血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定
医学免疫学：血清免疫球蛋白的纯化
实验原理
• 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水 基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带 有电荷的情况决定的。
• 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化 膜层减弱乃至消失;同时，中性盐加入蛋白质溶液 后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大 量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质 分子之间聚集而沉淀,这个过程叫做盐析。
• 边加PBS，边关注核酸蛋白检测仪的数值变化， 当数值到达5时收集核酸蛋白检测仪出水口的液体， 当数值下降到10时，停止收集。
• 将收集到的蛋白质液体用OD280和OD260测蛋 白质浓度。
实验结果
• 用紫外分光光度计测全血清和纯化后蛋白质溶液 的吸光度值，并求出蛋白质浓度。
蛋白质含量(mg/ml)= (1.45×OD280－0.74×OD260) ×稀释倍数
1.45和0.74是常数
注意事项
• 实验步骤中，用红色标出的地方。
实验原理—盐析
• 不同性质的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐 而分阶段从溶液中沉淀出来。
• 分离提纯IgG最常用的中性盐是硫酸铵。 • 30～50%的硫酸铵可以沉淀IgG。
实验原理—分子筛层析
• 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。它的突出优 点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温 度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成 分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质 有很好的分离效果。
液。置室温15min，离心3500rpm×10min，弃 上清。 沉淀物用2mlPBS重悬。
血清球蛋白提纯实验报告
血清球蛋白提纯实验报告血清球蛋白提纯实验报告引言：血清球蛋白是一种重要的生物分子，具有多种生物学功能。
为了深入研究其结构和功能，本实验旨在通过一系列的步骤，从血清中提纯球蛋白，以获得高纯度的样品。
材料与方法：1. 血清样品：从健康人体中采集的血清样品。
2. 氨硫脲：用于沉淀球蛋白。
3. 离心管：用于离心沉淀。
4. 0.1 M磷酸盐缓冲液：用于洗涤球蛋白。
5. 0.01 M磷酸盐缓冲液：用于稀释。
6. 蛋白质含量测定试剂盒：用于测定球蛋白的浓度。
7. SDS-PAGE凝胶：用于分离蛋白质。
8. Coomassie蓝染色剂：用于染色。
实验步骤：1. 将血清样品加入离心管中，加入适量的氨硫脲，使其浓度达到10%。
2. 将离心管置于离心机中，以10000 rpm的速度离心10分钟，以沉淀球蛋白。
3. 弃去上清液，加入适量的0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，重复此步骤3次。
4. 加入适量的0.01 M磷酸盐缓冲液稀释球蛋白，使其浓度适宜。
5. 使用蛋白质含量测定试剂盒，测定球蛋白的浓度。
6. 将提纯后的球蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离。
7. 将凝胶染色剂浸泡在凝胶中，染色15分钟，然后用脱色剂洗净凝胶。
结果与讨论：通过上述步骤，我们成功地从血清中提纯出了球蛋白。
首先，我们通过离心的方式，将球蛋白从血清中沉淀下来。
然后，通过洗涤步骤，去除了与球蛋白不相关的杂质。
最后，我们对提纯后的球蛋白样品进行了浓度测定，并进行了SDS-PAGE凝胶电泳分离。
通过SDS-PAGE凝胶电泳的结果，我们可以看到凝胶上出现了明显的蛋白质条带。
根据分子量标记，我们可以初步判断出这些条带对应的是球蛋白。
进一步的实验可以通过Western blot等方法来确认这些条带的确为球蛋白。
在实验过程中，我们需要注意一些问题。
首先，血清样品的采集和保存要注意避免污染和降解。
其次，实验操作要严格控制温度和时间，以确保实验的准确性和重复性。
IgG的分离、提取与鉴定
IgG分离、纯化与鉴定实验原理操作步骤：1、取2.5ml血清，加pH7.0 PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。
2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置20min。
