基因工程目的基因的获取
第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
查阅资料自学！
如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
基因工程主要流程
基因工程主要流程基因工程呀，那可老有趣啦。
基因工程的流程呢，有这么几个主要的部分。
一、目的基因的获取。
咱得先把想要的那个基因弄到手呀。
这就好比咱要做菜，得先把食材找着。
那怎么找这个目的基因呢？有好几种办法呢。
一种是从基因文库里面去淘。
基因文库就像是一个大仓库，里面存着各种各样的基因片段，咱就在这里面翻翻找找，看看能不能发现咱需要的那个基因。
还有一种办法是通过化学合成，如果这个基因的序列咱已经知道得很清楚了，那就像按照食谱做菜一样，咱可以人工把这个基因合成出来。
另外呀，要是知道这个基因在哪个生物体里，还可以用PCR技术，这个技术就像是一个精准的小助手，能把我们要的基因从生物体的基因组里给大量复制出来，这样我们就有足够的基因来进行后面的操作啦。
二、基因表达载体的构建。
有了目的基因之后呢，咱不能就这么直接把它放到受体细胞里呀，得给它造个小房子，也就是构建基因表达载体。
这个载体就像是一个小飞船，带着目的基因进入受体细胞。
这个载体里面呢，除了有目的基因，还有启动子、终止子这些重要的部件。
启动子就像是发动机的开关，它能让基因在受体细胞里开始表达，要是没有这个启动子，基因就像一辆没钥匙的汽车，发动不了。
终止子呢，就像是刹车，让基因的表达在合适的时候停下来。
而且呀，这个载体上通常还会有标记基因，这标记基因可有用啦，就像是给这个小飞船做个记号。
比如说我们用抗某种抗生素的基因做标记基因，那把这个构建好的载体放到含有这种抗生素的培养基里，能长起来的细胞就是成功导入了载体的细胞，就像在一群小朋友里，带着小红花的就是表现好的一样。
三、将目的基因导入受体细胞。
接下来就是把带着目的基因的载体送到受体细胞里去。
这个过程就像是送快递一样。
对于不同的受体细胞，送的方法还不一样呢。
如果受体细胞是植物细胞，我们可以用农杆菌转化法。
农杆菌就像是一个小邮差，它能自然地把我们构建好的载体送到植物细胞里面去。
还有基因枪法，就像用枪把基因载体像子弹一样打到植物细胞里。
论述基因工程的基本步骤
基因工程的基本步骤基因工程，也称为遗传工程，是一种对生物的遗传物质进行操作和改造的技术。
通过基因工程，科学家可以精确地修改生物体的基因，从而创造出具有特定性状的生物体。
以下是基因工程的基本步骤：1. 目的基因的获取：首先，研究人员需要确定他们想要修改的特定基因。
这些基因可能是与某种特定性状或疾病有关的基因。
然后，他们使用不同的方法，如反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、基因文库筛选或者基因组测序等，来获取这些基因的DNA片段。
2. 基因载体的选择与构建：基因载体是一种能够将目的基因带入细胞内的分子。
常见的基因载体有质粒和病毒。
构建基因载体时，需要在载体上加入特定的标记基因，以便在目的基因成功导入细胞后进行筛选。
3. 目的基因与载体的连接：这一步被称为“重组”，是基因工程的核心步骤之一。
在这一步中，研究人员使用限制性核酸内切酶（限制酶）将目的基因和载体切开，然后利用DNA 连接酶将目的基因和载体重新连接在一起。
4. 将目的基因导入受体细胞：此步骤是将重组后的DNA分子导入到宿主细胞中。
这个过程通常需要使用一种称为“转化”或“转染”的方法来完成。
5. 目的基因的检测与鉴定：这是最后一个步骤，涉及到对已经导入受体细胞的DNA进行检测和鉴定。
研究人员通常会使用特定的技术和方法，如聚合酶链式反应（PCR）扩增、DNA测序、限制性酶切分析和荧光原位杂交等，来验证目的基因是否成功导入受体细胞，以及目的基因是否表达。
以上就是基因工程的基本步骤。
需要注意的是，这些步骤并不是一次完成的，往往需要反复进行，并对结果进行评估和优化。
同时，这些步骤都需要严格遵守伦理和法律规范，以确保研究人员的安全以及保护被研究生物的权益。
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法目的基因的获取方法是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因的定位、克隆、转染等一系列操作。
在进行目的基因获取时，科学家们需要遵循一定的步骤和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
下面将介绍一些常用的目的基因获取方法。
首先，基因定位是获取目的基因的第一步。
通过PCR、Southern blotting等技术，科学家们可以准确地定位到目的基因在细胞或生物体中的位置，为后续的克隆和转染奠定基础。
其次，基因克隆是目的基因获取的关键步骤。
科学家们可以利用质粒、原核生物或酵母等载体系统，将目的基因从细胞或生物体中克隆出来。
这一过程需要利用限制性内切酶、连接酶等酶切和连接技术，以确保目的基因的完整性和准确性。
接着，目的基因的转染是获取目的基因的另一重要步骤。
科学家们可以利用质粒转染、病毒载体转染等技术，将目的基因导入到细胞或生物体中，实现其稳定表达和功能研究。
此外，目的基因的获取还可以通过基因编辑技术实现。
CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN等基因编辑技术可以精准地编辑基因组，实现目的基因的定点修饰和获取。
最后，为了确保目的基因的稳定性和可控性，科学家们还需要进行基因的筛选和鉴定。
通过PCR、Western blotting、荧光染色等技术，科学家们可以对目的基因进行筛选和鉴定，确保其在细胞或生物体中的准确表达和功能发挥。
总之，目的基因的获取是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因定位、克隆、转染、编辑、筛选和鉴定等一系列技术和步骤。
科学家们需要结合实际研究需求和具体操作，选择合适的方法和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
希望本文介绍的方法能够对相关研究工作提供一定的参考和帮助。
