分子生物学(杨建雄)

分子生物学（杨建雄）第一章绪论分子生物学1.概念广义：在分子水平上研究生命现象，或用分子的术语描述生物现象的学科侠义：在核酸与蛋白质水平上研究基因的复制，基因的表达和调控，及基因的突变与交换的分子机制2.研究内容：①以某物种全套基因表达产物的结构和功能②基因传递和表达的途径③基因表达的调控3.三大原则①构成生物大分子的单体是相同的——共同的核酸语言（Nt）、共同的蛋白质语言②生物遗传信息的表达的中心法则相同③生物大分子里面，单体（核苷酸、氨基酸）的排列是不同的4.分子生物学的兴起①Mendel 豌豆杂交实验总结了基因的分离定律和自由组合定律表明生物的遗传性状是由独立的遗传因子决定，这些遗传因子后来被称作基因②遗传的染色体学说，染色体是基因的载体证实：1910年Morgan 利用果蝇进行遗传学实验发现了基因的连锁规律③“一个基因一个酶”假说1941年George Beadle和Edward Tatum 以红色面包霉为研究对象④核素1869年瑞士Miescher他的学生Altmann提出了核酸的概念⑤1910年德国Kossel 首次分离得到单核苷酸，并阐明核酸的主要成分是核糖、磷酸和碱基⑥1924年德国Feulgen 发现核酸中的糖有核糖和脱氧核糖两种，并根据核酸所含核糖的不同，将核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸⑦1929年Kossel学生Levine发现核酸中的碱基主要是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。

还证明核酸是由核苷酸组成的，而核苷酸是由碱基、核糖、磷酸组成的⑧1944年Avery通过肺炎链球菌转化实验证明基因是由DNA构成的1952年Hershey和Chase 利用噬菌体感染细菌实验，证实了DNA是遗传物质⑨1950年Chargaff指出DNA中四种碱基的比例关系：A/T=G/C=1⑩1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型（分子生物学兴起的标志）5.分子生物学的发展①关于基因的复制1958年Meselson和Stahl 同位素实验证实DNA复制的半保留机制1956年Arthur Kornberg 等首先在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶Ⅰ1989年Greider等发现端粒酶是以内源性RNA为模板的逆转录酶②关于基因的转录1955年Brachet 洋葱根尖和变形虫实验、Hall和Spiegelman T2噬菌体DNA-RNA杂交实验证实蛋白质合成模板是RNA；1958年Crick提出著名的中心法则1960年Weiss和Hurwitz 发现RNA聚合酶③关于基因的翻译1954年Gamow 推测遗传密码是三联体1961年Crick，Barrett和Brenner等用插入和缺失突变证实了遗传密码是三联体Nirenberg和Khorana破译遗传密码④关于基因表达的调控1961年Jacob和Monod提出基因表达的操纵子学说1976年Tonegawa 发现免疫球蛋白的体细胞重组机制......⑤基因过程的兴起1964年Holliday 提出了DNA重组模型DNA连接酶、逆转录酶、限制性内切核酸酶等加速分子生物学发展进程的一项“简单而晚熟”技术聚合酶链反应（PCR）技术1985年Mullis第二章核酸的结构和功能DNA是主要的遗传物质1869年瑞士Miescher 从细胞核中分离出含磷很高的酸性化合物，称为核酸1889年他的学生Altmann提出了核酸的概念1910年德国Kossel 首次分离得到单核苷酸，并阐明核酸的主要成分是核糖、磷酸和碱基1924年 德国 Feulgen 发现核酸中的糖有核糖和脱氧核糖两种，并根据核酸所含核糖的不同，将核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸1929年 Kossel 学生 Levine 发现核酸中的碱基主要是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。

还证明核酸是由核苷酸组成的，而核苷酸是由碱基、核糖、磷酸组成的1944年 Avery 通过肺炎链球菌转化实验证明基因是由DNA 构成的 1952年 Hershey 和Chase 利用噬菌体感染细菌实验，分别用35S 标记噬菌体T2的蛋白质，用32P 标记噬菌体T2的DNA 。

