多糖分离及结构研究样本
多糖分离及结构研究
多糖分离及结构研究多糖是由许多单糖分子通过化学键连接形成的高分子物质，广泛存在于自然界中的生物体内。
多糖具有多样的结构和功能，对于生物体的生理功能和生化代谢具有重要的影响。
因此，多糖的分离和结构研究对于深入理解生物过程、开发新药和生物材料具有重要意义。
多糖的分离通常是通过分子量、电荷、溶解性等物理化学性质的差异实现的。
常用的分离方法包括凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析和透析等。
凝胶过滤是利用凝胶的孔隙大小选择性地分离不同分子量的多糖。
离子交换层析则是利用多糖的带电性质在离子交换树脂上的吸附与洗脱来实现多糖的分离。
亲和层析则是利用与多糖特异性结合的亲和剂（如抗体或特定受体）将目标多糖与其他组分分离开来。
透析是利用不同多糖的溶解性差异在溶液中通过半透膜实现的分离。
多糖的结构研究包括分析其分子量、构象和聚合度等方面的信息。
分子量可以通过凝胶电泳、液相色谱和质谱等方法测定。
其中，凝胶电泳是一种常用的分离方法，可以根据多糖迁移速度与分子量之间的关系推断多糖的分子量大小。
液相色谱、尤其是凝胶过滤色谱，可以直接测定多糖的相对分子量。
多糖的构象研究是指多糖分子空间结构的表征和描述。
常用的方法包括核磁共振（NMR）谱学、X射线晶体学、圆二色光谱（CD）和傅立叶变换红外光谱等。
NMR和X射线晶体学可以提供多糖的高分辨晶体结构和原子间距信息。
CD可以用来研究多糖的二级结构，即螺旋、折叠或无规则结构的比例和类型。
傅立叶变换红外光谱可以提供多糖的官能团和键合结构的信息。
多糖的聚合度主要是指多糖分子链上单糖残基的个数。
常用的分析方法包括限酶切分析、酶解分析和色谱法等。
限酶切分析是通过使用特定的内切限制性酶将多糖切割成特定的片段，然后通过凝胶电泳或质谱分析来确定多糖的聚合度。
酶解分析是将多糖经过酶解反应，然后通过色谱法或电泳法等进行分析。
色谱法包括凝胶过滤色谱、凝胶渗透色谱等。
总之，多糖的分离和结构研究在生物过程、药物开发和生物材料领域具有重要的应用价值。
鸡腿菇多糖的分离纯化与结构的初步研究
（ 上海化学试剂 总厂 ，Ａ ）；考 马氏亮 蓝 （ Ｒ 上海化 学
★ 建 省 “ 本 科 研 专 项 ” 资 助 项 目 （ ０９ ０ ０— ）。 福 基 ２０ Ｒ１０２ ４ 收 稿 日期 ：２ １ — １ ２ ００ １ — ３
作者简介：倪沁颜 （ ９ ７ １７ 一）， 分析化学硕 士 ，工程师 ，主要从 事食 品及检测方法的研 究。
合 ，而 对 正常 的 细 胞 没 有副 作 用 。
试剂有限公司，Ａ ）；其余试剂均为化学纯 ，市售 。 Ｒ １２主要仪器和设备 ． 旋转蒸 发仪Ｎ １ ０ 型 （ 一００ 东京理化 公司 ）； 自动液
相色谱 分离层析仪Ｍ ９ — 型 （ Ｃ ９ ３ 上海 沪西分 析仪器厂） ；
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多糖的分离纯化及分析
多糖的分离纯化及分析(总3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--多糖的分离纯化及分析一、多糖的提取方法（一）溶剂提取法1、水提法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高.2、酸碱提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。
有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。
与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。
3、超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术.（二）生物酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。
此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。
（三）超声提取法超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。
超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。
（四）微波提取微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。
拐枣多糖的分离纯化和结构解析及其降血糖活性研究
拐枣多糖的分离纯化和结构解析及其降血糖活性研究拐枣是一种在中国南方地区常见的鸭脚木科植物，其叶、根、枝和果实均可入药。
