重组水蛭素的聚乙二醇修饰
新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞化学结构
新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞化学结构新瑞白聚乙二醇（Ruxience）是一种重组人粒细胞刺激因子（G-CSF），是一种用于治疗中性粒细胞减少症的药物。
它是由聚乙二醇（PEG）修饰的重组人G-CSF蛋白所构成。
本文将详细介绍新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞的化学结构。
新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞是一种由基因工程技术制备的药物。
它的化学结构由多个组成部分构成。
首先是聚乙二醇（PEG）分子，它是一种高分子聚合物，由乙二醇分子通过醚键连接而成。
聚乙二醇的分子量可以根据需要进行调整，以达到所需的药物性质。
在新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞的结构中，PEG分子与重组人G-CSF蛋白通过共价键连接。
重组人G-CSF蛋白是由基因工程技术将人类G-CSF基因序列插入到表达载体中，再通过大肠杆菌或哺乳动物细胞等生物工程技术进行表达和纯化得到的。
重组人G-CSF蛋白具有与天然人类G-CSF相似的生物学活性，能够刺激骨髓中的造血干细胞增殖和分化为中性粒细胞，从而提高中性粒细胞的数量。
新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞的化学结构使其具有一定的优势。
首先，PEG分子的引入可以增加药物的溶解度和稳定性，延长药物的半衰期。
这使得新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞具有更好的药效持续时间和更少的剂量频率。
其次，PEG分子的引入可以减少药物与免疫系统的相互作用，降低药物的免疫原性和过敏反应的风险。
再次，PEG分子的引入还可以改变药物的分子大小和形状，增加药物在体内的分布和渗透能力，从而提高药物的生物利用度。
新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞的化学结构对其药理学特性产生了显著影响。
PEG分子的引入使得药物在体内的代谢和排泄速度减慢，延长了药物的作用时间。
此外，由于药物与免疫系统的相互作用减少，新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞的免疫原性和过敏反应风险较低。
总结起来，新瑞白聚乙二醇化重组人粒细胞是一种由聚乙二醇修饰的重组人G-CSF蛋白构成的药物。
其化学结构使其具有较好的药物性质和药效。
聚乙二醇(PEG)修饰剂选择指南
性质聚乙二醇(PEG)，又称聚氧乙烯(oxyethylene)或聚环氧乙烷(PEO)，是一种合成的亲水生物相容性聚合物。
分子量＜100,000的通常被称为PEG，而分子量＞100,000的PEG聚合物被归类为PEO。
聚乙二醇是通过环氧乙烷开环聚合反应合成的，PEG 可以聚合成线性、分支、y形或多臂等几何形状。
PEG聚合物是两亲性的，可溶于水和许多有机溶剂(如二氯甲烷、乙醇、甲苯、丙酮和氯仿)。
低分子量(Mw <1,000)的聚乙二醇是粘稠无色的液体，而高分子量的聚乙二醇是蜡质、白色的固体，熔点与分子量成正比，熔点的上限约为67℃。
应用聚乙二醇无毒，通常无免疫原性，被FDA批准为可用于药物配方、食品和化妆品中作为辅料或载体。
大多数分子量＜1000的PEG可快速从体内清除，清除率与聚合物分子量成反比。
此外，PEG聚合物末端可连接多种官能团，使聚合物具有更多的功能。
因此，PEG在生物医学研究中具有广泛应用:生物接合、药物传递、表面功能化、组织工程以及许多其他应用。
PEG偶联是药物靶点如肽、蛋白质或寡核苷酸等与PEG的共价生物偶联，进而优化药代动力学特性。
在药物传递中，PEG可作为抗体-药物偶联物(ADCs)的连接物，或作为纳米颗粒的表面涂层，以改善系统药物传递。
PEG水凝胶是一种水膨胀的三维聚合物网络，它能抵抗蛋白质的粘附和生物降解。
PEG水凝胶是由PEG末端基团反应交联而成，通常用于组织工程和药物传递。
