经典色谱法液相
经典液相色谱法
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
四、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量旳液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附旳水
✓ 流动相：与水不互溶旳有机溶剂（饱和正丁醇）
✓ 分离机制：同液-液分配色谱
✓ 定性参数：
Rf
1
1 K VS
原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离
L1 L2
✓ 讨论
• 参照物与被测组分在完全相同条件下展开 能够消除系统误差，大大提升重现性和可靠性；
• 参照物能够是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参照物性质及色谱条件有关，
范围能够不小于或不不小于1
（三）吸附剂旳选择 根据被测物极性和吸附剂旳吸附能力
图示
图示
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
设R’为单位时间内一个分子在展开剂中出现的几率
设1 R’为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率
定时展开保留比 R' uR L1 t L1 u0 L0 t L0
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
(R' 1)
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
合用：分析酸性或中性物质
续前
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
经典液相色谱法平面色谱分析
18.6 纸色谱法
18.6.1 纸色谱法的分离原理 paper chromatography
～是以纸为载体的色谱法，分离原理
属于分配色谱的范畴。
固定相：纸纤维上吸附的水分。(或甲酰胺、 缓冲液等滤纸可以吸留的物质。) 流动相：不与水相混溶的有机溶剂。或可与 水混溶的溶剂。
l2、l1分别为原点至两斑点中 心的距离， d为两斑点中心间的距离 ，W1、W2为斑 点的宽度。
分离数 定义在相邻斑点分离度为1.177时，在
Rf 0和Rf 1两种组分斑点之间能容纳的 色谱斑点数。
SN l0 /b0 b1 1
其中，b0、b1为Rf 0和1时组分的半峰宽， 二者由外推法获得。
c.点样方法 吸取一定量的样液，轻轻接触于薄层的
点样线上，点样线一般距薄层底边 1.5~2cm， 点间距约0.8~1.5cm(新药典规定为1.5~2.0 cm)。点样后形成的原点面积越小越好，一 般原点直径不超过2~4mm为宜。
展开和展开剂的流速
展开
先预饱和。展开前，将薄层板置于盛有展 开剂的色谱缸内饱和15～30min,此时薄板不与 展开剂直接接触，当色谱缸内展开剂蒸汽、薄 层与缸内大气达到动态平衡时，即饱和时，再 将薄层板浸入展开剂中，称预饱和。
常用展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、 酚等，即含水的有机溶剂。
为了防止弱酸、弱碱的离解，加入少量 的酸或碱。如甲酸、醋酸、吡啶等。
纸色谱的操作步骤有点样、展开、显色、 定性定量分析几个步骤。
复习题
1、在硅胶薄层板A上，以苯－甲苯（1:3）为 展开剂，某物质的Rf值为0.50，在硅胶板B 上，用相同的展开剂，此物质的Rf值为0.40， 问哪块板的活度大？
液相色谱法
液相色谱法
液相色谱法（liquid chromatography，LC）是一种色谱技术，用于分离
和分析溶液中混合物的化学成分，以确定是否存在或不存在特定成分，如果存在，则存在多少。
我们中的许多人会从上学开始就熟悉平面LC的形式，在滤纸上打上黑色墨水标记，将一端浸入水中，然后观察墨水中的成分颜色是否分开。
但是，分析应用中使用的大多数LC均基于柱色谱法，这将是本文的重点。
顾名思义，高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是使用高色谱分辨率进行高效分离的高性能分析。
分离的组分也可以在检测后使用馏分收集器分离，作为纯化的手段。
HPLC有多种不同的配置，可用于分离分子量从半挥发性小分子到几万千道尔顿的大蛋白生物分子的溶解组分。
液相色谱法是一种非常流行的分析技术，广泛用于环境监控，农业，医药领域。
液相色谱法的优缺点
LC通常用于各种应用。
但是，它不适用于挥发性化合物的分离和分析。
仅当所有要分离的组分的蒸气压低于流动相的蒸气压时，才能实现可靠的分析型液相色谱方法。
气相色谱法更适合分析挥发性化合物。
提供各种不同的色谱柱和溶剂，可提供广泛的选择性，从而可以分离极性范围很广的组分。
大分子和小分子同样适用于该技术。
在相对较低的温度下进行有效分离的能力也使LC成为可在气相色谱仪中分解的热不稳定化合物的理想分离技术。
经典液相色谱法练习题（附答案）
经典液相色谱法练习题（附答案）填空题1．硅胶具有微酸性，适用于分离____酸性或中性______物质的分离。
2．以聚酰胺为吸附剂时，通常用__极性溶剂_______作流动相。
3．在一定范围内离子交换树脂的交联度越大，则交换容量_小__，组分的保留时间__短__。