进一步证实了DNA 是遗传物质核酸的组成成分核苷连接方式：核糖的1’碳原子通常与嘌呤碱的第9位氮原子或嘧啶碱的第1位氮原子相连在tRNA 中有少量尿嘧啶的第5位碳原子与核糖的1’碳原子相连，这是一种碳苷，称为假 尿苷比较 戊糖 含氮碱基 合成的直接原料DNAD -2-脱氧核糖腺嘌呤A 鸟嘌呤G 胞嘧啶C 胸腺嘧啶T 脱氧核苷三磷酸（dATP ,dGTP ,dCTP ,dTTP ） RNA D -核糖腺嘌呤A 鸟嘌呤G 胞嘧啶C 尿嘧啶U核苷三磷酸（ATP ,GTP ,CTP ,UTP ）核酸核苷酸 磷酸核苷戊糖含氮碱基分类：①由嘌呤形成的核苷：顺式和反式②由嘧啶形成的核苷：只有反式表示方式：①核苷用单字符号（A,G,C,U）②脱氧核苷（dA,dG,dC,dU）③常见的修饰核苷符号：Ⅰ：次黄苷或肌苷；X：黄嘌呤核苷；D：二氢尿嘧啶核苷；ψ：假尿嘧啶核苷核苷酸核苷中的核糖有3个自由的羟基，均可被磷酸酯化，分别生成2’-.3’-,5’-核苷酸脱氧核苷酸的五碳糖上只有2个自由羟基，只能生成3’-和5’-脱氧核苷酸腺苷酸AMP 鸟苷酸GMP脱氧核苷酸在英文缩写前加d，dAMP,dGMP等用酶水解DNA或RNA，得到5’-核苷酸、3’-核苷酸在核苷符号左侧加p表示5’-核苷酸，右侧加p表示3’-核苷酸如pA表示5’-腺苷酸，Cp表示3’-胞苷酸若为2’-磷脂酸，则需标明Gp2’表示2’-鸟苷酸ADP（腺苷二磷酸）：AMP与一分子磷酸结合ATP（腺苷三磷酸）：ADP与一分子磷酸结合核苷三磷酸化合物在生物体的能量代谢中起着重要作用所有生物系统化学能的转化和利用中普遍起作用的是ATP其他核苷三磷酸参与特定的代谢过程：UTP参与糖的互相转化与合成CTP参与磷脂的合成GTP参与蛋白质和嘌呤的合成腺苷酸也是一些辅酶的结构成分①烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶Ⅰ，NAD+）②烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶Ⅱ，NADP+）③黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）核苷酸的性质1.核苷酸的碱基具有共轭双键结构，故核苷酸在260nm左右有强吸收峰2.核苷酸的碱基和磷酸基均含有解离基团DNA的一级结构：各核苷酸残基沿多核苷酸排列的顺序，核苷酸间的连接键是3’,5’-磷酸二酯键DNA的二级结构（DNA双链的螺旋结构）DNA双螺旋结构的实验依据✧X-射线衍射数据✧Chargaff规则：DNA中腺嘌呤和胸腺嘧啶的数目基本相等，胞嘧啶和鸟嘌呤的数目基本相等✧DNA的滴定曲线DNA双螺旋结构的要点1)DNA分子由两条方向相反的平行多核苷酸链构成，一条链的5’-末端与另一条链的3’-末端相对，两条链的糖-磷酸交替排列形成的主链沿共同的螺旋扭曲成右手螺旋2)两条链上的碱基均在主链的内侧，并遵循碱基配对规则（一条链上的A一定与另一条链上的T配对，G一定与C配对）3)成对碱基大致处于同一平面，该平面与螺旋轴基本垂直，相邻碱基对平面间的距离为0.34nm。

形成碱基堆积力，螺旋桨式的扭曲有利于提高碱基堆积力4)DNA双螺旋的表面可以看到一条连续的大沟和一条连续的小沟5)大多数天然DNA属双链DNA，某些病毒的DNA为单链DNA6)DNA分子有一定的刚硬性和柔韧性，双螺旋结构可以发生一定的变化而形成不同的类型或三级结构①A-DNA、B-DNA、Z-DNA②回文顺序（反向重复顺序/二重对称结构）：一条链碱基序列的正读与另一条链碱基序列的反读是相同的。

✧这些序列易形成发夹结构或十字架结构✧有些回文顺序可以作为限制性核酸内切酶的识别位点✧这些回文顺序形成的发夹结构在转录的终止，或转录活性的调控方面发挥重要作用③DNA的镜像重复结构，可能形成三螺旋结构DNA的高级结构——环状DNA的超螺旋结构双链环状DNA可进一步扭曲成超螺旋DNA，这种结构还可称为共价闭环DNA。