4、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。
5、于沉淀中加5ml PBS，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置20min。
6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。
7、用1ml PBS溶解沉淀，装入透析袋。
8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。
8、SephadexG50 除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。
9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。
根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。
抽干，改用0.5mol/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。
再改用0.5mol/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。
本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
10、装柱用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。
然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约11mL处左右为止，在床面上放一张圆形滤纸片。
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用
1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降 到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气 进行凝胶床)。
2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢 的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝 胶床表面的平整)。
其中前两个阶段为生物大分 子分离纯化的前处理。
选择材料 破碎细胞
提取 分离纯化 分析及鉴定
常用的蛋白质分离纯化技术
依据性质
溶解度 分子大小
带电特性 吸附特性 对配体分子 的亲和性
方法
用于粗分
用于细分
盐析、等电点沉淀、 有机溶剂沉淀
透析、超过滤
密度梯度离心、凝 胶过滤
电泳、离子交换层析
吸附层析
亲和层析、金属 螯合层析
蛋白质分离纯化
三、纯化（离子交换色谱法）
离子交换色谱（ion exchange ） chromatography
以离子交换剂为固定相，利用样品中不 同的生物大分子的带电部分与具有相反电 荷的离子交换剂吸附强弱不同，而将混合 物中的不同离子进行分离的色谱技术。
蛋白质分离纯化
两种离子交换剂
阳离子交换剂（cation exchanger）
破坏水化膜，暴露出疏水区域， 中和电荷，破坏亲水溶胶
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质
（亲水胶体）
脱水
碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
球蛋白纯化实验报告
一、实验目的1. 学习球蛋白的分离和纯化技术；2. 掌握盐析法、凝胶层析法等纯化方法；3. 熟悉球蛋白纯度的鉴定方法。
二、实验原理球蛋白是血清中的一种重要蛋白质，其含量约占血清总蛋白的16%。
由于球蛋白与其他蛋白质在分子量、溶解度、带电荷等方面存在差异，因此可以通过盐析法、凝胶层析法等方法进行分离和纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清、硫酸铵、Sephadex G-25凝胶、醋酸纤维素薄膜、电泳缓冲液等；2. 实验仪器：离心机、电泳仪、凝胶层析柱、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 球蛋白粗提（1）取一定量的血清，加入适量的硫酸铵，搅拌均匀；（2）静置一段时间，使球蛋白沉淀；（3）离心分离，收集沉淀；（4）将沉淀溶解于适量的去离子水中，得到球蛋白粗制品。
2. 球蛋白纯化（1）将球蛋白粗制品加入适量的Sephadex G-25凝胶柱中；（2）用去离子水进行洗脱，收集洗脱液；（3）用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，确定最佳洗脱条件。
3. 球蛋白纯度鉴定（1）取适量纯化后的球蛋白，进行醋酸纤维素薄膜电泳；（2）用标准蛋白质分子量对照，观察球蛋白的电泳图谱；（3）根据电泳图谱，判断球蛋白的纯度。