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法是基因工程领域中的重要步骤，它是指从生物体中获取特
定的基因序列的技术和方法。
目的基因的获取是进行基因克隆、基因表达和功能研究的前提和基础，因此对目的基因的获取方法进行深入了解和掌握对于基因工程研究具有重要意义。
首先，目的基因的获取方法可以通过PCR技术实现。
PCR是聚合酶链式反应
的缩写，它是一种能够在体外扩增DNA片段的技术。
通过PCR技术，可以利用引物将目的基因从生物体中扩增出来，然后进行纯化和测序，最终获取到目的基因的序列信息。
其次，目的基因的获取方法还可以通过基因文库筛选实现。
基因文库是将生物
体中的DNA片段进行分离、纯化并进行存储的库，研究者可以通过筛选基因文库
中的目的基因序列，然后进行克隆和表达，最终获取到目的基因的信息。
此外，利用基因克隆技术也可以实现目的基因的获取。
基因克隆是指将目的基
因从生物体中进行分离、纯化，并将其插入到载体中，然后通过转化等技术手段获得目的基因的方法。
最后，目的基因的获取方法还可以通过合成基因实现。
合成基因是指利用化学
合成的方法，根据目的基因的序列信息进行人工合成，然后进行表达和功能研究。
综上所述，目的基因的获取方法有多种途径，包括PCR技术、基因文库筛选、基因克隆和合成基因等。
研究者可以根据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法进行目的基因的获取，从而为基因工程研究提供有力支持。
基因工程中筛选目的基因的方法
基因工程中筛选目的基因的方法1. 核酸杂交筛选法！就像在茫茫人海中找到那个与你契合的灵魂伴侣一样，通过核酸杂交这个神奇的手段，能精准地找到我们想要的目的基因呢！比如我们想找一个特定的基因来治疗疾病，就可以用这个方法去把它揪出来。
2. 基因文库筛选法呀！这就好比是一个超级大的基因宝库，你可以在里面尽情地寻找你需要的宝藏——目的基因。
想象一下，在无数的基因中找到那个关键的它，多刺激呀！比如在寻找提高农作物产量的基因时，就可以利用这个方法嘞。
3. PCR 筛选法呢，哇塞，这可厉害了！简直就像拿着一个超级放大镜，一下子就能把目的基因给找出来。
比如说我们在研究一种新型病毒时，利用PCR 就能快速找到相关的目的基因啦。
4. 免疫筛选法，嘿嘿，就像是身体的免疫系统能精准识别敌人一样，通过免疫反应来找到特定的目的基因哟！例如要找一个用于生产抗体药物的基因，免疫筛选法就派上大用场啦。
5. 酶切筛选法呀，这就像是一个精准的剪刀，能把不符合要求的基因剪掉，留下我们想要的目的基因呢！打个比方，在改造某个生物特性时，就可以用这个方法来筛选基因啦。
6. 噬菌体展示筛选法，这可太有意思啦！就如同在一个热闹的基因集市上，让目的基因自己展示出来，然后我们轻松地把它挑出来。
比如要筛选出能特异性结合某种物质的基因，这不就正好可以用这个方法嘛。
7. 酵母双杂交筛选法，哇哦，这就像一个巧妙的牵线搭桥，能找到相互作用的目的基因呢！像探索蛋白质之间的关系时就能用它来找关键基因啦。
8. 基因芯片筛选法，好厉害的感觉哟！如同有一张超级基因地图，一下子就能锁定目的基因的位置。
好比在大规模基因分析中，这个方法就超有用的啦！总之，这些方法就像是一把把钥匙，能帮我们打开基因奥秘的大门，真的超级神奇啊！。
基因工程操作步骤
4.目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
合成
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）: 双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
b、复性（55℃-60℃）: 系统温度D降N低A ，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
③例: 转基因抗虫棉
2.将目的基因导入动物细胞
①方法: 显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因:
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌: 大肠杆菌
③常用法: Ca2+处理获得感受态细胞
④过程:
Ca2+处理 大肠杆菌
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾: 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因, 我们才能赋予
1.目的基因的获取 一种生物以另一种生物的遗 传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2.基因表达载体的构建 定存在, 并可进行遗传、表达 和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达,
3.目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。
基因工程基本操作的四个步骤
利用PCR技术扩增
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。
在PCR反应中，模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶以及适宜 的缓冲液系统被置于“热循环”的反应环境中，通过精确控制温度，在DNA聚合 酶作用下高特异性、高灵敏度地扩增目的基因。
受体细胞的选择
01
02
03
原核细胞
适用于细菌等原核生物作 为受体细胞，如大肠杆菌。
真核细胞
适用于动物和植物细胞作 为受体细胞，如CHO细胞、 动物胚胎细胞、植物愈伤 组织等。
受精卵
适用于动物基因工程，直 接将目的基因导入受精卵， 实现基因的长期稳定表达。
转化或转染方法
01
02
03
04
化学转化法
利用CaCl2、MgCl2等化 学试剂诱导细菌感受态 细胞的产生，吸收外源 DNA。
载体的构建过程
目的基因的获取和修饰
从供体细胞中获取目的基因，并进行 必要的修饰，如限制性酶切、连接等。
