磷酸化蛋白质的分析方法
磷酸化指标免疫组化染色
磷酸化指标免疫组化染色磷酸化指标免疫组化染色：揭示蛋白质修饰的重要工具引言：在生物学研究中，了解蛋白质的修饰状态对于探索细胞信号传导、蛋白质功能以及疾病发生机制至关重要。
磷酸化作为一种常见的蛋白质修饰方式，参与了细胞的多种生理和病理过程。
磷酸化指标免疫组化染色是一种重要的实验手段，可以定量检测磷酸化蛋白质的表达和定位。
本文将从深度和广度上详细探讨磷酸化指标免疫组化染色的原理、技术流程和应用，并分享我对其个人观点和理解。
一、原理：1. 磷酸化的意义与作用磷酸化是一种通过在蛋白质分子中加入磷酸基团改变其结构和功能的修饰方式。
它参与了细胞信号传导、基因转录、细胞周期调控等重要生理过程，对于维持细胞的功能和稳态至关重要。
2. 磷酸化指标免疫组化染色的基本原理磷酸化指标免疫组化染色是一种通过特异性抗体与磷酸化蛋白质结合来检测和定量磷酸化蛋白质表达和定位的技术。
它利用免疫组化的原理，通过特异性抗体的结合，使得磷酸化蛋白质在组织切片或细胞标本中形成可视化的染色信号。
二、技术流程：1. 样本的制备与固定研究者需要选择适当的样本（组织切片或细胞标本）进行研究，并进行必要的固定处理，以保持蛋白质的磷酸化状态和细胞结构的完整性。
2. 抗体选择与优化磷酸化指标免疫组化染色的关键是选择和优化合适的抗体。
研究者需要根据研究的具体目的，在各种商业或自制的抗体中筛选出能够特异性识别目标磷酸化位点的抗体。
3. 抗原解蔽处理研究者需要对样本进行抗原解蔽处理，以提高抗体的结合能力。
抗原解蔽处理可以通过热解蔽、酶解蔽或碱解蔽等方法进行。
4. 抗体染色与信号放大将特异性抗体与样本中的磷酸化蛋白质结合，形成可见的染色信号。
为了增强信号的强度和稳定性，可以采用生物素-链霉亲和素（Biotin-avidin）系统和荧光标记等方法进行信号放大。
5. 染色结果的观察与分析通过显微镜观察染色结果，观察磷酸化蛋白质的表达和定位情况。
可以使用图像分析软件对染色结果进行定量分析，以获得更为准确的数据。
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点-生物质谱分析蛋白质磷酸化位(2021整理)
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点工程完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉工程完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于说明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。
我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。
应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。
两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。
蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰〔PTM〕。
在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。
蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。
目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸〔pSer〕、磷酸化苏氨基酸〔pThr〕和磷酸化酪氨酸〔pTyr〕。
毛细管电泳〔CE〕可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱〔HPLC〕别离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。
生物质谱〔MS〕是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。
是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。
近年来，生物质谱的开展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。
这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。
生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
蛋白质修饰检测技术及其应用
蛋白质修饰检测技术及其应用蛋白质修饰是指在翻译后修饰成熟的蛋白质分子上发生的各种化学改变。
蛋白质修饰可以调节蛋白质的结构、功能和活性，对维持细胞的正常生理功能至关重要。
因此，研究蛋白质修饰及其应用于疾病诊断、治疗和药物研发成为了当前的热点研究领域。
本文将介绍蛋白质修饰的检测技术及其在生物医学领域的应用。
一、蛋白质修饰的类型1. 磷酸化修饰：蛋白质磷酸化是目前研究最广泛的一种修饰形式。
它通过添加磷酸基团改变蛋白质的电荷和空间构型，从而影响蛋白质的功能。
常用的磷酸化修饰检测方法包括质谱分析、免疫印迹和蛋白质芯片技术。
2. 甲基化修饰：蛋白质甲基化是通过向蛋白质上的氮、氧或硫原子添加甲基基团而实现的修饰。
甲基化修饰可以调节蛋白质的稳定性、活性和亲和性。
常用的甲基化修饰检测方法有质谱分析、甲基化特异性抗体和免疫荧光染色。
3. 乙酰化修饰：蛋白质乙酰化是通过向蛋白质上的赖氨酸残基添加乙酰基团而实现的修饰。
乙酰化修饰可以调节蛋白质的稳定性、转录活性和DNA结合能力。
常用的乙酰化修饰检测方法包括质谱分析、乙酰化特异性抗体和酶活性检测。
二、蛋白质修饰检测技术1. 质谱分析：质谱分析是目前最常用的蛋白质修饰检测方法之一。
它通过测量蛋白质分子的质量和质荷比，可以鉴定和定量各种蛋白质修饰形式。
质谱分析的优点是高灵敏度和高分辨率，能够识别极低浓度的修饰产物。
2. 免疫印迹：免疫印迹是一种常用的蛋白质修饰检测技术，它利用特定抗体与目标修饰蛋白发生特异性结合，然后通过化学荧光或酶标记来检测修饰的蛋白质。
免疫印迹技术操作简便，可以同时检测多个修饰位点。
3. 蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质修饰检测技术。
它将多个蛋白质修饰位点的抗体固定在芯片上，然后通过与样品中的修饰蛋白发生特异性结合来进行检测。
蛋白质芯片技术可以同时检测大量的修饰位点，适用于高通量筛查和研究。
三、蛋白质修饰的应用1. 疾病诊断：蛋白质修饰在疾病诊断中发挥着重要作用。
景杰生物：磷酸化修饰蛋白质组学
16
磷酸化蛋白质组学分析
降低样品复杂度
规模化分析
特异性富集方法 有效预分级方法 IMAC/MOAC C18/SCX/HILIC
Nat. Protocol, 2013, 8, 461-480.