五、实验结果与分析1. 球蛋白粗提实验结果显示，通过盐析法从血清中成功提取了球蛋白，沉淀量约为1.2g。
2. 球蛋白纯化实验结果表明，通过凝胶层析法成功纯化了球蛋白，蛋白质纯度达到90%以上。
3. 球蛋白纯度鉴定通过醋酸纤维素薄膜电泳，观察到纯化后的球蛋白在相应位置呈现出明显的条带，与标准蛋白质分子量对照一致，说明球蛋白纯度较高。
六、实验结论1. 本实验成功从血清中提取了球蛋白，并通过盐析法、凝胶层析法等方法进行了纯化；2. 纯化后的球蛋白纯度较高，可用于进一步的研究和应用。
七、实验讨论1. 盐析法是一种简单、有效的球蛋白粗提方法，但纯度较低；2. 凝胶层析法是一种高效、简便的球蛋白纯化方法，但操作较为复杂；3. 醋酸纤维素薄膜电泳法是一种常用的球蛋白纯度鉴定方法，操作简便，结果准确。
07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。
脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。
（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。
鱼类血清中免疫球蛋白的分离与鉴定
鱼类血清中免疫球蛋白的分离与鉴定鱼类是世界上最重要的经济水生动物之一，其免疫系统的稳定和健康是保障其生长和发展的关键。
其中免疫球蛋白是重要的免疫分子之一，其在鱼类的免疫反应中起着重要的作用。
因此，对鱼类血清中免疫球蛋白的分离和鉴定研究具有重要意义。
一、鱼类血清中免疫球蛋白的种类与结构鱼类血清中的免疫球蛋白主要包括IgM、IgD、IgT等。
其中，IgM是鱼类体内最丰富的免疫球蛋白，同时也是最早被发现的免疫球蛋白。
IgD在鱼类体内数量相对较少，而IgT则是近年来研究的热点之一。
免疫球蛋白的结构与哺乳动物的IgG相似，有两个重链和两个轻链组成。
不同的是，鱼类IgM的中间链是由多个单独的VH和VL组成的，并形成一个聚集体。
此外，鱼类的免疫球蛋白并不是由免疫细胞合成产生，而是由肝脏、脾脏、肠道等多种组织细胞产生。
二、鱼类血清中免疫球蛋白的分离方法常用的鱼类血清中免疫球蛋白的分离方法包括电泳、高效液相色谱和免疫亲和层析等。
在鱼类免疫球蛋白的分离中，电泳是最常用的方法之一。
分离过程中，可通过改变电场或pH值等条件来分离IgM、IgD和IgT等不同形式的免疫球蛋白。
高效液相色谱分离法则是将血清样品通过短柱层析分离，这种方法具有分离效率高、分离线性好等优点。
同时，它也方便后续的免疫学研究。
免疫亲和层析分离法则是利用多肽和抗原结合来选择性地分离出特定的免疫球蛋白。
不过，现在免疫亲和层析技术的应用还不太成熟，需要更多的改进和完善。
三、鱼类血清中免疫球蛋白的鉴定方法鱼类血清中免疫球蛋白的鉴定方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、西方印迹等。
酶联免疫吸附试验是目前应用最广泛的鱼类血清中免疫球蛋白的检测方法之一。
它利用特异性抗体对免疫球蛋白进行检测，对检测结果的灵敏度和准确性都非常高。
西方印迹法则是通过特异性抗体，可以将鱼类血清中的免疫球蛋白在胶体电泳中分离出来。
然后，将其转移到聚丙烯酰胺凝胶上，并使用特异性抗体进行检测。
血清球蛋白提纯实验报告
一、实验目的1. 掌握血清球蛋白的提取和纯化方法；2. 熟悉盐析法、凝胶层析法等分离纯化技术；3. 了解血清球蛋白的生物学功能和应用。
二、实验原理血清球蛋白是人体免疫系统中的一种重要蛋白质，具有多种生物学功能。
本实验采用盐析法和凝胶层析法对血清球蛋白进行提取和纯化，通过比较纯化前后球蛋白的生物学活性，验证实验结果的可靠性。
三、实验材料1. 血清样本：取健康人血清，低温保存；2. 试剂：硫酸铵、醋酸纤维素薄膜、凝胶层析柱、染色剂等；3. 仪器：离心机、电泳仪、凝胶成像仪等。
四、实验步骤1. 盐析法提取血清球蛋白（1）取一定量血清样本，加入适量的硫酸铵，搅拌均匀；（2）静置沉淀，离心分离，收集沉淀物；（3）将沉淀物溶解于适量的去离子水中，得到初步纯化的血清球蛋白溶液。
2. 凝胶层析法纯化血清球蛋白（1）将凝胶层析柱装满Sephadex G-25凝胶；（2）将初步纯化的血清球蛋白溶液加入凝胶层析柱，收集流出的溶液；（3）收集含有血清球蛋白的洗脱液，进行蛋白浓度测定。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定血清球蛋白纯度（1）制备醋酸纤维素薄膜，将其固定在电泳槽中；（2）取一定量的血清球蛋白溶液，加入适量电泳缓冲液，制成样品；（3）进行电泳，观察血清球蛋白的迁移情况，分析纯度。
五、实验结果与分析1. 盐析法提取血清球蛋白：实验结果表明，通过盐析法可以有效地提取血清球蛋白，提取率约为80%。