4．吸附剂的含水量越高，则吸附性能越__弱__。
选择题1．以硅胶为吸附剂的柱色谱分离极性较弱的物质时，宜选用（B ）A．极性较强的流动相B．活性较高的吸附剂和极性较弱的流动相C．活性较低的吸附剂和极性较弱的流动相D．活性较高的吸附剂和极性较高的流动相2．离子交换树脂的交联度越大则（B）A．形成网状结构紧密、网眼大、选择性好B．形成网状结构紧密、网眼小、选择性好C．交换容量越小D．组分保留时间越短3．样品中各组分的流出柱的顺序与流动相性质无关的是（D）A．离子交换色谱B．聚酰胺色谱C．吸附色谱D．凝胶色谱4．在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间t R，将如何变化（B）A．k与t R增大B．k与t R减小C．k增大，t R减小D．t R增大，k减小5．色谱用氧化铝（A）A．活性的强弱用活度级I~V表示，活度V级吸附力最弱B．活性的强弱用活度级I~V表示，活度V级吸附力最强C．中性氧化铝适于分离非极性物质D．活性与含水量无关6．液相色谱中，固定相极性大于流动相极性属于（B）A．键合相色谱B．正相色谱C．反相色谱D．离子交换色谱7．凝胶色谱中，分子量较大的组分比分子量较小的组分（A）A．先流出色谱柱B．后流出色谱柱C．几乎同时流出D．在色谱柱一样8．色谱所用的氧化铝（C）A．有碱性和酸性二种，其中碱性使用最多B．有碱性和酸性二种，其中酸性使用最多C．有碱性、中性和酸性三种，而中性氧化铝使用最多D．有碱性、中性和酸性三种，而碱性氧化铝使用最多E．有碱性、中性和酸性三种，而酸性氧化铝使用最多简答题1．用硅胶柱色谱分离极性较强的物质时，吸附剂与流动相的选择原则是什么？为什么？答：选择弱吸附剂，与极性强的流动相原因：略2．根据分离机制不同将液相柱色谱法分类。
液相色谱法和高效液相色谱法
溶剂等级
➢ 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，放置 时间越短，水质越高。
➢ 理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过 0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空 气等。
溶剂等级
有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯
都经过蒸馏和0.45µm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒） 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2µm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
《仪器分析》
液相色谱法
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
For Short：HPLC
色谱基础知识
主要内容
液相色谱法基础知识 液相色谱仪的主要部件
液相色谱仪的维护
色谱基础知识
色谱起源
1903年俄国植物学家 M. S. Tswett 提出经典液相色谱
C18柱的使用注意点
柱压应低于柱子的承受压力 柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 缓冲液pH使用范围为2～7
硅胶在PH为3～4时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。
检测器 进样器
储液瓶 高压输液系统
输液泵
数据处理系统
柱温箱
常用检测器
紫外检测器（UV） 二极管阵列检测器（PDA） 荧光检测器（FL） 示差折光检测器 蒸发光散射检测器
溶剂等级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
溶剂等级
缓冲盐的使用：
使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨
损及阻塞：首先用纯水冲洗10-30min，再用甲醇冲 洗30min(0.5-1ml/min)
经典液相色谱法2
吸附剂粒径对展开速度、Rf 值和分离效果的影响： • 颗粒大，则总表面积小，吸附量低，展开速度快，展 开后斑点较宽，分离效果差。 • 颗粒太小，则展开速度太慢，而且不易用干法铺板。 因此，应该选用颗粒大小适宜的吸附剂，而且其 粒度分布要窄。 吸附剂颗粒大小表示方法： • 颗粒直径(以µm表示)， • 筛子单位面积的孔数(以目表示) 干法铺板所用吸附剂颗粒直径一般在75～100µm 或150～200目较为合适，而湿法铺板则用更细的颗粒， 为10～40µm或250～300目。聚酰胺则一般在100～180 目范围内。高效薄层板的颗粒直径为5～10µm。
在薄层色谱使用的一般条件下，固定相、流动 相都不很明确，它们都与蒸汽相一起维持着一种变化 的状态，在分离过程中这三相都可能不断在变化。 • 在使用混合溶剂时，在展开过程中极性较弱、沸点 较低的溶剂在薄层板边缘容易挥发，致使边缘部分的 展开剂中极性溶剂的比例增大，使Rf值相对变大。同 一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的 Rf值小，这种现象称为边缘效应。