其中，拐枣果实中富含多种物质，包括多糖、皂苷和黄酮等活性成分。
其中，拐枣多糖是一种重要的天然多糖，在降低血糖、增强免疫力等方面具有广泛的应用价值。
因此，为了深入研究拐枣多糖的活性成分和机制，本文就拐枣多糖的分离纯化和结构解析及其降血糖活性进行了研究，并取得了一定的探索性成果。
一、拐枣多糖的提取纯化1、拐枣多糖的提取采用对应重量的鲜拐枣果实，经过加水搅拌煮沸，滤液去渣后，用20倍的乙醇沉淀，得到拐枣多糖。
2、拐枣多糖的纯化采用DEAE色谱柱层析纯化拐枣多糖，以50mmol/L的NaCl梯度洗脱，通过测定糖含量，检查各组分的释放，然后进一步纯化，使用size exclusion chromatography和紫外吸收光谱检测纯化程度。
二、拐枣多糖的结构解析1、拐枣多糖的分子量用羟基苯甲酸钠比色法测定拐枣多糖的分子量，结果显示，拐枣多糖的分子量为2.67×10^4 Da。
2、拐枣多糖的组成采用HPLC法对拐枣多糖的组成进行分析，结果表明拐枣多糖为一种多糖混合物，含有葡萄糖、半乳糖等多个单糖组成。
3、拐枣多糖的结构采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-ESI-MS）对拐枣多糖结构进行分析，结果显示，拐枣多糖主要为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖等单糖组成的异构体多糖。
同时，糖链还包含了一些分支链。
三、拐枣多糖的降血糖活性研究1、拐枣多糖的胰岛素敏感性实验采用体外细胞实验，将L6小鼠肌肉细胞培养1至2天，然后分相（顶层浮液做悬浮液，底层沉淀做悬浸液），先用100nmoL的胰岛素处理半小时，再加入不同浓度的拐枣多糖悬浸液，最后比较各处理组的胰岛素结合活性。
结果表明，拐枣多糖可以显著提高L6小鼠肌肉细胞的胰岛素结合活性，表现出明显的胰岛素敏感性。
2、拐枣多糖的血糖调节实验将10只SD大鼠随机分为两组，一个为对照组，一个为处理组，对照组给予1ml生理盐水，处理组给予口服1g/kg的拐枣多糖，连续7天，每天1次。
多糖分离及结构研究样本
多糖分离纯化基本原则和办法多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成，其性质已大不同于单糖，如甜味和强还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物细胞壁中，是构成生命四大基本物质之一，与生命功能维持密切有关。
近年来，大量研究表白多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用生物学效应外，尚有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。
1、基本原则在不破坏多糖活性前提下进行多糖分离纯化。
尽量不引入新杂质，或引入新杂质易于除去，如小分子盐类可通过透析作用除去，铵根离子可通过加热挥发除去等[1]。
2、分离纯化办法多糖生物活性倍受关注，但不少多糖提取办法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面考虑，各种办法开发、比较、分析是研究工作焦点之一。
当前多糖提取办法重要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。
一方面要依照多糖存在形式及提取部位不同，决定在提取之前与否做预解决：提取时需注意对某些含脂较高根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高根、茎、叶、果实类，需进行脱色解决。
2.1多糖提取与分离办法由于各类多糖性质及来源不同，因此提取办法也各有所异，重要归纳为如下几类：第一类难溶于水，可溶于稀碱液重要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。
原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等环节，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。
第二类易溶于温水，难溶于冷水多糖，可用70~80℃热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。
第三类粘多糖提取。
在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取时需设法破坏粘多糖与蛋白质之间结合键。
普通使用蛋白酶水解蛋白某些或碱解决，使粘多糖与蛋白质之间结合键断裂，以增进粘多糖释放以便于提取[3]。