选择指南功能*单官能团聚乙二醇，包含一个化学反应端，可用于聚乙二醇化、表面接合和纳米粒子涂层*双官能团聚乙二醇，含有两个活性末端的PEG，包括同双官能团PEG、异双官能团PEG，有利于水凝胶的接合和交联反应*共价偶联:具有活性末端基团额PEG，如n-羟基丁二酰亚胺酯、巯基或羧基等，可以共价偶联到相应的官能团。
结合化学反应性质决定了每个分子的结合位点和PEG数量。
*链接化学需要带有叠氮或炔反应基团的PEG。
聚乙二醇在药物制剂中的应用
聚乙二醇在药物制剂中的应用聚乙二醇别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇,系环氧乙烷与单乙二醇或双乙二醇在碱性催化剂催化之下聚合而成,分子质量因聚合度不同而异,通常在200～35 000之间,PEG 的性质随分子质量而变化,目前常见的PEG种类有PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000等;药物溶剂PEG200、PEG300、PEG400、PEG600 系无色、略有微臭的粘性液体,化学性质稳定,安全低毒,故常作为药物的溶剂;另外,为了增加难溶性药物的溶解度,常使用潜溶剂即乙醇、甘油、丙二醇、苯甲醇、聚乙二醇等与水组成的混合溶剂;用于软胶囊剂软胶囊剂的囊材多以一定比例的明胶、增塑剂和水等组成,因此对蛋白质性质无影响的药物和附加剂均可填充;如各种油类、液态药物、药物溶液、药物混悬液和固体药物等;由于低分子质量PEG 能与水混溶,故是水溶性药物和某些有机药物很好的溶剂,如硝苯地平软胶囊;目前,软胶囊剂多为固体药物粉末混悬在油性或非油性PEG400 等分散介质中包制而成;另有报道,水合氯醛应用聚乙二醇作为溶剂可大大降低它对明胶蛋白的分解作用用于注射剂由于PEG200～PEG600 可提高难溶性药物的溶解度且对水不稳定药物有稳定作用,故可作为注射用溶剂;单一以PEG 作为注射用溶剂的注射剂并不多见,如噻替哌注射液以PEG400 或PEG600作为溶剂,可避免噻替哌在水中的聚结沉降作用；盐酸苄去氢骆驼莲碱注射液以 PEG200 作为溶剂,安全稳定,贮放 2 a 保持不变;但一般多用混合溶剂潜溶剂,如以V PEG300: V苯甲醇: V 丙二醇 = 80:5:15 时可作为质量分数为5 % 黄体酮或睾丸酮注射液的混合溶剂,此2 种注射液经肌肉注射后,与体液接触即在局部析出药物沉淀,形成药物仓库,逐渐从组织中释放,具有长效作用,售商品有病毒灵注射液、安乃近注射液、痢菌净注射液、穿心莲注射液、菌毒杀星注射液等;用于滴眼剂研究表明,以PEG400 为溶剂,可制成吲哚美辛滴眼剂;对此滴眼剂进行的稳定性研究结果表明,PEG400 处方优于Span80 处方;另外,PEG 可作为滴眼剂中的增稠剂,增加粘度,使药物在眼内停留时间延长,从而增加药效,减少刺激作用;润滑剂与粘合剂PEG4 000、PEG6 000是片剂中水溶性润滑剂的典型代表,在片剂处方中可直接加入适量聚乙二醇进行整粒,也可将其先配成醇溶液、混悬液或乳液进行制粒,润滑效果不变;利用聚乙二醇制得片剂的崩解和溶出不受影响,可提高主药在胃内的溶解性,最终有助于增加生物利用度;近年来,聚乙二醇在片剂中的使用越来越广泛,它们不仅可用作润滑剂,还可作为粘合剂,以PEG4 000最为常用;如以 PEG4 000为粘合剂熔点较低,在高速搅拌下呈熔融态,α -乳糖为填充剂,交联聚乙烯吡咯烷酮为崩解剂,硬脂酸镁为润滑剂,采用熔融制粒法可制备卡马西平速释片另外对于热不稳定药物,若采用 PEG4 000为粘合剂,可在干燥状态下进行粉末直接压片,效果较为理想;市售商品主要有痢菌净片、多钙片、钙中钙片、痢特灵片等;药物载体PEG 随分子量的增加则由液体逐渐呈半固体至固体,熔点也随之升高;由于PEG 对人体无毒无害,亦无致畸,致癌和基因突变等副作用,且可增加某些药物的溶出速率,提高药物的生物利用度,故是最常用的水溶性载体之一;基质PEG 是一类亲水性基质,其性质稳定,对皮肤无刺激性,而具有润滑性,故广泛应用于软膏剂、栓剂、凝胶剂、滴丸剂、乃至胶囊剂;如水硫软膏基质系由PEG300 与PEG4 000质量比为 2:1 时于70 ℃水浴熔合而成;复方磺胺甲恶唑SMZ栓以mPEG6 000 : mPEG4 000:m水=57:33:10 为基质,其融变时限和体外药物溶出速率均优于可可豆酯、半合成脂肪酸酯等基质;以PEG 为基质,加入主药和一些药物赋形剂可制备水凝胶剂,如氯硝西泮水凝胶,擦在病人身体上可使药物快速透过皮肤进入血液循环从而发挥抗惊厥作用;另外,PEG400、1 500、4 000～20 000 均可作为半固体基质,将硬胶囊改装液体或半固体药液,如硝苯地平1 份、液体 PEG 5 ～25份、PVP ～10 份混合药液罐装的硬胶囊剂具有长效作用,可广泛用于心绞痛的治疗聚乙二醇作为软膏剂水溶性基质,市售的品种有百多邦莫匹罗星、环丙沙星霜等；作为栓剂基质,市售的品种有制霉菌素栓、甲硝唑栓、新霉素栓等;固体分散材料固体分散体系指药物以分子、胶态、无定型、微晶等状态均匀分散在某一固体载体物质中所形成的分散体系;PEG 分子质量为1 000～20 000 是一类常用的水溶性载体材料,可用于增加药物的溶出速率,如以 PEG6 000作为载体,采用熔融法制备格列苯脲固体分散体,其溶出速率和生物利用度与市售达安宁片相比显着提高PEG 也可作为缓释固体分散体的载体材料,如采用熔融法,将药物溶解于熔化的PEG 中,将药液装入硬胶囊中,室温下药液固化,药物按溶蚀机制缓慢释放,故具有缓释作用;另外,药物从PEG 载体中溶出的快慢主要受PEG 分子质量的影响,一般随着 PEG分子质量增大,药物溶出速率会降低;当药物为油类时,宜用分子质量更大的 PEG 类作为载体,如PEG12 000 或PEG6 000与PEG20 000 的混合物,若单用 PEG6 000作载体,固体分散体会变软,特别是在温度高时载体会发粘稳定剂目前,蛋白质类药物制剂的主要问题是药物稳定性差;对于液体剂型蛋白质类药物,可通过加入辅料稳定剂如聚乙二醇、糖类、盐类、表面活性剂等改变其性质增加稳定性;高浓度的PEG常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀/ 结晶剂,它可与蛋白质的疏水链作用;研究表明,不同分子量的PEG 作用不同,如 PEG300 质量分数为 %或2 % 可抑制rhKGF 重组人角化细胞生长因子的聚集；PEG200、400、600 和1 000可稳定 BSA 和溶菌酶；PEG4 000不同质量分数可高达质量分数15 %可抑制低分子量尿激酶的热聚集此外,复合型乳剂稳定性差也是妨碍其广泛应用的主要原因;W/O/W型复乳常见的问题是分层,不过发生了分层的复乳经振摇后可复原;油膜破裂使内水相外溢是W/O/W型复乳不稳定的主要原因;若在内外水相中加入高分子物质作为稳定剂可增加其稳定性,如在外水相中加入PEG 、泊洛沙姆等可使复乳的粘度增大,降低复乳乳化膜的流动性,这对减小W/O/W型复乳的分层是有利的,且不影响其倾倒性和通针性;增塑剂与致孔剂PEG 是亲水性高分子物质,可作为增塑剂以改变聚合物的物理机械性质,使其更具柔顺性、塑性;如为了使明胶微囊具有良好的可塑性,不粘连且分散性好,常需加入增塑剂如聚乙二醇,山梨醇,丙二醇,甘油等;研究表明,在单凝聚法制备明胶微囊时,加入增塑剂可减少微囊聚集,降低囊壁厚度,且加入增塑剂的量同释药半衰期之间呈负相关;PEG 作为增塑剂也广泛应用于薄膜包衣材料中,PEG 带有羟基,可作为某些纤维素衣材的增塑剂,如以醋酸纤维素为膜材,PEG400 为增塑剂,阿拉伯胶为渗透压活性物质和助悬剂所制备的难溶性药物萘普生的单室单层渗透泵上下面均有释药小孔以零级速率释药,药物在12 h 的累积释放率可达 81 %;此外,PEG 作为增塑剂在膜剂和涂膜剂中也有应用;PEG 是能与水互溶的聚合物分子,所以 PEG 可作为膜控型缓控释药物的致孔剂;PEG 这类致孔剂能很快溶于介质中,形成较大的孔道,随着孔道的增加,外部溶剂很容易扩散穿过控释膜,加速了药物的释放;因而通过选择合适的聚合物衣膜和致孔材料可使药物达到恒速释放;如头孢氨苄缓释小丸以乙基纤维素为包衣材料,PEG6 000为致孔剂,此缓释胶囊包衣增质量 30 %,在 7 h内表现为药物零级释放,释药重现性良好;又如伪麻黄碱渗透泵无释药小孔以醋酸纤维素为膜材,酞酸二乙酯和PEG400 为致孔剂,碳酸氢钠为渗透压活性物质,其在12 h 内遵循零级释药规律修饰材料聚乙二醇类PEG 修饰剂是 pH中性、无毒、水溶性的聚合物,具有高度的亲水性和良好的生物相容性及血液相容性,并且没有免疫原性;故采用PEG 进行结构修饰可改善药物的以下性质：1 增加稳定性,降低酶降解作用；2 改善药物动力学性质,如延长血浆半衰期、降低最大血药浓度、血药浓度波动减小等；3 降低免疫原性和抗原性；4降低毒性,提高体内活性；5改善体内药物分布,靶向性增强；6 减少用药频率,提高病人依从性用于修饰脂质体传统脂质体和免疫脂质体易被网状内皮系统RES 的细胞识别并摄取,导致血循环半衰期很短通常低于30 min,到达靶器官之前即被清除,故应用很受限制;若在脂质体膜表面引入亲水性聚合物分子PEG ,可在脂质体表面形成一层水化膜,掩盖脂质体表面的疏水性结合位点,阻碍血浆成分接近脂质体,从而降低RES 