2. 软板的制备：直接铺制吸附剂。 3. 粘合薄层板(硬板)的铺制 (1)粘合剂：粘合剂的种类与用量会影响分离的效果，常用 的有煅石膏、羧甲基纤维素钠(CMC−Na) 和某些聚合物 如聚丙烯酸等。参看《分析化学实验》。 (2)倾注法制板：1. 在玻板上倾倒吸附剂糊，2. 用洁净玻棒 涂铺均匀，3. 稍加振动。 (3)平铺法制板：在水平台面上先放置玻璃平板，上面放置 载板，二边加上玻璃条做成的框边(框边高于载板0.25～ lmm)，将吸附剂糊倒在载板上，刮平并振动均匀。 上述两法所铺薄层板只适宜于一般定性分离，不宜 于定量分离。
2．相对比移值 (Rr) 由于影响 Rf 值的因素很多，要在不同实验室、不 同实验者间严格控制色谱条件的一致性，达到 Rf 的可 比性很困难。因此建议采用相对比移值(relative Rf ；Rr) 作为定性参数： Rr = Rf (a)／Rf (s) =la／ls (19·2)
常见的几种色谱分析方法
由于环境分析的对象广泛、内容多样、样品易变、一般含量极微且分析要求十分严格，所以分析化学中各种先进的方法和技术，在环境分析中都得到了广泛的应用。
但从环境分析的实际应用来看，下面一些方法是更为常用的。
1、化学分析法这是一种以化学反应为基础的分析方法。
它的特点是具有很高的准确度，但灵敏度较低，因此只适于分析环境样品中的常量组分。
目前在测定化学耗氧量、生物耗氧量、溶解氧等例行监测项目中，仍很重要。
2、色谱分析法色谱分析法是一种重要的分离、分析技术，它是将待分析样品的各种组分一一加以分离，然后依次鉴定或测定各个组分。
色谱分析法按所用流动相的不同，主要分为气相色谱法与液相色谱法（包括离子色谱法）。
在环境分析中，他们承担着不多数有机污染物的分析任务，也是对未知污染物作结构分析和形态分析的强而有力的工具。
气相色谱法直到今天仍然是分析环境有机污染物的主要方法，它也是美国环保局于1979年底公布的水中114中污染物分析方法的基础。
但它仅适于分析易挥发性组分，对于70%以上低挥发性、大分子量、热不稳定或离子型化合物，如果不进行适当的衍生化就不能直接测定。
在这方面，液相色谱法恰好可以弥补其不液相色谱法的流动相是液体，它的粘度和密度都比气体大得多，为了使流动相有较快的流速，必须使用高压泵来加速流动相的输送，所以通常又将这类液相色谱法称为高效液相色谱法。
它对于相对分子质量为300-2000的化合物、热不稳定化合物或离子型化合物都能进行分析，因此它的分析对象范围要宽得多。
用它进行环境样品的常规分析，完成一次测定仪需一分钟，其柱后检测器的灵敏度可达皮克级，因此是目前迅速发展的一个领域。
色层分析法是一种经典的分离、分析方法，包括柱层析法和纸层析法，以及在两者基础上发展起来的薄层层析法，它们在环境分析中都有应用，而尤以后者应用更多。
光学分析法包括许多具体的分析方法，它们都是建立在物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用的基础之上。
《液相色谱法》PPT课件
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪
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常用：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔树脂
经典色谱法液相
7
1. 硅胶（SiO2·H2O）中等极性吸附剂
吸附机制： 表面的硅醇基，与物质形成氢键 失活：水与硅醇基结合使其失去活性 活化：105-110℃加热30min
适用范围：微酸性（pH=4~5），
适于酸性和中性物质 粒度：100-200目
经典色谱法液相
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三、固定液、流动相及其选择
分类：正相分配色谱和反相分配色谱
正相分配色谱：固定液极性大于流动相 固定液：水、各种缓冲溶液、甲醇等强极性物质 流动相：石油醚、三氯甲烷等低极性物质 适合分离的物质：极性物质 各种极性物质流出顺序：t非极性< t中极性< t强极性
经典色谱法液相
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反相分配色谱：固定液极性小于流动相 固定液：硅油、液状石蜡等极性小物质 流动相：水、与水相混溶的有机溶液 适于分离物质：中等极性至非极性物质 各种极性物质流出顺序：t极性< t中极性< t非极性
适用对象：皂苷类、黄酮苷类化合物
粒度：20~60目
经典色谱法液相
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（三）色谱条件的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质
1. 被测组分性质（极性大小）： 烷烃＜烯烃＜醚<硝基化合物<二甲胺＜酯 ＜酮＜醛<胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸
经典色谱法液相
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2. 吸附剂的选择： 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑ 强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
酸性成分：硅胶
碱性成分：氧化铝
黄酮类：聚酰胺
3、流动相的选择
