Western基本步骤
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Western基本步骤
Westen blot
一、配胶
(一)安装胶架
(二)配胶
1、分离胶:10%(10ML)
O 4 ml
DdH
2
30%Acr 3.3ml
Tris-Hcl(8.8) 2.5ml
10%SDS 0.1ml
10%过硫酸铵AP 0.1ml
TEMED O.OO4ML
2、积层胶: 4ml
O 2.7 ml
DdH
2
30%Acr 0.67ml
Tris-Hcl(6.8) 0.5ml
10%SDS 0.04ml
10%过硫酸铵AP 0.04ml
TEMED O.OO4ML
注意事项:1、TEMED催化AP产生自由基,加速Acr凝胶聚合,一般于4度存放。
不宜多加,否则胶易变硬脆裂。
2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性,要注意防护。易挥发,使用后立
即盖紧瓶盖,佩戴PE手套。
3、每加完一样晃匀,TEMED最后加。
(三)灌胶
1、分离胶1ml枪吹打均匀,避免气泡,尽快灌入固定好的玻璃板中。
O,压平分离胶界面。待胶凝后可见分割折线。
2、分离胶上灌满ddH
2
O,分隔线先清楚后不清楚,待胶凝后又可见。
可用乙醇代替ddH
2
O,用滤纸吸干。
3、分离胶凝后,倒去顶部ddH
2
4、积层胶1ml枪吹打均匀,灌入玻璃板中至顶部。
5、插入梳子,注意梳子底部应无气泡。略倾斜插入梳子可避免出现气泡
6、20-30分钟后胶凝。
二、电泳
(一)准备
1、装上电泳装置,倒入1*电泳液。先倒内槽(新)没过短玻璃板,如内槽不漏液再加外槽,没过钢丝电极即可,内外槽不能相通。
2、拔出梳子(用力均匀缓慢拔出),用10vl枪点样。
(二)上样和电泳
1、10vl枪点样。(1.0胶最大上样量30vl,0.75胶最大上样量25vl)
2、样尽量点在中间孔位,空孔位用残样或5*buffer填补,避免边缘效应,使电流在胶板中均匀分布。
3、maker 3-3.5 vl。Maker一般-20℃保存,尽快上样尽快放入冰箱。
4、盖上电泳槽,接通电源。积层胶电压80V,分离胶160V。电
流28mA。(恒压80V待Maker变红,转为160V,待成为一条直线)注意事项:1、枪头顶着泳道正上方加样。
2、电泳时温度上升,用冰袋围绕电泳仪使降温。
3、跑分离胶电压在130-160V之间,低于130V时时间较长,高于150V时较快
但温度高电压大易烧坏胶。
4、细胞蛋白上样10vl左右,组织蛋白上样20vl左右。
5、当需要上样量较大或超过孔位最大上样量时,可先加一部分样跑电泳,然后再加剩下样本,使全部分样本在积层胶内汇集。
三、转膜(湿法)
1、电泳结束后,撬开短玻璃板,切去积层胶,浸泡于转膜液。
2、用直尺或梳子量出凝胶大小,按尺寸剪滤纸和硝酸纤维素滤膜(PVDF膜)。
3、PVDF膜先浸入泡膜液(甲醇)中活化,然后放入转膜液中清洗。
4、海绵,滤纸,膜湿润,阴极电极(黑面)在下,从下到上顺序为:海绵,滤
纸,胶,膜,滤纸,海绵。膜与胶精准对齐,盖好滤纸后用玻璃棒赶出气泡。
5、转膜一般为80Ma,2小时。当目标蛋白为72bp以上时转3h,72bp以下时转
1.5-2h。(210V,200MA,时间根据蛋白分子量来定)
注意事项:1、撬胶时尽量把胶留在厚板上,记录上样顺序。
2、滤纸为3层,可重复利用,但最好使用1-2次后更换。
四、染胶
考马斯亮蓝染料浸染,摇床5h。使用脱色液脱去多余染料,可见胶中有蛋白的部位出现蓝色条带,证明胶中相应条带有目的蛋白。
在转膜前染胶可验证所提蛋白中是否有目的蛋白;在转膜后染胶验证转膜知否彻底。
五、染膜
丽春红染料染膜,可见膜上有蛋白的部分出现红色条带,沿条带剪膜可避免漏剪或剪歪。用dd水即可洗净染料。
六、封闭
把膜放入装有封闭液的塑封袋中,一张膜1ml左右。30°摇床1h。
O加入0.3g。
封闭液为3%BSA(牛血清蛋白),10mlddH
2
注意事项:1、首次做蛋白时可不做封闭,此时膜显色后背景较深。看情况需要背景较浅时可做封闭。
2、封闭液4℃保存
七、结合一抗
1、蛋白一抗:稀释液为含有1%BSA的TBST(稀释的比例按说明说来进行条件摸索)
2、将膜放入相应的塑封袋中,拍出气泡,4℃摇床过夜(12h)或常温2h摇床。
3、一张膜1.5ml左右,2张膜2-3ml,2张一起时膜的背面相贴。
注意事项:1、一抗放4℃保存半个月,可重复利用多次。应一抗价格昂贵一般使用3-4次。
2、稀释抗体使用含有1%BSA的TBST溶液。
八、结合二抗
1、取出一抗回收,膜使用1*TBST清洗,摇床,7min一次,洗三次。(LST 15min*2+5min*4 荧光二抗 10mlBSA:1ul二抗 1小时)
2、将滤膜放入有二抗的塑封袋中,去除气泡,37℃孵育30-40min。最好是30℃孵育1h。
二抗稀释比1:7500,配10ml。或7.5mlTBS-T(含1%BSA)水中加入10μl二抗,3.5ml中加0.5μl二抗。
注意事项:二抗放4℃保存半个月,可重复利用,二抗无特异性较便宜一般使用3-4次。
九、染色
1、取出二抗回收,膜使用1*TBS-T清洗,摇床,5min一次,洗