提取多糖的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握多糖提取的原理和操作流程；2. 了解不同提取方法对多糖提取率的影响；3. 学习多糖的鉴定方法；4. 熟悉实验仪器的使用。
二、实验原理多糖是一类高分子碳水化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。
多糖具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、免疫调节等。
多糖的提取方法主要有热水提取法、酸提取法、碱提取法等。
本实验采用热水提取法提取多糖，并利用苯酚-硫酸法对提取的多糖进行鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：干燥的植物原料（如香菇、大枣、紫菜等）；2. 实验试剂：蒸馏水、NaOH、HCl、苯酚、硫酸、乙醇、DPPH、卡拉菲指示剂等；3. 实验仪器：组织匀浆机、水浴锅、台式高速离心机、分光光度计、容量瓶、移液管、烧杯、漏斗等。
四、实验步骤1. 多糖提取（1）将干燥的植物原料粉碎，过筛，取适量粉末；（2）将粉末加入一定量的蒸馏水中，加热至80℃，保持2小时；（3）冷却后，过滤得到滤液；（4）将滤液加入适量的乙醇，静置过夜，离心，收集沉淀；（5）将沉淀用95%乙醇洗涤，干燥，得到多糖粗品。
2. 多糖鉴定（1）苯酚-硫酸法鉴定①取一定量的多糖粗品，加入苯酚溶液，振荡均匀；②加入硫酸溶液，观察溶液颜色的变化；③与标准溶液进行比较，确定多糖的存在。
（2）DPPH自由基清除法①配制一定浓度的DPPH溶液；②取一定量的多糖粗品，加入DPPH溶液，振荡均匀；③在一定时间后，测定溶液的吸光度；④计算DPPH自由基清除率，评估多糖的抗氧化活性。
五、实验结果与分析1. 多糖提取实验结果表明，热水提取法能够有效地提取植物原料中的多糖，提取率较高。
2. 多糖鉴定（1）苯酚-硫酸法鉴定实验结果显示，多糖粗品与苯酚-硫酸溶液反应后，溶液颜色变为深棕色，说明多糖的存在。
（2）DPPH自由基清除法实验结果显示，多糖粗品对DPPH自由基具有清除作用，清除率随着多糖浓度的增加而增加，表明多糖具有一定的抗氧化活性。
六、实验结论1. 热水提取法能够有效地提取植物原料中的多糖，提取率较高；2. 多糖具有抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂；3. 本实验为多糖的提取和鉴定提供了一种简单、实用的方法。
红参多糖的分离纯化及结构分析
红参多糖的分离纯化及结构分析红参是白参经过蒸煮加工的产品,是我国传统的名贵中药材,具有多种药效,如抗肿瘤、抗氧化等。
其有效成分主要是皂苷和多糖。
对红参多糖的研究报道不多,特别是对红参多糖的结构以及构效关系研究更少。
为了更深入了解红参多糖的组成和结构,我们设计了本课题的研究内容,具体研究结果如下:本论文利用吉林省集安益盛药业有限股份公司提供的红参多糖为实验原料,采用60%乙醇沉淀纯化,获得精制后的红参多糖WRGP。
WRGP的总糖含量为80.1%,糖醛酸含量为23.9%,蛋白含量为2.2%,盐分含量为12.4%。
单糖组成分析结果表明,WRGP主要由Glc（53.8%）和GalA（27.9%）组成,同时含有少量的Gal（9.5%）、Ara（5.4%）、Rha（1.6%）和Man（0.7%）。
利用DEAE-Cellulose离子交换层析对WRGP进行分级,蒸馏水洗脱得到中性糖级分WRGPN,0.5 M NaCl洗脱得到酸性糖级分WRGPA。
将WRGPA再次用DEAE-Cellulose离子交换层析进行分级,依次使用0、0.1、0.2、0.3、0.5 M NaCl 进行洗脱得到五个级分WRGPA-N、WRGPA-1、WRGPA-2、WRGPA-3和WRGPA-4。
根据分子量分布情况,利用凝胶层析分别对WRGPA-1<sup>W</sup>RGPA-4进一步分级纯化得到WRGPA-1a、WRGPA-2a、WRGPA-2b、WRGPA-3b、WRGPA-3c、WRGPA-4b和WRGPA-4c七个均一级分。
单糖组成、果胶酶酶解、甲基化、FT-IR 以及<sup>13</sup>C NMR分析表明,WRGPA-1a和WRGPA-2a均以RG-I型果胶为主,侧链连有AG-I结构;WRGPA-2b、WRGPA-3b、WRGPA-3c、WRGPA-4b和WRGPA-4c主要由GalA构成,GalA含量56.9%<sup>7</sup>7.3%,以α-1,4-GalA构成主链,部分GalA的C-6位羧基被甲酯化,是典型的HG型果胶,少量的RG-I结构与HG的主链相连。
《锁阳多糖提取纯化、结构解析及生物活性研究》范文
《锁阳多糖提取纯化、结构解析及生物活性研究》篇一一、引言近年来，天然药物研究已经成为全球药物研究的热点之一。