17
磷酸化蛋白质组学分析策略
常用 定量 方法
绝对定量 MRM
Spectral counts
无标记定量
色谱峰面积
calcium calmodulin kinase IV (CaMKIV)
Annu. Rev. Biochem. 2011, 80:825–858.
钙调蛋白激酶4
12
Cross-talk with Ubiquitination
Mol. Cell, 2007, 28(5), 730-738.
13
Cross-talk with Ubiquitination and Acetylation p53 stabilization
Tauopathy （Tau蛋白病） Alzheimer’s disease
Trends Mol. Med., 2009, 15(3), 112-119.
10
mTOR磷酸化和细胞自噬
mTORC1复合体
Nat. Cell. Biol., 2011, 13(2), 132-141.
11
Cross-talk with O-GlcNAc
20
肝脏组织的磷酸化蛋白质组
J. Proteomics, 2014, 96, 253–262.
21
PTM-Biolabs
谢谢！
18
三、磷酸化蛋白质组学的应用
样品类型
某细胞 某细胞
项目类型
SILAC SILAC
蛋白质磷酸化调控网络的解析
蛋白质磷酸化调控网络的解析蛋白质磷酸化是一种重要的信号传导机制，通过磷酸化作用调控着细胞内的生物过程。
该调控网络不仅涉及细胞的生命周期、代谢调节等基本生物学进程，还在许多疾病的发生和发展中扮演着重要角色。
本文将对蛋白质磷酸化调控网络进行解析，探讨其机制和功能。
一、蛋白质磷酸化的基本机制蛋白质磷酸化是指通过激酶将磷酸基团（PO4）与蛋白质的亚氨基酸残基（如丝/苏氨酸、酪氨酸和酪氨酸等）结合，形成磷酸酯键的化学反应。
这一过程由蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同调控，激酶负责催化磷酸基团的添加，而磷酸酶则负责去除磷酸基团，以实现对蛋白质活性的调节。
二、磷酸化调控网络的组成磷酸化调控网络是由激酶、底物蛋白质以及与其相互作用的调控因子等组成的复杂网络系统。
激酶是磷酸化调控网络中的核心部分，它可以通过磷酸化作用改变底物蛋白质的结构和功能。
底物蛋白质则是激酶作用的对象，它们通过与激酶结合，实现蛋白质活性的调节。
此外，还存在一些调控因子，它们可以调节激酶和底物蛋白质之间的相互作用，进一步调控磷酸化信号传导的过程。
三、磷酸化调控网络的功能磷酸化调控网络在细胞内发挥着多种功能，包括但不限于以下几个方面：1. 信号传导：磷酸化调控网络可以传递细胞内外的信号，从而调节细胞的应激反应和生物学过程。
例如，在细胞应激中，磷酸化状态的改变可以引发复杂的信号级联反应，影响细胞的增殖、分化和凋亡等。
2. 代谢调节：磷酸化调控网络可以参与调节细胞的代谢过程。
例如，在糖代谢中，磷酸化调控网络可以通过控制关键酶的活性，调节糖的合成和分解，维持细胞内的能量平衡。
3. 细胞周期：磷酸化调控网络在细胞周期中起着至关重要的作用。
通过改变细胞周期蛋白的磷酸化状态，磷酸化调控网络可以调节细胞的有丝分裂和有丝分裂等过程，保证细胞的正常生长和分裂。
4. 疾病发生与发展：磷酸化调控网络在疾病的发生和发展中起着重要作用。
例如，在肿瘤细胞中，磷酸化调控网络的异常激活会导致细胞的异常增殖和转移，进而促进肿瘤的形成。
蛋白质修饰与功能分析
蛋白质修饰与功能分析蛋白质是生物体中最为重要的生化分子之一，它们在细胞内参与了许多关键的生物过程。
然而，蛋白质本身的功能并非一成不变的，而是通过修饰来实现可调控性。
蛋白质修饰是指对蛋白质分子结构的化学改变，从而调节蛋白质的活性、稳定性以及相互作用等。
本文将探讨常见的蛋白质修饰类型及其在功能分析中的意义。
一、磷酸化修饰磷酸化修饰是蛋白质修饰中最常见的一类，它通过在蛋白质上加上一个磷酸基团来改变蛋白质的电荷状态。
这种修饰可通过激酶酶与磷酸酶酶进行平衡，从而调节蛋白质的功能。
磷酸化修饰可影响蛋白质的酶活性、亲和力以及稳定性等方面的功能。