对脂质体的识别和摄取,延长脂质体的血循环时间;PEG 修饰脂质体可以在病变部位如肿瘤、感染、心肌梗死等区域通过所谓的“被动靶向” 或代偿滤过机制缓慢积累,并促进药物在这些区域的转运;如PEG 修饰的多柔比星脂质体在动物实验及人体临床试验中均取得显着效果,且已有产品长效脂质体多柔比星Doxil 上市;此外,PEG 修饰的阿霉素脂质体与传统的阿霉素脂质体相比,药代动力学特征显着变化,抗肿瘤活性明显增强,毒性有所降低;这表明了PEG 修饰脂质体是一种很有前景的药物传递系统;用于修饰乳剂长循环乳剂是指对静脉注射用脂肪乳剂表面进行适当的修饰,以避免单核吞噬细胞系统MPS 的吞噬,延长体循环时间的乳剂;乳滴表面被柔顺而亲水的 PEG 链覆盖,亲水性增强,减少血浆蛋白与其相互作用的几率,降低被 MPS 吞噬的可能性;以二棕榈酰磷脂酰胆碱为乳化剂,助乳化剂,三油酸甘油酯为油相,加入适量PEG 修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG,可制得粒径为44 nm 的微乳,静注后在血中的清除率比未经修饰的微乳明显降低布洛芬溶解度极小,市售只有其衍生物氟布洛芬酯的乳剂,Park 等以油酸乙酯为油相、卵磷脂为乳化剂、DSPE-PEG 为助乳化剂制备了氟布洛芬微乳,与前者相比,t1/2、AUC、MRT都显着增加,同时可降低MPS的吞噬;另外,据文献23 报道,以 PEG 和叶酸修饰的阿柔比星微乳对于癌细胞具有显着的靶向性;用于修饰纳米粒和微球可生物降解的聚合物纳米粒作为药物输送载体有很多优势,如可控释、靶向、低毒等;但是,由于聚合物纳米粒经静脉给药后,数秒或数分钟内会被RES 清除而无法普遍应用;为克服这一缺点,可引入亲水性聚合物PEG 对聚合物进行修饰;研究表明,亲水性PEG 修饰的纳米粒,用于静脉给药时,血液清除和RES 摄取显着减小,并且PEG 引入会影响纳米粒的生物降解行为,调节释药方式;如Ruxandra 等以乳化溶剂蒸发法制备的环孢酶素CyA PLA-PEG共聚物纳米粒粒径分布很窄,呈单峰分布,且此分散体系性质稳定,包封率很高83 ℅ ～96 ℅ ,其体外释药符合扩散机制;另外,PEG 修饰的吲哚美辛脂质微球与传统的脂质微球相比,体内总清除率明显降低,药物靶向性显着提高,药物动力学参数如t1/2、AUC、MRT都显着增加用于修饰多肽和蛋白类药物 PEG 末端的醇羟基化学性质不活泼,为保证其与药物活性基团间有适宜的反应速率,需对醇羟基进行活化,以利于与蛋白质的α-和ε-氨基的反应;按PEG 与蛋白质氨基形成的连接键类型,活化PEG 可分为以下两类：1 烷基化 PEG ,如醛基化 PEG 、PEG-三氟乙基磺酸酯PEG-T 等；2 酰化 PEG ,如 PEG 琥珀酰亚胺基琥珀酸酯PEG-SS、PEG 琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG-SC等;蛋白质和多肽类药物主要包括酶、细胞因子等一些具有特殊功能的蛋白质,其PEG 的修饰即PEG 化,是将活化的 PEG 通过化学方法偶联到蛋白质和多肽上;PEG 修饰蛋白药物可以延长药物的半衰期、降低免疫原性和毒副作用,同时最大限度地保留其生物活性;自从1991 年第一种用 PEG 修饰的腺苷脱氨基酶PEG-ADA被 FDA 批准上市后, PEG 修饰药物蛋白的技术飞速发展,近几年上市的还有PEG-干扰素、PEG-GSF、PEG-生长抑素;如普通干扰素α-2b 的半衰期只有 4 h,而经过聚乙二醇化的干扰素α-2b 的半衰期达 40 h ,可在体内持续作用168 h,刚好满足1 周1 次给药;故聚乙二醇干扰素又叫长效干扰素商品名：佩乐能;另外,PEG 修饰的重组人粒细胞集落刺激因子也已经上市,其体内半衰期显着延长,临床上用于治疗化疗引起的嗜中性白血球减少症;目前处于临床前研究的 PEG 修饰的蛋白药物有几十种,处于临床实验的有：超氧化物歧化酶即将上市,美国Enzon 公司、白介素-2 Ⅱ期临床,挪威Chiron 公司、水蛭素Ⅱ期临床,德国 BASF AG公司、抗-TNFα抗体片段Ⅲ期临床,瑞典Pharmacia公司、牛血红蛋白Ⅰ期临床,美国Enzon 公司、抗-PDGF 抗体片段Ⅱ期临床,英国Celltech公司等;渗透促进剂渗透促进剂是指能可逆的改变皮肤角质层的屏障功能,又不损伤任何活性细胞的化学物质;理想的渗透促进剂应无药理活性、无毒、无刺激性、无致敏性,与药物、基质和皮肤有良好的相容性,无臭无味;常见的渗透促进剂有亚砜类、表面活性剂类、多醇类、吡咯酮类等;多醇类化合物有乙醇、丙二醇、聚乙二醇、异丙醇和丙三醇等;多元醇类的作用机制是使角蛋白溶剂化,占据蛋白质的氢键结合部位,减少药物与组织间结合,增加并用的其他渗透促进剂在角质层的分配;Chaudhuri等比较了心得安在 