锁阳，作为中医药领域一种常见的传统草药，因其独特的药用价值受到了广泛的关注。
其含有多种有效成分，如多糖、生物碱等，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等多种生物活性。
本文以锁阳多糖为研究对象，进行其提取纯化、结构解析及生物活性的研究。
二、材料与方法（一）材料1. 锁阳原料2. 实验仪器3. 试剂及耗材（二）方法1. 锁阳多糖的提取2. 锁阳多糖的纯化3. 锁阳多糖的结构解析4. 生物活性实验三、实验结果（一）锁阳多糖的提取与纯化通过优化提取条件，我们成功地从锁阳中提取出多糖。
经过一系列的纯化步骤，包括去蛋白、脱色、透析等，得到了较为纯净的锁阳多糖。
通过紫外-可见光谱、红外光谱等手段对提取的锁阳多糖进行初步的定性分析，发现其具有多糖的特征吸收峰。
（二）锁阳多糖的结构解析利用现代分析技术，如核磁共振（NMR）、质谱（MS）等手段，对锁阳多糖的结构进行了解析。
结果表明，锁阳多糖主要由葡萄糖、甘露糖等单糖组成，具有特定的糖苷键连接方式。
通过比对文献报道，我们推测出锁阳多糖可能的结构模型。
（三）生物活性研究1. 抗氧化活性：通过DPPH自由基清除实验、ABTS自由基清除实验等手段，发现锁阳多糖具有较好的抗氧化活性。
2. 抗肿瘤活性：通过细胞实验，发现锁阳多糖对癌细胞具有一定的抑制作用，且对正常细胞无明显的毒性作用。
3. 提高免疫力：通过动物实验，发现锁阳多糖能够显著提高机体的免疫力。
四、讨论通过对锁阳多糖的提取纯化、结构解析及生物活性的研究，我们得出以下结论：1. 通过优化提取条件，成功地从锁阳中提取出多糖，并经过纯化得到较为纯净的锁阳多糖。
2. 通过现代分析技术，解析了锁阳多糖的结构，发现其由葡萄糖、甘露糖等单糖组成，具有特定的糖苷键连接方式。
3. 锁阳多糖具有较好的抗氧化、抗肿瘤和提高免疫力的生物活性，为进一步开发利用锁阳提供了理论依据。
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多糖分离纯化的基本原则和方法多聚糖(polysaccharide), 简称多糖, 常由一百个以上甚至几千个单糖基经过糖苷键连接而成的, 其性质已大不同于单糖, 如甜味和强的还原性已经消失, 广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中, 是构成生命的四大基本物质之一, 与生命功能的维持密切相关。
近年来, 大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外, 还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。
1、基本原则在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。
尽量不引入新的杂质, 或引入的新杂质易于除去, 如小分子盐类可经过透析作用除去, 铵根离子可经过加热挥发除去等[1]。
2、分离纯化方法多糖的生物活性倍受关注, 但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟, 基于效率、成本多方面的考虑, 各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。
当前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。
首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同, 决定在提取之前是否做预处理: 提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类, 在用水提取前, 应先加入甲醇或l: l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂, 而对含色素较高的根、茎、叶、果实类, 需进行脱色处理。
2.1多糖的提取与分离方法由于各类多糖的性质及来源不同, 因此提取方法也各有所异, 主要归纳为以下几类:第一类难溶于水, 可溶于稀碱液的主要是胶类, 如木聚糖及半乳糖等。
原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取, 提取液经中和及浓缩等步骤, 最后加入乙醇, 即得粗糖沉淀物。
第二类易溶于温水, 难溶于冷水的多糖, 可用70~80℃热水提取,提取液用氯仿: 正丁醇( 4:1) 混合除去蛋白质, 经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。
第三类粘多糖的提取。