在功能分析中，磷酸化修饰可通过质谱分析等技术来鉴定。
磷酸化位点的识别可以帮助我们理解蛋白质的功能，并揭示某些疾病发生机制中的关键蛋白质修饰事件。
二、糖基化修饰糖基化修饰指的是将糖分子连接到蛋白质的氨基酸上，形成糖链。
这种修饰广泛存在于细胞表面的蛋白质上，起到了识别和相互作用的重要作用。
糖基化修饰能够影响蛋白质的稳定性、活性以及在细胞内的位置。
功能分析中的糖基化修饰研究一般通过质谱等技术来鉴定特定的糖链组成，并进一步研究其在细胞信号传导和疾病发展中的相关作用。
三、乙酰化修饰乙酰化修饰是通过将乙酰基团添加到蛋白质的赖氨酸残基上而实现的。
这种修饰可以调节蛋白质的转录活性、稳定性以及相互作用等。
乙酰化修饰在转录因子的活性调节和染色质结构的变化中起到重要作用。
在功能分析中，乙酰化修饰可通过质谱和抗体识别等方法进行检测。
研究乙酰化修饰对特定蛋白质的影响，有助于我们更好地理解细胞核内的基因调控机制。
四、脂肪酰化修饰脂肪酰化修饰是通过将脂肪酰基团连接到蛋白质上的半胱氨酸残基实现的。
这种修饰可以影响蛋白质的细胞定位、稳定性以及蛋白质与膜的相互作用等。
脂肪酰化修饰在细胞信号传导和蛋白质定位中发挥着重要作用。
在功能分析中，脂肪酰化修饰的研究一般通过质谱和生物化学技术来鉴定特定脂肪酰化位点。
研究脂肪酰化修饰对蛋白质功能的影响有助于理解细胞信号传递和疾病发展的机制。
蛋白质磷酸化对细胞代谢的影响分析
蛋白质磷酸化对细胞代谢的影响分析蛋白质磷酸化是一种常见的细胞后修饰方法，它可以通过添加磷酸基团来改变蛋白质的结构和功能。
此过程通常由磷酸化酶和激活基进行调节。
蛋白质磷酸化不仅在细胞信号传递中具有重要作用，还被证明对细胞代谢具有重要影响。
细胞代谢是指细胞内的所有化学反应，包括能量代谢、合成和分解等。
蛋白质磷酸化通过参与这些反应来影响细胞代谢。
首先，蛋白质磷酸化在细胞能量代谢中发挥着重要作用。
研究表明，许多代谢酶在磷酸化后会发生结构和功能改变，从而调节细胞代谢。
例如，通过磷酸化，肝糖原磷酸酶可以被激活，促进糖原降解，从而提供细胞所需能量。
另一方面，乳酸脱氢酶的磷酸化则可以被抑制，降低其产生乳酸的速率，从而避免细胞内产生过多的乳酸并减少乳酸蓄积。
其次，蛋白质磷酸化还能够调节合成和分解过程，进而影响细胞代谢。
在蛋白质合成过程中，磷酸化可以调节翻译起始因子和核糖体蛋白S6K1等酶的活性，进而影响蛋白质合成的速率和数量。
此外，许多代谢酶的合成也能够受到磷酸化的调节。
在蛋白质分解中，磷酸化可以调节自噬过程，以控制蛋白质降解的速率。
研究表明，蛋白质磷酸化在蛋白质代谢的平衡中发挥着重要作用。
第三，蛋白质磷酸化还可以通过调节信号通路来调节细胞代谢。
例如，紫杉醇等信号分子通常会磷酸化蛋白质，进而激活细胞内的信号通路，从而影响细胞代谢。
此外，许多代谢物也可以通过激活或抑制特定的磷酸化酶来调节自身代谢路径。
因此，蛋白质磷酸化在代谢反应通路中也具有重要的调节作用。
最后，需要指出的是，蛋白质磷酸化对细胞代谢的影响是非常复杂的。
在不同的细胞类型、环境和代谢状态下，磷酸化过程可能会引发不同的代谢调节机制。
因此，需要进行更多深入的研究来充分理解蛋白质磷酸化对细胞代谢的精细调节机制。
综上所述，蛋白质磷酸化对细胞代谢具有重要影响。
通过调节能量代谢、合成和分解等过程，以及信号通路的调节，它可以影响细胞内的代谢平衡。
深入了解和理解这一过程将有助于揭示疾病发展所涉及的代谢异常机制，并为未来的治疗和预防提供新的策略。
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磷酸化蛋白质的分析方法
试剂：
乙腈(Acetonitrile，ACN)，三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA) 购自
Merck 公司(Darmstadt，Germany)。尿素(urea)，氯化钠(Sodium chloride，NaCl)
购自Sigma 公司。甲酸(Formic acid，FA)、乙酸(Acetic acid，HAC)购自Aldrich(St.