5 种介质中的人体透皮速率,结果 PEG > 二乙醇 > pH 磷酸盐缓冲液 > 辛醇 > 肉豆蔻酸异丙酯;据 Touitou等报道,包含油酸、PEG 等基质能使茶碱对大鼠的透皮吸收增强260 倍;另有研究表明,在1 % 普萘洛尔水溶液中各加 5 % 的促渗剂,对 5 种渗透促进剂促渗效果进行了比较,结果二甲基亚砜 > PEG400 ,油酸 > 丙三醇 > Span80 ;综上,PEG 在透皮吸收制剂中的作用并不亚于油酸;但据研究报道,PEG 由于含有大量的醚氧原子,与药物产生氢键结合可能性很大,这势必降低药物的热力学活性;同时,由于 PEG 本身粘度较大,故会增加载体微环境的的粘度,这样不仅抑制了角质层的水合,而且角质层会因其高渗作用发生脱水,促渗效果并不理想;因此,PEG 应与油酸、氮酮、丙二醇等促渗剂联合应用应用局限性聚乙二醇有以下缺点：作为软膏基质时,长期应用可引起皮肤干燥；可与一些药物如苯甲酸、水杨酸、鞣酸、苯酚等络合,导致基质过度软化,也会降低酚类防腐剂的活性;聚乙二醇作为软胶囊填充剂时,由于选择性吸收胶囊壳内水分,导致囊壳硬化,从而影响药物释放速率;制备栓剂易出现孔洞影响外观；随高分子量的聚乙二醇加入量增加,水溶性药物的释放率减小;对粘膜的刺激性比脂肪性基质大;聚乙二醇的不良反应已有报道：局部用药可能引起过敏反应,包括荨麻疹和延迟性过敏反应；最严重的不良发应在烧伤病人局部应用聚乙二醇产生的高渗性,代谢物的酸中毒和肾功能减退;低分子量的聚乙二醇毒性最大,但二醇类毒性是相当低的;。
水蛭素
水蛭素的核心环肽结构如下：
• 1986年科学基酸 密码子 基因探针 提取基因
2、选择基因载体获得重组DNA
• 在体外将含目的基因的DNA片段和具 有自我复制功能、并带有选择标记的 载体分子进行酶切连接，获得重组 DNA分子。 • 可以作为载体的主要有质粒、噬菌体、 黏粒、病毒载体等。
水蛭素
在古代医书《神农 本草经》中早有水 蛭素的记载，为我 国传统中药。中医 认为它有破血、逐 瘀、通经的功能。 它是迄今为止所发 现最强的凝血酶天 然特异抑制剂。
水蛭素的临床应用
• 预防外科手术后的静 脉血栓形成 • 预防和治疗（阻断） 急性或慢性血管内凝 血（DIC） • 预防血栓溶解后再栓 塞 • 预防经皮血管腔内形 成术（PTCA）后的再 狭窄 • 作为透析和体外循环 中的抗凝剂
基因工程技术获Leabharlann 水蛭素• 1、获得具有遗传信息的目的基因 • 2、选择基因载体获得重组DNA • 3、将重组DNA分子导入宿主细胞 • 4、鉴定带有目的基因的克隆 • 5、目的基因的扩增及获得目的产物
1、获取目的基因
现已知水蛭素有11种类型，其中3种具 有抗凝血活性，它们分别命名为HV1、 VH2和VH3。 天然水蛭素是酸性多肽，其一级结构中 含有6个半胱氨酸，形成3对链内二硫键， 位于肽键N端；另一特点是在63位酪氨酸 处有硫酸酯化。
• 导入方法：
该菌主要采用形成圆 球体、在有氯化锂和 聚乙二醇-1000的条件 下用整体细胞以及电 穿孔等方法进行基因 转化。
• 载体选择：
毕赤酵母载体均为大 肠杆菌-毕赤酵母穿梭 质粒。故在上一步的 载体选择中应选取质 粒。
4、鉴定带有目的基因的克隆
• 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有 重组DNA分子的寄主细胞。 • 方法： 采用各自特有的测活方法确定其生物活性； 采用酶联免疫方法确定其抗原性； 以目的基因为探针，通过DNA杂交方法可以 直接确定重组子。
15898430_重组水蛭素的原核表达及分离纯化
CLKQ7 R#-:S8$F4TH$=8-:UL4RP$N$-:VC4@89HP-F4L M$-:O#P 83%3292/:%,;.%3;./<;.!;$+2.=%3#;$%$->3#(#?%3#;$;<8*,3.;@#5%(&A.;B,#;.2+;*.52+
收 稿 日 期 0&%/!&(!&( 基 金 项 目 国 家 1(* 重 点 项 目 课 题 0&%*KK%&02&)广 西 科 技 开 发 项 目 桂 科 攻 %2J1&%*!0 作 者 简 介 黄 孔 威 %JJ)!男 福 建 邵 武 人 硕 士 研 究 方 向 分 子 生 物 学 B!3D$E1J*J(1J/J!NN',#3 通 信 作 者 刘 庆 友 %J/(!男 山 东 巨 野 人 博 士 研 究 员 研 究 方 向 转 基 因 动 物 B!3D$ENOE$P0&&0!%0(',#3
