应用双重PCR检测产毒素多杀性巴氏杆菌

应用双重PCR 检测产毒素多杀性巴氏杆菌唐先春,吴　斌3,刘国平,刘建杰,王大鹏,陈焕春　(华中农业大学动物病原微生物实验室,湖北武汉430070)摘要:参照有关文献设计了2对引物,分别扩增多杀性巴氏杆菌的Km t 及toxA 基因,以使同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌。

该PCR 能检出103cfu 菌量的模板。

特异性试验表明,这2对引物都不能从猪的其他6种常见病原菌扩出特异性的带。

对扩增的2个PCR 产物测序结果表明,2序列都有很高的保守性,从而进一步证明了该PCR 方法的特异性及灵敏性。

临床应用,从386份病料分离出66株多杀性巴氏杆菌,其中有8株均能同时扩出457bp 和864bp 的片段,而其他54株只能扩出457bp 的片段。

关键词:产毒多杀性巴氏杆菌;PCR ;检测中图分类号:S 852161 文献标识码:A 文章编号:100524545(2005)0420374202 收稿日期:2004202217 基金项目:湖北省科技攻关项目(2001AA 201) 作者简介:唐先春(19792),男,硕士。

E 2m ail:xianchuntang@tom .com 3通讯作者,T el :027********* 产毒素多杀性巴氏杆菌(Tox igen ic P asteu rella m u ltoci 2d a ,T +Pm )是猪进行性萎缩性鼻炎(P rogressive atroph icrh in itis ,PA R )的主要原菌。

该病是养猪业最常见的传染病之一[1,2]。

多杀性巴氏杆菌作为一种常见病原菌,可引起猪肺疫,但产毒素多杀性巴氏杆菌仅存在于患有RA P 的猪。

T +Pm 与T -Pm 在形态特征及生化特性上没有区别。

T +Pm 产生一种约145000的皮肤坏死毒素(dermonecro tic tox in ,DN T ),该毒素由toxA 基因编码。

一般认为,T -Pm 不会导致PA R ,而少量提纯的DN T 可以复制出PA R 。

因此,DN T 是区分T +Pm 与T -Pm 的关键,也是诊断PA R 的关键[3～5]。

基于T +Pm 毒素的特性,已经建立了一些区分T +Pm 与T -Pm 的方法,如豚鼠皮肤坏死试验、小鼠致死试验、细胞促生长试验、胎牛肺细胞毒性试验、EL ISA 等,但这些方法操作繁琐,且灵敏性与特异性都不太好。

本试验旨在建立快速特异的PCR 方法,以同时检测并区分T +Pm 与T -Pm 。

1　材料与方法111　菌株　T +Pm 及T -Pm ,均由本实验室分离鉴定。

对照菌株:胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血博氏杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌,由本实验室保存。

112　PCR 引物 P 1:5′2A TC CGC TA T T TA CCC A GT GG 23′ P 2:5′2GCT GTA AA C GAA CTC GCC A C 23′ P 3:5′2CT T A GA T GA GCG A CA A GG 23′ P 4:5′2GAA T GC CA C A CC TCT A TA G 23′引物P 1、P 2检测Pm ,扩增片段为457bp [6];引物P 3、P 4检测T +Pm ,扩增片段为864bp [7]。

由上海生工合成。

113　PCR 模板　用接种环挑取单菌落,悬浮于含50ΛL 无菌水的离心管中,100℃水浴中煮5～10m in ,然后迅速置于冰上冷却5m in ,10000r m in 离心2m in ,上清即为PCR 模板。

114　PCR 反应体系(30ΛL )　10×T aq Buffer 310ΛL ,25mmo l L M gC l 2015ΛL ,2Λmo l L dN T P s 015ΛL ,20Λmo l L上、下游引物各015ΛL ,T aq DNA 聚合酶015ΛL ,无菌水14ΛL ,模板10ΛL 。