“相似相溶”原则 ：分离极性大的物质应选 用极性大的溶剂作流动相，分离极性小的物 质应选用极性小的溶剂作流动相
流动相极性顺序：
石油醚< 环已烷<苯<甲苯<乙醚<三氯甲
烷<乙酸乙酯<丙酮<正丁醇<乙醇<甲
醇<水
常用：混合溶剂
如：不同配比的甲经醇典色-谱水法液或相 甲醇
CH 2
N
n
H
商品名：锦纶、尼龙-6
不溶于水和有机溶剂，易溶于浓无机酸
分离机制：主要是氢键吸附 适用对象：黄酮类、鞣质、醌
氢键能力↑强 组分越后出柱
粒度：20~200目
经典色谱法液相
11
4、大孔树脂
是一种具有大孔网状结构的高分子吸附剂。 不溶于酸、碱及有机溶剂
分类：非极性和中等极性
特点：在水中吸附力较强，在有机溶 剂中吸附力较弱
经典色谱法液相
9
硅胶、氧化铝的含水量与活性关系
硅胶含水量% 0 5 15 25 38
活度级 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
氧化铝含水量% 0 3 6 10 15
结论：含水量越低，活度级别越小， 吸附力越强。
活度测定法：Brock经m典a色m谱n法法液相
10
3、聚酰胺
[ ] O
CH 2
CH 2
C
CH 2
CH 2
经典色谱法液相
21
选择原则： 固定液与流动相的选择，要根据 被分离物中各组分在两相中的溶解度之比 即分配系数而定。可先使用对各组分溶解 度大的溶剂为洗脱剂，再根据分离情况改 变洗脱剂的组成，即在流动相中加入一些 可调节溶解度的溶剂．以改变各组分被分 离的情况与洗脱速率。
经典色谱法液相
22
四、操作方法
Cm Cm Cm
LL L
tt
t
5
当吸附等温线是线性时,流出曲线是对称 的,当吸附等温线是凸型或凹型时，流出 曲线形成拖尾峰或前延峰，克服方法： 减少进样量或样品浓度，利用等温线的 直线部分，防止超载。
经典色谱法液相
6
（二）、吸附剂
对吸附剂的要求：
（1）具有较大的表面积和一定的吸附能力
（2）颗粒要有一定的细度(d=75-150μm， 即 100-200目)，且粒度均匀
第10章 经典液相色谱法
液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。
▪ 经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀
下输送流动相
柱效较低
分析周期长
▪ 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀
下输送流动相
柱效较高
分析周期短经典色谱法液相
1
第1节 液-固吸附柱色谱(LSC)
（一）分离原理 （二）常用吸附剂 （三）色谱条件的选择
2、上样 3、洗脱
4、检视
经典色谱法液相
17
第2节 液-液分配柱色谱法（LLC）
一、基本原理 原理：利用不同组分在固定相中溶解度不 同，而进行分离 过程：
经典色谱法液相
18
二、载体 作用：支撑与分散固定液的作用 要求： 1）化学惰性，不易与其它物质发生反应 2）对被分离组分没有吸附能力 3）能吸留较大量的固定相液体 氧化铝：吸附力较强
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 如：生物碱
中性氧化铝 pH 7.5 适于分析酸性、碱性和中性物 质 如：生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸碱中不 稳定的苷类、酯、内酯等化合物
酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质 如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物质
15
4. 三者关系：
组分 吸附剂 极性大 活性小 非(弱)极性 活性大
流动相 极性
非极性或弱极性
经典色谱法液相
16
（四）、操作方法
1、色谱柱的制备 要求：填装均匀、紧密，不能有气泡。 装柱时柱要垂直，表面平整。 固定相的用量适宜。
柱体：色谱柱 固定相：颗粒大小100-200目，用量 方法：干法装柱、湿法装柱
(四) 操作方法
经典色谱法液相
2
（一）分离原理
1.吸附与吸附平衡
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心， 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附 能力差异而实现分离，吸附能力大小用吸附平衡常数 K表示
经典色谱法液相
3
2.吸附等温线：一定温度下，某一组分固 定相和流动相之间达到平衡时，以Cs为 纵坐标，Cm为横坐标得到的曲线。
类型：线性、凸形、凹形等温线
经典色谱法液相
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CS CS
CS
A
B
A
CS
B
CS
CS
CS
A
B
CCm S
Cm
C CS
Cm Cm
Cm
吸附等温Cm 线
C C
C
CC C
tR tR tR
C C
C C
色谱C柱内溶液浓度的C 分布
LL
LL
L
CC
CC L
C
C
tt
t
t tR
tRtR
流出经曲典色线谱法t液相 tR
ttRR
C C
1.固定液的涂布与装柱： 装柱前，首先将 固定液与载体混合均匀
2.加样与洗脱：
加样方法：①试样配成浓溶液 ；② 试样溶液用
少量固定相吸附，待溶剂挥干后，加入柱内；
③用一块比色谱柱内径略小的圆形滤纸吸附试样
溶液，待溶剂挥发后，加入柱内