2. 凝胶层析法纯化血清球蛋白：实验结果显示，经过凝胶层析法纯化后，血清球蛋白的纯度得到了显著提高，纯度达到90%以上。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定血清球蛋白纯度：电泳结果显示，纯化后的血清球蛋白在醋酸纤维素薄膜上呈现出明显的单一条带，证明纯化效果良好。
六、实验结论本实验采用盐析法和凝胶层析法对血清球蛋白进行了提取和纯化，实验结果表明，该方法能够有效地提高血清球蛋白的纯度，为后续的生物学研究和应用奠定了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，盐析法提取血清球蛋白的效率较高，但纯度相对较低。
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I 血液及组织样品的制备 分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。 一、血液样品 (一）采血 测定用的血液，多由静脉采集。一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。 (二）血清、全血及血浆的制备 1.血清的制备 血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃ 恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。 2.全血及血浆的制备 取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。将已抗凝的全二于2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。 3.抗凝剂 凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。 （1）草酸钾（钠） 优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。每毫升血液用1-2mg 即可。 配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干（若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。可抗凝血液5ml 。 此抗凝血，常用于非蛋白氮等多种测定项目，但不适用于钾、钙的测定。对乳酸脱氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用时应注意。 ( 2）草酸钾-氟化钠氟化钠 是一种弱抗凝剂。但浓度2mg / ml 时能抑制血液内葡萄糖的分解，因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用。 配制方法：草酸钾6g、氟化钠3g，溶于100ml 蒸馏水中。每个试管加入0.25ml，于80℃ 烘干备用。每管含混合剂22. 5mg，可抗凝5ml 血液。 此抗凝血，因氟化钠抑制睬酶，所以不能用于脉酶法的尿素氮测定；也不能用于淀粉酶及磷酸酶的测定。 (3）乙二胺四乙酸二钠盐（简称EDTANa2 ) EDTANa2 易与钙离子络合而使血液不凝。 有效浓度为0.5mg 可抗凝lml 血液。 配制方法：配成4 % EDTANa ：水溶液。每管装0.lml , 80 ℃ 烘干，可抗凝5ml 血液。此抗凝血液适用于多种生化分析。但不能用于血浆中含氮物质、钙及钠的测定。 (4）肝素 最佳抗凝剂，主要抑制凝血酶原转变为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而凝血：0.1 -0.2mg 或20 单位可抗凝lml 血液。 配制方法：配成10mg /ml 的水溶液。每管加0.lml 于37-56 ℃ 烘干，可抗凝5-10ml血液（市售品为肝素钠溶液，每毫升含12,500 国际单位，相当干100mg ，故每125 国际单位相当于lmg ) 除上述抗凝剂外，还有柠檬酸钠、草酸铵等，因不常用，故不作介绍。 (三）无蛋白血滤液的制备 测定血液或其它体液化学成分时，样品内蛋白质的存在常常干扰测定。因此，需要先做成无蛋白血滤液再行测定。 无蛋白血滤液制备的基本原理是以蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，用过滤法或离心法除去沉淀的蛋白。现介绍几种常用的方法： 1.钨酸法 原理： 钨酸钠与硫酸混合，生成钨酸： Na2WO4 + H2SO4 → H2WO4 十Na2SO4 血液中蛋白质在pH 值小于等电点的溶液中可被钨酸沉淀：沉淀液过滤或离心，上清液即为无色而透明、pH 约等于6 的无蛋白滤液。可供非蛋白氮、血糖、氨基酸、尿素、尿酸及氯化物等项测定使用。 制备方法： (1）取50ml 锥形瓶1 只，加入蒸馏水7 份；（2）用奥氏吸管吸取抗凝血1 份，擦去管壁外血液，将吸管插入锥形瓶底部，缓缓放出血液。放完血液后，将吸管提高吸取上清液再吹入，反复洗管3 次。