115　PCR 扩增条件优化　用HN 213T +Pm 菌株进行PCR ,对PCR 各循环参数进行优化,以确定最佳模式。

116　PCR 特异性及敏感性　用所设计的引物对T +Pm 、对照菌株和T -Pm 进行PCR 扩增,以检测其特异性;将HN 213菌株37℃培养18h ,用灭菌PBS 洗脱,平板计数后,10倍系列稀释,按113方法处理,再进行PCR ,以测定该PCR 的敏感性。

117　PCR 结果观察　取PCR 扩增反应产物10ΛL 和分子量标准5ΛL ,加到含EB 的018%琼脂糖凝胶中,在80V 电压下电泳30m in ,然后在紫外线灯下观察。

118　PCR 产物回收及测序　胶回收试剂盒购于上海生工。

将分离到的第1株多杀性巴氏杆菌按使用说明分别回收457bp 及486bp 的PCR 产物,将回收的PCR 产物送大连宝生物测序。

以后PCR 扩增时用其做阳性对照。

119　PCR 检测的初步应用　将临床采取的病料(肺脏、鼻拭子)划线接种于T SA 平皿,37℃培养18～24h ,挑取可疑菌落,同113和114方法做PCR 。

2　结果211　PCR 扩增条件优化　通过对PCR 条件的优化,筛选出最佳PCR 扩增程序:94℃变性4m in ,然后进入30个循环,94℃30s 、56℃30s 、72℃40s ,最后72℃延伸10m in 。

图1　PCR 特异性试验扩增产物电泳图　11链球菌;21葡萄球菌;31大肠杆菌;41胸膜肺炎放线杆菌;51副猪嗜血杆菌;61支气管败血博氏杆菌;71T -Pm ;81T +Pm ;91阴性对照;M 1DL 2000M arker212　PCR 特异性及敏感性　对T +Pm 、对照菌株、T -Pm 进行PCR 扩增,结果T +Pm 出现2条与试验设计片段大小一致的条带;T -Pm 扩出1条特异性带;6种对照菌扩增结果为阴性(图1)。

敏感性试验结果,P 1和P 2最低能检出103cfu 菌量的模板,P 3和P 4最低能检出102cfu 菌量的模板(图2)。

213　PCR 产物测序　PCR 产物测序均测1个反应,以验证所扩增片段是否为Pm 基因。

P 1和P 2扩增产物测出了428bp ,P 3和P 4产物测出了660bp 。

将测序结果在N CB I 上进行BLA ST 对比,发现它们分别与Pm 的Km t 和T oxA 基因同源性为9716%～9918%。

图2　PCR 敏感性试验扩增产物电泳图　1～71分别为100～106cfu菌量的模板;M 1DL 2000M arker214　临床应用　从386份病料(97份为鼻拭子,389份为病肺)分离出66株Pm ,其中有8株为T +Pm 。

3　讨论 本试验用2对引物同时扩增出多杀性巴氏杆菌Km t 基因(T +Pm 、T -Pm 都有)和产毒素多杀性巴氏杆菌toxA 基因。

用这2对引物对所分离的66株多杀性巴氏杆菌进行PCR 扩增,其中有8株均能得到457bp 和864bp 的片段,而其他54株只得到457bp 的片段;对猪的其他6种常见病原菌进行扩增,结果均未见特异性条带。

由此可见,该引物有很强的特异性。

因此,本试验建立的PCR 方法可用于诊断猪进行性萎缩性鼻炎,同时可用于诊断猪巴氏杆菌病。

敏感性试验结果显示,该PCR 技术对T +Pm 的最低检出量为102cfu ,对Pm 的最低检出量为103cfu ,如此痕量的病原都能被检出,而且可以直接从第1代培养物中检测,从而降低了漏检的可能性。

另外,该方法无需提取细菌的基因组,操作简便。

PCR 从基因水平检测T +Pm ,比传统检测T +Pm 的方法简便、灵敏,更有说服力。

PCR 产物测序结果表明,本试验所扩的2段基因都相当保守。

P 1和P 2所扩增的产物与N CB I 上所发布的7个Km t 序列(A Y 225342、A Y 225343、A Y 157572、A Y 225341、A E 006174、A F 016259、A Y 225344)同源性都在9716%～9918%。