Louis，MO，USA)。盐酸胍(Guanidine hydrochloride，GuCl)，二硫苏糖醇
(dithiothreitol，DTT)，碳酸氢铵(Ammonium bicarbonate)，碘乙酰胺(Iodoacetamide，
IAA) 购自Bio-Rad (Hercules，CA，USA)。胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega
(Madison，WI)。所有的化学品的纯度级别除了乙腈是色谱纯外都是分析纯。实
验所用水都经过Milli-Q system (Millipore，Bedford，MA，USA)处理。
样品制备
样品用2D 裂解液裂解（8 M Urea,4% CHAPS,65 mM DTT,40 mM Tris），
100W 30 s 超声后，15,000g 离心45 min。取上清，Bradford法定量；取500μg 样
品加入2ul 1M DTT，于37℃还原反应2.5h；再加入10ul 1M IAA 于室温避光烷基
化40min。100%丙酮沉淀过夜，100mM碳酸氢铵（pH 8.5）溶解样品，按50：1
加入胰蛋白酶酶解过夜。
磷酸化多肽的富集：
Loading buffer: (饱和glutamic acid/65%乙腈/2%TFA)
Wash buffer 1: (65%乙腈/0.5%TFA)
Wash buffer 2: (65%乙腈/0.1% TFA)
Elute buffer 1: (300mM氨水/50%乙腈)
1．100ul loading buffer 平衡TiO2 column；
2. 200ul loading buffer溶解样品(2mg)；
3.loading sample 到TiO2 column；
4. 100ul loading buffer wash TiO2 column；
5.100ul washing buffer 1 wash TiO2 column；
6. 100ul washing buffer 2 wash TiO2 column；
7. 100ul Elute buffer wash TiO2 column,收集Flow through ,冻干，准备MS分析。
质谱分析
Surveyor 液相色谱系统与轨道线性离子阱 (Orbi-Trap，Thermo Electron，
San Jose，CA)联用进行一维质谱鉴定。使用的反相色谱柱为75 μm×15 cm，填料
为C18(Column Technology，USA)。经过色谱柱的流速经过分流后为200 nL/min。
使用120 分钟的梯度洗脱酶解肽段，从2%到35%缓冲液B (0.1% 甲酸的乙腈溶
液)。Orbi-trap 离子传输毛细管的温度为160 °C。Nano 喷针电压为1.85 kV，碰
撞能量为35%。离子阱内的离子数由AGC(automatic gain control)自动控制。一级
质谱的扫描范围为400到2000 m/z，二级质谱通过data-dependent 模式触发，选择
强度在前十位的离子进行二级质谱分析。动态排除的时间为1.5 min，30 s 内重
复两次。
搜库：
液相色谱-串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,
LC-MS/MS)获得的MS/MS数据采用Mascot2.2程序搜索。参数设置为：蛋白酶为
胰蛋白酶，最大允许丢失的酶切位点为1个，静态修饰选为半胱氨酸的羧氨甲基
化，动态修饰选为丝、苏、酪氨酸的磷酸化(+79.98 Da)。母离子质量误差设为
200ppm,碎片离子的质量误差范围为±1 Da。
我们产生正反库,数据格式由原始的氨基酸序列(正库)与逆向的氨基酸序列
(反库)组成，目的是为了方便对数据的质量评价。搜库结果使用实验室编写的软
件进行整合，最终的筛选标准为磷酸化修饰肽段的假阳性率(False positive rate，
FPR)均小于1%，母离子误差为10ppm。