在组织中, 粘多糖与蛋白质以共价键结合, 故提取时需设法破坏粘多糖与蛋白质之间的结合键。
一般使用蛋白酶水解蛋白部分或碱处理, 使粘多糖与蛋白质之间的结合键断裂, 以促进粘多糖的释放以便于提取[3]。
( 1) 碱液提取法: 本法的主要依据是蛋白聚糖的糖肽键对碱不稳定。
原料经预处理后用0.5mol/L NaOH溶液4℃提取, 提取液用酸中和。
蛋白质可用调pH、加热、或用白陶土吸附法除去。
最后以乙醇沉淀即可获得成品。
从软骨中提取软骨素即用此法。
( 2) 蛋白水解酶消化法: 从组织中释放出粘多糖的方法, 经常使用的是蛋白水解酶进行消化。
一般应用专一性低的蛋白酶如木瓜蛋白酶及链霉素以进行广泛的蛋白质水解。
经酶消化后的提取液中主要还有低分子量得蛋白消化产物及残存蛋白等杂质。
蛋白质可用5%三氯醋酸沉淀去除, 小分子的杂质可用透析法去除。
最后加入乙醇可得粘多糖沉淀。
2.2多糖的除杂质蛋白质的去除, 经过水提所获得的粗多糖常含有较多的蛋白质。
采用醇沉或其它溶剂沉淀得到的粗多糖中常含有较多的蛋白质, 需要除蛋白。
除蛋白的方法传统上有sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。
三氯乙酸法去除蛋白率高, 但多糖在三氯乙酸中不稳定, 糖苷键易断裂, 故多糖损失率也较高。
鞣酸法蛋白去除率较低, 可是此种方法是利用鞣酸与蛋白质的特异性反应, 不会造成多糖的损失。
Sevag 法蛋白去除率最高,可是由于此法使用的试剂是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物质,容易造成多糖活性下降和溶剂残留。
另外, 有机溶剂与去蛋白酶结合的除蛋白法也常被用在实验研究中, 其效率更高, 更加节省试剂和资金。
为了避免使用有机溶剂可采用重复冻融的方法除蛋白。
色素的去除, 植物多糖提取物中含有酚类化合物,在多糖提取过程中由于氧化作用会有色素生成, 色素的存在会影响多糖的色谱分析和性质测定。
常见的脱色方法有: 吸附法(DE．AE纤维素、硅藻土、活性炭等)、氧化法(过氧化氢)、离子交换法。
除小分子杂质, 小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性, 需要进一步脱除, 提高纯度。
传统的方法是透析法, 该法操作简单、技术成熟, 但周期长, 往往需要2 d-3 d, 常温下操作有可能造成多糖的霉变, 必要时需加入少量防腐剂或需在低温条件下进行。
随着膜分离技术的发展, 纤维滤器透析法已经发展起来了, 它利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级, 这种方式可缩短生产周期, 而且条件温和, 无疑是多糖脱除杂质的一条新途径。
2.3多糖的纯化方法多糖的纯化方法很多, 须根据条件适当选择。
必要时可使用多种方法以达到理想的分离结果 1.分级沉淀法用乙醇进行分级分离是分离多糖混合物的经典方法, 并且适用于大规模分离。
该法往往需要多次重复进行才能达到较好的效果。
如从肝素生产废弃物中分离纯化硫酸皮肤素[4]。
分级沉淀有机试剂的筛选有机试剂沉淀法作为纯化生物大分子物质的一种经典方法, 选择有机溶剂时应能和水混溶, 使用较多的有机溶剂如乙醇、丙醇、丙酮等, 为避免生物活性大分子变性失活, 沉淀应在低温下进行。
分别选取乙醇、丙醇和丙酮作为沉淀剂, 取预处理后的样品按固液比1∶10 溶解于去离子水中, 加入0.1V 体积的沉淀剂, 摇匀20min, 4℃密封静置24h。
离心1 r /min, 20min, 4 ℃, 取出沉淀并用20mL 去离子水冲洗、冻干。
再向上清液中加入0.1V 原溶液体积的沉淀剂, 重复上述操作, 直至加入沉淀剂时连续 5 次无沉淀产生。
取各次沉淀溶解后进行醋酸纤维素薄膜电泳检测。
2.季铵盐络合法粘多糖的聚阴离子与某些表面活性物质, 如十六烷基三甲基溴化铵中的季铵基阳离子结合生成季铵络合物。
这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解。
当离子强度增大时, 这些络合物能够解离并溶解。
本法的优点是既适用于实验室又适用于生产。
季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂, 可与酸性糖形成不溶性沉淀, 常见于酸性多糖的分离。
当溶液的pH值增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高, 也会与中性多糖形成沉淀。
常见的季铵溴化物(cetyltri．methyl ammonium bmmide, cTAB)及其氢氧化物(cetyl t methyl amm0nium hydr(Jxiode, CTA一0H)和(certylpyridium hydroxide, CP一0H), 其浓度一般为1％～10％ (W／V), 它们可在酸性、中性、微碱性和碱性中分级沉淀分离出酸性多糖。