P 3和P 4所扩增的产物,对其测序1个反应,测出660bp ,与N CB I 上所发布的4个toxA 全序列相比较,与其中3个序列(A F 240778、Z 28388、X 52478)同源性达到100%,与另外1个序列(X 51512)只有2个碱基的差异,同源性9917%。

这进一步证明了该PCR 检测的特异性及灵敏性。

临床应用,分离出的8株产毒素多杀性巴氏杆菌,其病料都是鼻拭子,而且均来源于有一定的萎缩性鼻炎症状的猪,没有从有肺炎症状猪的肺脏中检测出产毒素多杀性巴氏杆菌,但从某些有肺炎病变猪的肺脏检测并分离出了不产毒素的多杀性巴氏杆菌。

参考文献:[1]　斯特劳.猪病学[M ].第8版.赵德明,张中秋,沈建忠,译.北京:中国农业大学出版社,2000.[2]　陈焕春.规模化猪场疫病控制与净化[M ].北京:中国农业出版社,2000.[3]　Toyo tsugu N akai ,A k ira Saw ata ,M asayo sh i ,et al .Characteriza 2ti on of dermonecro tic toxin p roduced by sero type D strains of Pasteurella m ultocida [J ].Am J V et R es ,1984,45(11):241022413.[4]　Dom inick M A ,R i m ler R B .T urbinate atrophy in gno tobi o ticp igs intranasally inoculated w ith p ro tein toxin iso lated from type D Pasteurella m ultocida [J ].Am J V et R es ,1986,47(7):153221536.[5]　Pauline M ,M arten F ,Ger de V ries ,et al .Intranasal adm inistra 2ti on of Pasteurella m ultocida toxin in a challenge 2expo sure model used to induce subclinical signs of atroph ic rh initis in p igs [J ].Am J V et R es ,1994,55(1):49254.[6]　K irsty M Tow nsed ,A lan J F ro st ,Ch iang W L ee ,et al .D evelop 2m ent of PCR assays fo r species 2and type 2specific identificati on of Pasteurella m ultocida iso lates [J ].J C lin M icrobi o l ,1998,36(4):109621100.[7]　L ich tensteiger C A ,Steenbergen S M ,L ee R M ,et al .D irectPCR analysis fo r toxigenic Pasteurella m ultocida [J ].J C lin M i 2crobi o l ,1996,34(12):303523039.D etection of Tox igen ic P asteu rella m u ltocida by D iplex PCRTAN G X ian 2chun ,W U B in 3,L I U Guo 2p in ,L I U J ian 2jie ,W AN G D a 2p eng ,CH EN H uan 2chun (A n i m a l P a thog en ic B acteria L abora tory of H uaz hong A g ricu ltu ra l U n iversity ,W uhan 430070,Ch ina ) Abstract :Tw o sets of specific p ri m ers w h ich amp lify Km t and T oxA gene of P asteu rella m u ltocid a separately w ere de 2signed ,so as to detect and iden tify tox igen ic and non tox igen ic P .m u ltocid a at the sam e ti m e .A s little as 103cfu of T +Pm tem 2p late can be detected by th is PCR .Specificity test show ed that the tw o sets of p ri m ers can no t amp lify DNA p roducts from 6o ther s w ine pathogen ic bacteria .T he sequencing resu lt of the tw o PCR p roducts indicated that Km t and toxA gene w ere qu ite con servative .It fu rther confirm ed the specificity and sen sitivity of th is di p lex PCR .Six ty 2six P .m u ltocid as w ere iso lated by u s 2ing th is PCR ,w ith in them ,8iso lates can amp lify bo th 457base pair and 864base pair DNA p roducts ,and 54iso lates can on ly amp lify 457base pair DNA p roduct . Key words :tox igen ic P asteu rella m u ltocid a ;PCR ;detecti on 3Corresp ond ing au thor。