载体的获取和修饰
从宿主细胞中获取载体，并进行必要 的修饰，如限制性酶切、连接等。
目的基因与载体的连接
将目的基因与载体进行连接，形成重 组DNA分子。
重组DNA分子的转化
将重组DNA分子导入到宿主细胞中， 并使其在宿主细胞中复制和表达。
03 目的基因与载体的连接
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸 序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸
之间的磷酸二酯键进行切割的酶。
限制性核酸内切酶的识别位点通常是DNA双链上的特 异序列，这种序列通常由4-6个核苷酸组成。
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组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN有基人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或 衔接物（Linker）序列。
EcoRI Adaptor EcoRI Linker
DNA合成仪
第三节 PCR扩增获得目的基因
以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在 累述。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR 基因放大连琐反应
第五章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
需要克隆的DNA片段
编码某种蛋白质
研究某基因与 疾病的关系
研究某基因结构 和功能的关系
目的基因的获取
化学合成法 直接从染色体DNA中分离
聚合酶链式反应基因组DNA;cDNA文 库第一节 基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。
2. 互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断。
染色体
PCR 可以把 指定的种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断都与 适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保 存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有 了2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
（3）DNA溶液小孔喷射
注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10 kb左右 的片段。
第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb3. 基因构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。
④人工接头法（adapter）
同
一 限
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应制酶G CCTGGATCC G切
位
目的基因用 Bam HⅠ切割
G
载体DNA用Bam HⅠ切割
GATCC
点
+ CCTAG
G
连
G CCTAG
GATCC G
带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一 个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 ③ 用酸或碱的脱保护
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2.亚磷酸三酯法
原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连 接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去， 所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的， 具体的合成和延伸过程如图。
酶切
1. 优点
由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化
1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数
二、 化学合成DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 1. 互补连接法
（1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补区 域，不同片断之间的互补区域能形成有断 点的完整双链。
（2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带
上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
（3）连接酶连成完整双链 T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
影响所切出的产物的长度和随机程度。
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
① 物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接
② 平端连接
③同聚物加尾连接
要求：1、已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备
* 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
一、目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ② 带保护的单核苷酸连接