3. 柱层析法3.1凝胶柱层析法: 常见的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose), 以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂, 使各种多糖得以分离纯化, 但不适宜粘多糖的分离。
3.2离子交换层析常见的交换剂为DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶(DEAE—Sephadex)、DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose), 此法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。
最常见的是DEAE-纤维素在pH为6时酸性多糖吸附于交换剂上, 中性多糖不吸附, 然后用逐步提高盐浓度的洗脱液进行洗脱进而达到分离。
它一方面可纯化多糖, 另一方面还可分离各种多糖。
如川芎多糖的分离纯化[5]: 纤维素柱水平衡后, 取200mg粗多糖样品溶解于蒸馏水中上样, 蒸馏水洗脱70ml后, 以0～3mol/l NaCl溶液梯度洗脱, 流速1.0ml/min, 每管收集2ml, 硫酸－苯酚法显色检测。
凝胶柱层析和离子交换层析往往在分离纯化过程中交替使用, 以达到更好的分离纯化效果。
如灰树花多糖GFP75-2-2B[6]的分离:4.超滤法采用中空纤维超滤膜, 对多糖去蛋白质后的提取液经过超滤去除小分子杂质5.色谱法色谱法是常见的纯化多糖的方法, 包括离子交换色谱和凝胶色谱, 色谱法是利用填料对不同种类的糖吸附作用的差异, 使混合物中各糖分达到彼此分离的方法。
逆流色谱( Countercurrent chromatography, CCC) 技术是一种无固体载体的连续液—液分配色谱技术, 其固定相经过重力场和离心力场作用被保留在分离柱内, 流动相与固定相在色谱仪内进行分配, 而达到物质的分离。
逆流色谱与传统色谱相比具有无死吸附、进样量大、分离纯度高等显著的优势, 在食品、生物化工、制药等领域具有广阔的应用前景。
在海带多糖[7]的分离纯化中使用了该技术。
用泵把固定相从进口注入HSCCC分离柱中, 待固定相充满后, 开动主机, 调节转速达到预定转速并稳定后, 用20ml固定相溶解0.15g精制多糖, 用恒流泵将样品溶液以一定流速注入HSCCC, 部分收集器收集。
分离完成后, 停止转动。
用气泵使HSCCC中的液体流出。
使用了逆流色谱分离多糖的双水相系统, 在PEG1000浓度为12%, KH2PO4浓度为8%, K2HPO4 浓度为8%, 转速在400r/min时, 能够使海带多糖达到很好的分离。
下图为逆流色谱仪示意图。
6.制备性区带电泳根据各种多糖的分子大小, 形状及其所带电荷的不同可用电泳法进行分离。
7.固定化凝集素的亲和层析法近年来根据凝集素能专一地、可逆地与游离的和复合糖中的单糖和寡糖结合的性质, 利用固定化凝集素亲和层析作为分离纯化糖蛋白的方法。
这一方法简单易行, 在温和条件下进行不破坏糖蛋白活性。
固定化的刀豆凝集素( concanavalin A, Con A) 是应用最普遍的固定化凝集素。
Con A能专一地与甘露糖基结合, 各种的酶如α-和β-半乳糖苷酶、过氧化氢酶、干扰素等都可用固定化Con A纯化。
8.膜分离法膜分离具有无相变及化学变化、可常温操作、选择性高与能耗低等优点。
如马尾藻多糖就采用了膜分离纯化技术。
海藻多糖是一类组成相当复杂的生物大分子, 使用膜分离技术对海藻多糖[8]进行分级可达到初步纯化的目的。
在压力0．5MPa, 温度20℃条件下, 将脱蛋白之后的提取液稀释至1 L, 先用孔径0．1 μm 的微滤膜过滤, 分成浓缩液和透过液, 将透过液依次用截留分子量为100、 50、 10、 3kD 的超滤膜进行超滤, 分别收集浓缩液和透过液。
近20 年来, 由于分子生物学的发展, 人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能, 快速高效、节省能源、简便易行的提取与纯化工艺对多糖的研究有重要意义。
多糖在自然界植物中广泛存在, 但由于其种类的多样性、结构组成的复杂性以及多糖分子量大、极性大等特点, 给植物多糖提取、分离带来很大困难, 要想获得较高的多糖提取率, 用单一的提取方法不一定能取得理想的效果, 将2种或者多种提取方法结合可能得较好的提取效果[9]。
在多糖的分离、纯化中常见分级沉淀法、纤维素柱色谱法和凝胶色谱法相结合的方法进行分离、纯化, 使多糖的分离、纯化能达到理想的效果。