氨酸;能水解淀粉、酪素,不能水解纤维素;能利用葡萄糖、木糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、半乳糖,不能利用乳糖.能利用有机氮、氨态氮、硝态氮等氮源;最适生长温度为60℃,最适pH 为6.0(图2).表1 3株菌的生理生化特征Table1 Characteristics of S B11,S B13and SC5菌株StrainS B11S B31SC5菌株StrainS B11S B31S C5M.R.试验Methyl red exa m inati on +++V.P .试验Voges Pr oskauer exam inati on ---吲哚试验I ndole exa m inati on+++明胶液化Gelatin liquefacti on ---苯丙氨酸脱氢酶试验Phenylalanine dehydr ogenase ---柠檬酸盐试验Citrate exa m inati on+++生长基质Gr owth substrates 生长基质Gr owth substrates 淀粉Starch +++纤维素Cellul ose ---木糖Xyl ose +++蔗糖Sacchar ose +++麦芽糖Malt ose +++半乳糖Galact ose +++果糖Fruct ose +++乳糖Lact ose ---牛肉膏B re wis +++葡萄糖Glucose +++蛋白胨Pep t one+++酵母膏Yeast+++硫酸铵Ammonium sul phate +++氯化铵Ammonium chl oride +++硝酸铵Ammonium nitrate+++尿素Carba m ide+++图2 温度和pH 对菌体生长的影响Fig .2 Effect of temperature and pH on gr owth of S B11,S B13and SC52.3 3株菌的系统发育分析3株菌的16S r DNA?序列在RDP 数据库比对分析后表明,它们都与Geobacilluss s p.具有的较高同源性.从Gen Bank中调取相关的16S r DNA 序列,采用B i oedit 、Clustal X1.8.3、Mega3.0等软件对3株菌进行系统发育分析,采用邻接法构建系统进化树(图3).从3株菌的16Sr DNA 序列聚类分析结果来看,菌株S B11、SC5与G .kaustophilus 和G .ther m oleovorans 亲缘关系最密切,菌株S B31与G .stearother m ophilus 亲缘关系最密切.结合以上的菌体形态特征及生理生化特征,把3株菌初步鉴定为Geoba 2cillus s p.2.4 3株菌的高温蛋白酶酶活力比较[8,9]在70℃的培养温度下,菌株S B11、S B31和SC5都能在牛奶酪素平板上产生清晰可见的透明圈,透明圈直径和菌落直径的比值分别为2.88、1.80和2.83.菌株在70℃的恒温振荡器中培养48h,离心后测定上清液的高温蛋白酶的酶活力.由图4可见,S B11、S C5蛋白酶的最适反应温度为70℃,菌株S B31蛋白酶的最适反应温度为80℃,当温度达到90℃时酶活力都已经降得很低了.菌株S B11、S B31、SC5培养48h 后,培养液中的蛋白酶活力(在各自最适合温度下)分别为35.6、26.1、26.6U mL -1.3 结论和讨论高温微生物具有独特的基因类型、特殊的生理机制及特殊的代谢产物,具有很高的研究价值.本文从云南温泉的淤泥中分离到3株高温蛋白酶产生菌,经培养特征观察、生理生化实验以及16S r DNA 序列系统聚类分析等,将其鉴定为Geobacillus s p.,最适生长温度为60℃,最适pH 为6.3株菌都能在牛奶酪素平板上产生清晰可见的透明圈,透明圈直径和菌落直径的比值分别为2.88、1.80和2.83;产高温蛋白酶的酶活力可达35.6、26.1、26.6U mL -1.虽然3菌株经初步鉴定都属于土芽孢杆菌属,但形态差别很大,表明了微生物的多样性.在电镜下可看到菌株SC5菌体内有病毒粒子的存在,其对宿主的影响还需进一步研究.虽然365 4期张燕新等:3株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定 图3 菌株S B1、S B3和SC5的系统发育树状关系图Fig.3 Phyl ogenetic analysis of S B11,S B13and SC5Bootstrap values(%)are indicated at the nodes.The scalebars rep resent0.002substituti on per site.The accessi on numbers are inparentheses图4 温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of te mperature on the activityof ther mophlic p r oteases3菌株的最适生长温度为60℃,但其产生蛋白酶的最适酶反应温度都在70℃以上.3菌株产蛋白酶的能力也还需要通过生物技术[10,11]的方法进一步提高.References1 L in Y(林影),Lu RD(卢荣德).极端酶及其工业应用.Ind M icro2 biol(工业微生物),2000,30(2):51～532 W ang HM(王红妹).D iversity of extre mophiles m ir oorganis ma and their app licati 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