若超螺旋DNA的一条链断裂，分子将释放扭曲张力，形成松弛环状DNA（开环DNA）若超螺旋DNA的两条链均断裂，就会转化为线性DNADNA中一条链绕另一条链的总次数定义为连环数（L）双螺旋的圈数定义为扭转数（T）超螺旋数定义为缠绕数（W）真核生物染色体的结构●双螺旋DNA分子先盘绕组蛋白形成核小体，许多核小体由DNA链连在一起构成串珠状结构●每个核小体的直径为11nm，它是由DNA分子在组蛋白核心的外面缠绕约1.75圈（约146bp）构成的●组蛋白分为H1,H2A,H2B,H3和H4五种●核小体的核心含H2A,H2B,H3和H4各两分子，这四种组蛋白C端富含疏水氨基酸，N端富含带正电荷的碱性氨基酸●串珠状结构进一步盘绕成直径30nm的螺线管形，每圈6个核小体●螺线管与染色体骨架蛋白质结合形成大的突环结构，称之为超螺线管，经进一步折叠形成微带结构，最后折叠成染色体RNA的结构与功能tRNA（转运RNA）1)主要作用：将氨基酸转运到核糖体-mRNA复合物的相应位置用于蛋白质合成2)结构：1965年Holley等三叶草型结构3)平均沉降系数：4S4)四环四臂：✧四环：D环（二氢尿嘧啶环）、反密码子环、可变环、TψC环①D环：负责和氨基酰tRNA聚合酶结合②TψC环：此臂负责和核糖体上的rRNA识别结合③可变环：从4Nt到21Nt不等，其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连结两个区域（D环-反密码子环和TψC环-受体臂）④反密码子环：在氨基酸臂对面的单链环，负责识别反密码子✧四臂：D臂、氨基酸臂、反密码子臂、TψC臂rRNA（核糖体RNA）1)主要功能：核蛋白体组成成分，负责蛋白质合成2)核糖体可分为大小两个亚基:✧原核生物的小亚基沉降系数为30S，含有1种沉降系数为16S的rRNA，大亚基为50S，含有5S和23S两种rRNA✧真核生物的小亚基40S，含有18S的rRNA，大亚基为60S，含5S、5.8S、28S三种rRNAmRNA（信使RNA）主要功能:负责用从DNA转录的遗传信息指导蛋白质的合成，其编码区的核苷酸序列决定相应蛋白质的氨基酸序列内含子和外显子大多数真核基因都是由蛋白质编码序列和非编码序列两部分组成。

编码的序列称为外显子，是一个基因表达为多肽链的部分；非编码序列被称为内含子，又称插入顺序（IVS）。

内含子只转录，在前mRNA时被剪切掉核酸的性质1.水解核酸的酶类(1)按作用的底物分：①核糖核酸酶（RNase）✓牛胰核糖核酸酶（RNaseⅠ）：专一性内切酶，水解产物为3’-嘧啶核苷酸和以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸✓核糖核酸酶T1：水解产物为3’-鸟嘌呤核苷酸和以3’-鸟嘌呤核苷酸结尾的寡核苷酸②脱氧核糖核酸酶（DNase）✓牛胰脱氧核糖核苷酸酶（DNaseⅠ）：可以将单链或双链DNA水解为平均长度为4个核苷酸的，以5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸✓牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡ）：可以将单链或双链DNA水解为平均长度为6个核苷酸的，以3’-磷酸为末端的寡聚核苷酸③非特异性核酸酶：既能水解DNA又能水解RNA(2)按水解部位分：①内切核酸酶②外切核酸酶2.紫外吸收性质3.结构的稳定性✧碱基对间的氢键✧碱基堆积力✧环境中的正离子4.核酸的变性➢核酸的变性：双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程➢变性只涉及次级键的变化，磷酸二酯键的断裂称核酸降解➢增色效应：核酸变性后，260nm的紫外吸收值明显增加➢熔解温度（T m）：紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度值➢双链RNA比双链DNA稳定➢影响T m的因素：①G-C对含量：含量越高，T m越高②溶液的离子强度③溶液的pH④变性剂5.核酸的复性➢核酸的复性：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程➢退火：变性核酸复性时需缓慢冷却➢减色效应：核酸复性后，核酸的紫外吸收降低➢影响复性速度的因素：①复性的温度②单链片段的浓度③单链片段的长度④单链片段的复杂度⑤溶液的离子强度核酸的研究方法1.提取与沉淀核酸的提取：(1)RNA的提取：①稀盐溶液提取法②苯酚水溶液提取法(2)DNA的提取：浓盐法核酸的沉淀：✓有机溶剂沉淀法✓等电点沉淀法✓钙盐沉淀法✓选择性溶剂沉淀法2.电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.超速离心：密度梯度离心法4.分子杂交(1)Southern印迹法/杂交(2)Northern印迹法/杂交5.DNA芯片技术及应用基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列技术(1)基本原理：将大量已知或未知序列的DNA片段固定于支持物尼龙膜或玻璃片或金属表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量(2)五个基本步骤：生物学问题、样品制备、生物化学反应、检测、数据模型分析6.DNA的化学合成(1)合成四步反应：脱三苯甲基、缩合、盖帽、氧化(2)合成后处理：切割、脱保护、纯化核酸的序列测定1.链终止法2.焦磷酸测序技术第三章基因和基因组基因✧1909年，丹麦的Johannsen首先使用基因一词✧1955年，Benzer提出顺反子、突变子和重组子的概念✧1958年，Crick提出中心法则①DNA是自身复制的模板②DNA通过转录作用将遗传信息传递给中间物质RNA③RNA通过翻译作用将遗传信息表达成蛋白质④RNA自我复制，可在逆转录酶作用下合成DNA✧1961年，Jacob和Monod提出操纵元学说，将基因分为结构基因、调节基因、操作子和启动子结构基因：为蛋白质或RNA编码的基因启动子：一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA 准确结合并具有转录起始的特异性。