充分混合，使红细胞完全溶解；( 3）加入0.333mol/l，硫酸溶液1 份，随加随摇，充分混匀，此时血液由鲜红变成棕色，静置5-10min ，使其酸化完全；(4) 加入10 ％钨酸钠1 份，随加随摇；(5）放置约5min 后，如振摇亦不再发生泡沫，说明蛋白质已完全变性沉淀。用定量滤纸过滤或离心（2,500r/min , 10min) ，即得完全澄清无色之无蛋白血滤液。 用此法制得的无蛋白血滤液为10 倍稀释的血滤液。即每毫升血滤液相当于0.lml全血。 试剂：(1) 10 ％钨酸钠溶液（2) 0.333mol/L 硫酸溶液 2.氢氧化锌法 原理：血液中蛋白质在pH 大于等电点的溶液中可用znZ 十来沉淀。生成的氢氧化锌本身为胶体可将血中葡萄糖以外的许多还原性物质吸附而沉淀，所以此法所得滤液最适作血液葡萄糖的测定（因为葡萄糖多是利用它的还原性来定量的）。但测定尿酸和非蛋白氮时含量降低，不宜使用此滤液。 制备方法：(1)取干燥、洁净的50ml 锥形瓶或大试管1 支，准确加入7 份水；(2）加入混匀的抗凝血1 份，摇匀；(3）加入10 ％硫酸锌溶液1 份，摇匀；(4）慢慢加入0.5mol / L 氢氧化钠溶液1 份，边加边摇，放置5min ，用定量滤纸过滤或离心（2,500，10min ) ，除去沉淀，便得到完全澄清的无蛋白血滤液。此滤液亦为稀释10 倍之血滤液。 试剂：(l) 10 ％硫酸锌溶液（2) 0.5mol / L 氢氧化钠溶液 3.三氯醋酸法 原理：三氯醋酸为一有机强酸，能使蛋白质变性而沉淀。 制备方法：取10 ％三氯醋酸9 份置于锥形瓶或大试管中，加1 份已充分混匀的抗凝血液。加时要不断摇动，使其均匀。静置5min ，过滤或离心。即得10 倍稀释之清明透亮的滤液。 二、组织样品 在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。或者从组织中分离、 纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。 但是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必需在冰冷条件下进行，并日需尽快完成测定。否则其所含物质的量和生物活性都将发生变化。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。 组织糜：迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或加入少量砂于乳钵中，研磨至糊状。组织匀浆：取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。由于匀浆器的柞头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。 常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和0 .25mol/L 的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。 组织浸出液：上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。 II 蛋白质的沉淀反应
1．实验原理 在水溶液中，蛋白质分子表面结合大量的水分子，形成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀作用。蛋白质的沉淀作用分为两类： 1）可逆沉淀作用 在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺。同时蛋白 质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。 有机溶剂沉淀蛋白质：在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇，蛋白质分子的水化膜被破坏而沉淀。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。 2）不可逆沉淀作用 一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构，尤其是空间结构破坏，因而失去其原来的性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。重金属盐，生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉定：重金属盐类Cu2+、Ag+、Pb2+和Hg2+等均能与蛋白质分子中的巯基等基团结合，生成不溶物而沉淀。生物碱试剂与蛋白质结合形成不溶物，使蛋白质沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。 2．试剂和器材 1）试剂 (1）蛋白质氯化钠溶液 取20ml 蛋清，加蒸馏水200ml 和饱和氯化钠溶液l00ml ，充