水蛭入药历史 悠 久!早 在 中 国 的 东 汉 及 西 方 的 培养基购自北京陆 桥 技 术 有 限 责 任 公 司(限 制 性 核
古希腊时期就有其入药的记载'水蛭中起治疗功效 酸内切酶 E5;#和 F";#&6)@QK 连接酶&胶回收
的主要成分为水蛭 素"H$>P"$-#!它 由 医 用 水 蛭 唾 液 试剂盒 均 购 自 A38:D公 司(V?D$-!;>88试 剂 盒 购 自
液"%2&)JK0#&&'00%3 5`@[ 膜"4VBM&&&%&#均 购 自 ]$EE$=#>8公司(C$9标签 蛋白 抗体"%a%&&&&#&C\5 标记的二 抗"D-?$!3#P98!%a2&&&#均 购 自 武 汉 三 鹰 生物技术有限公司'
重组水蛭素
重组水蛭素一、重组水蛭素的理化性质1、天然水蛭素的结构水蛭素是一种单链环肽化合物，由65个氨基酸残基组成，分子量7KD，N端有三个硫键，，分别在6～14位，16～28位和22～39位的半胱氨酸残基，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。
N端的5个氨基酸残基为疏水基团，C端则为亲水基团，并游离在分子的表面。
肽链中部还有一个特殊序列，不被蛋白酶所降解。
素存在10种以上变异体，主要有3种变异体，简称为HVl、HV2和HV3。
2、重组水蛭素的结构重组水蛭素除了63位Tyr残基上脱SO3－外，其他与天然水蛭素一样。
3、重组水蛭素的等电点：为3.9。
4、重组水蛭素的溶解性质溶于水或吡啶，几乎不溶于醇、乙醚、丙酮或苯5、重组水蛭素的稳定性1）、水蛭素干燥状态下稳定；室温下水中可稳定存在6个月；80℃下加热15min不被破坏。
2）、pH值升高则稳定性下降，在0.1mol／L盐酸溶液或0.1m01／L氢氧化钠溶液中可稳定15min。
3）、水蛭素不被胰蛋白酶水解，对α－糜蛋白酶一定的耐受性；但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
4）、描述了稳定的制剂处方重组水蛭素与二价金属离子(ca2+，zn2+或M矿+)形成性螯合物，在水中可稳定储存，用于静脉或皮下注射。
二、重组水蛭素的提取纯化工艺1、发酵液经超滤、透析、离子交换层析，分离纯化目的蛋白1.1 超滤与透析发酵液于5000rpm冷冻离心20min，离心上清液超滤(MWCO=30000)并收集透过液，加入蒸馏水重复超滤，合并透过液。
透过液超滤浓缩（MWCO=3000），加入蒸馏水重复透析除盐，最终浓缩至所需体积，置于4℃冰箱保存备用。
1.2离子交换层析平衡缓冲液为PH3.0和PH5.0的甘氨酸缓冲液（50mmol/L），梯度洗脱缓冲液为1/LNaCL(于50mmol/L的甘氨酸缓冲液中）。
样品SP-Sepherose FF吸附并洗脱后，收集重组水蛭素活性峰，测定蛋白浓度和比活力。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 / 16 重组水蛭素的聚乙二醇修饰 李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙* XX理工大学环境与生命学院XX 116024 摘要：目的水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有
效地延长其半衰期。本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG 20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。另外用分子动力学模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。结果在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。结论在pH8.0 条件下，采用“离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。 关键词：重组水蛭素；SC-mPEG；抗凝活力；分子动力学模拟
PEGylation of Rebinant Hirudin Li Xueqin，Hou Beibei，Zhao Jun，Tian Mingyu，Xiu Zhilong* Department of Bioscience and Biotechnology,School of Environmental and Biological Science and Technology,DalianUniversity of Technology,Dalian 116024,China
Abstract:OBJECT Hirudin is the most potent inhibitor of thrombin found in nature.
Although hirudin has the strongest anti-thrombin activity in vivo, its short half-life in serum significantly limits its clinical anticoagulant application. Currently, PEGylation is monly used as an effective method to prolong its half-life in serum.Our object of experiment is to choose the best PEGylation method according to the monoPEGylated rebinant hirudin’s purity and the anticoagulant activity in vitro.METHODS Solution method and solid method assisted by “packed-bed” and anion exchange columnwere used to favor the formation of mono-PEGylated hirudin. The mild acidic and mild alkaline 2 / 16
PEGylation strategy was used to target His residue and Lysresidue of hirudinrespectively using SC-mPEG20kDa.The pegylated productswere isolated by anion exchange chromatogram. SDS-PAGE was used to analyze the purity of PEGylated hirudin. Thrombin method was used to analyze the anticoagulant activity of PEGylatedhirudin. Molecular dynamics modeling was used to judge the probability of PEGylation site. RESULTSThe mono-PEGylated product with a purity of more than 90% was obtained at pH6.0 and pH8.0. But a large difference in anticoagulant activity exists: the anticoagulant activity of solution and solid methods were 34% and 34.8% respectively at pH6.0；55%、96% at pH8.0.CONCLUSION Solid method assisted by anion exchange column at pH8.0 was a better strategy to get mono-PEGylated r-Hirudin. Key words：rebinant hirudin；SC-mPEG；anticoagulant activity；molecular dynamics
modeling 前言 水蛭素是含65个氨基酸残基与3个二硫键的多肽，分子量约7000，是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂[1],而凝血酶诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要原因，因此水蛭素对各种血栓病均有疗效。 然而水蛭素有一些显著的药用缺点，如血浆半衰期较短，一般只有60-100分钟，患者需不断注射才能维持抗凝效果，导致治疗成本较高，且重复注射也会引起一些不良反应[2-4]。上世纪70年代以来，人们发现一些蛋白经过PEG修饰后，很多方面的药用特性大大改善。之后，人们开展了对于水蛭素的PEG修饰研究。George C.Avgerinos[5]等人采用基因工程方法对水蛭素氨基酸进行改造，用甲基营养酵母 Hansenyla polymorpha特异性表达了只含两个Lys的水蛭素，采用对硝基碳酸酯活化的PEG 5kDa进行修饰，并设计了工业等级纯化步骤。这种对水蛭素修改的方式可以大大提高修饰产物的专一性，但是研究周期性较长且须具备一定的科研条件。 国内也有关于水蛭素PEG修饰的研究。于爱平[6]等人采用SPA-PEG 5kDa修饰水蛭素II，采用Source Q15离子交换柱凝胶柱分离修饰产物，发现三修饰产物活力大大降低，为原蛋白的33.5%。秦海娜[7]等人采用羰基二咪唑法活化的PEG 5kDa修饰水蛭素，采用凝胶色谱方法X修饰产物进行分离，虽水蛭素可与修饰产物分离，但是修饰产物之间未能分离开。 3 / 16
本实验组旨在通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率来找到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。修饰位点选择了His和Lys；修饰方法选择了液相修饰和 “填料辅助”、“离子交换柱辅助”两种固相修饰方法。 1材料 基因工程重组水蛭素（r-Hir）购自XX高新生物制药XX；水蛭素变异体2购自XX科润生物医药XX；SC-mPEG20kDa购自键凯科技XX 2实验方法
2.1水蛭素His位点的PEG修饰 2.1.1液相修饰 HV2与SC-mPEG 20 kDa以摩尔比 1:1 溶于0.2M pH6.0磷酸盐缓冲溶液中（PBS），在25℃中反应1.5h。反应产物用HiTrap Q HP进行线性梯度洗脱。 2.1.2“填料辅助”的固相修饰 在pH6.0下，将20mM PBS与r-Hir: SC-mPEG以摩尔比1:3在Q-Sepherose FF介质中充分反应，反应完成后装柱、梯度洗脱。 2.2水蛭素Lys位点的PEG修饰 2.2.1 液相修饰 HV2与SC-mPEG20 kDa以摩尔比 1:3 溶于0.02 M pH8.0 PBS中，在23℃下反应。SC-mPEG分三等分三次加入，每次反应30min。反应结束后样品立即用HiTrap Q HP进行线性梯度洗脱。 2.2.2“离子交换柱辅助”的固相修饰 4 ml 1.5mg/ml HV2 溶液 (溶于PBS 20 mM, pH 8 A液）与溶于4 ml 20 mM, pH 8 PBS 中的 SC-mPEG先后以1 ml/min的流速上样于柱中，使二者在柱中充分反应后进行在线梯度洗脱。 3 分析方法 3.1SDS–PAGE 参考文献[8]，15%浓缩胶、4%分离胶，采用含5%氯化钡的0.1M碘液对PEG进行4 / 16
染色。表1为水蛭素PEG各修饰产物的理论分子量，可结合电泳图确定洗脱组分成分。 3.2生物活性测定 参照文献[9]的方法，采用凝血酶滴定法。 3.3组氨酸修饰产物含量检测 利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。 3.4Lys修饰位点预测 采用溶剂可及表面积作为判定赖氨酸残基修饰可能性的判断标准，运用分子动力学模拟的方法分析和预测液相和固相修饰的位点。 4 结果
4.1 水蛭素His位点的PEG修饰 4.1.1 液相修饰 4.1.1.1修饰产物的分离纯化 液相方法制备的PEG化水蛭素采用离子交换柱进行分离纯化、SDS-PAGE法进行组分鉴定。
结合表1、图2可以推测出图1中峰 1，2 ，3分别为二修饰产物、单修饰产物、单修饰产物。通过积分法计算出图1中各峰的面积，从而得出出各产物的比例：峰1：峰2：峰3= 4.74%：94.6%：0.66%，可见单修饰产物是主要的修饰产物。
表1 水蛭素PEG修饰产物组分理论分子量 Table 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudin
图1 阴离子交换色谱分离修饰反应混合物（pH6.0） Fig.1 Separation of the PEGylation mixture (prepared at pH6.0) by anion-exchange chromatography
图2 修饰产物的电泳结果（15%-5%） Fig. 2 SDS-PAGE analysis of PEGylated r-hirudin.