淀粉酶的制备及活力测定
实验二十一固定化α-淀粉酶及活性测定
PART C 酶工程实验实验二十一固定化α-淀粉酶及活性测定一、实验目的和原理目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。
交联剂为戊二醛，载体为甲壳素。
二、实验器材1．恒温水浴锅2．恒温振摇仪三、实验试剂1. 5%戊二醛2. 甲壳素3. 碘原液：称取碘1.1g。
碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。
再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50ml。
摇均后放于棕色试管中备用。
4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。
5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。
然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。
6. pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。
7. 标准终点色溶液，A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸钾（K2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。
混合液在15天内使用有效。
四、实验操作（一）酶液的制备精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。
将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。
最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。
项目二-淀粉酶的制备及活力测定
五、实验结果
编号 吸光值 计算用的吸光值
I-1 0.022 0
I-2 0.047 0.025
I-3 0.115 0.093
(三）α-淀粉酶活力测定： ① 取试管3支 ② 于每管中各加入酶液1mL，在70℃±0.5℃恒温 水浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。取出 后迅速用流水冷却。 ③ 在对照管中加入4mL0.4mol/L氢氧化钠。 ④ 在4支试管中各加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。 ⑤ 将4支试管置于恒温水浴中，40℃±0.5℃保温 15min，再向各管分别加入40℃下预热的1%淀 粉液2mL，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计 时保温5min。取出后向测定管迅速加入 4mL0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
（一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净 的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂。 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水 冷却，加蒸馏水定容至25ml。以1号管作 为空白调零点，在520nm波长下比色测定， 记录吸光度。以麦芽糖含量为横坐标，吸 光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
管号 麦芽糖 标准液 蒸馏水 麦芽糖 含量 3，5二硝基 水杨酸
淀粉酶的制备及活力测定
指导老师：
一、淀粉酶
• 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通 常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料， 由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的 退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、 碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种 类很多，根据织物不同，设备组合不同， 工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有 浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由 于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少， 可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜 明的环保特色。
操作项目 I-1 淀粉酶原液 钝化β-淀粉 酶 3，5-二硝基 水杨酸 2.0 1.0
淀粉酶测定实验报告
一、实验目的1. 掌握淀粉酶活性测定的原理和方法；2. 了解淀粉酶在生物体内的作用及其影响因素；3. 通过实验验证不同条件下淀粉酶活性的变化。
二、实验原理淀粉酶是一种能够水解淀粉的酶，主要分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。
本实验采用α-淀粉酶作为研究对象，通过测定其在特定条件下催化淀粉水解的速率，来评价淀粉酶的活性。
实验原理如下：1. 淀粉酶能够将淀粉水解成葡萄糖，反应式如下：淀粉 + 水酶→ 葡萄糖2. 淀粉在碘存在下呈现蓝色，当淀粉被水解后，蓝色逐渐消失，通过测量蓝色消失的程度，可以判断淀粉酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：淀粉酶、淀粉、碘液、蒸馏水、pH缓冲液、比色皿等；2. 实验仪器：恒温水浴锅、移液器、比色计、天平等。
四、实验步骤1. 准备淀粉酶溶液：将淀粉酶用pH缓冲液稀释至一定浓度；2. 准备淀粉溶液：将淀粉用蒸馏水配制成一定浓度的溶液；3. 配制碘液：将碘液用蒸馏水稀释至一定浓度；4. 设置实验组：将淀粉溶液和淀粉酶溶液按照一定比例混合，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应；5. 设置对照组：将淀粉溶液和蒸馏水按照一定比例混合，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应；6. 取样：在反应一定时间后，取出实验组和对照组的溶液，加入碘液；7. 比色：将实验组和对照组的溶液在比色计上测定吸光度；8. 计算淀粉酶活性：根据实验组和对照组的吸光度差值，计算淀粉酶活性。
五、实验结果与分析1. 实验结果：实验组吸光度：A1对照组吸光度：A22. 结果分析：根据实验结果，计算淀粉酶活性：淀粉酶活性 = (A1 - A2) / A2淀粉酶活性越高，表示淀粉酶的催化能力越强。
六、实验讨论与心得1. 实验过程中，需要注意温度、pH值等因素对淀粉酶活性的影响，以保证实验结果的准确性；2. 实验结果表明，淀粉酶活性受到多种因素的影响，如温度、pH值、底物浓度等；3. 通过本实验，加深了对淀粉酶活性的理解，为后续研究提供了实验基础。
淀粉酶的制备及活力测定
（ 4 ） 1 ％ 淀 粉 溶 液 ： 称 取 1 g 淀 粉 溶 于
100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
（ 5 ）
0.4M NaOH
实训步骤
1 、称取 1g 萌发 3 天的小麦种子，置于
研钵中。 2. 加入少量的石英砂和 2mL 的蒸馏水， 研磨匀浆。 3. 将匀浆倒入离心管中，用 6mL 蒸馏 水分次将残渣洗入离心管。提取液在 室温下放置提取 15 至 20 分钟。每隔数 分钟搅动一次，使其充分提取。
[3] 何国庆 , 丁立孝 . 食品酶学 . 北京 : 化学工业出版社 2009 [4] 周晓云编著.酶技术.北京:石油工业出版社，1995 [5] 罗贵民.酶工程.北京:化学工业出版社，2003 [6] /question/266186296.htm l
实训原理：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度 的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀 粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成 的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子， 淀粉酶活力最强，其中主要是α- 淀粉酶和β- 淀粉酶。两种 淀粉酶特性不同，α - 淀粉酶不耐酸，在pH3.6 以下迅速钝化。 β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。
（ 3 ）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，
参考文献：
[1] Gardner H W.Recent investigations into the lip oxygenase pathway of plants.Biochem Biophysical Ac ta.1991 [2] 莎娜,赵立超,陈永泉.α-淀粉酶对甘薯果脯废糖液澄 清效果的研究
[总结]淀粉酶活力的测定方法
![[总结]淀粉酶活力的测定方法](https://img.taocdn.com/s3/m/69ec579fd1d233d4b14e852458fb770bf78a3bde.png)
淀粉酶活力的测定方法淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。
不同来源的淀粉酶，性质有所不同。
植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。
α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。
Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。
单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。
β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca 2+ 及Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α + β）淀粉酶总活力，然后在60 ℃加热15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去α - 淀粉酶活力，就可求出β- 淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的3- 氨基-5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
1 酶活测定方法（1）标准曲线的制作(见下表)①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。
②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。
取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。
并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。
表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值试剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 H2O（mL） 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 OD520(2)粗酶液淀粉酶活力测定①待测粗酶液的制备：发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。
淀粉酶活性测定实验报告
淀粉酶活性测定实验报告淀粉酶活性测定实验报告引言：淀粉酶是一种重要的酶类，它在生物体内起着关键的消化和代谢作用。
淀粉酶能够将淀粉降解为较小的分子，以供生物体吸收和利用。
因此，测定淀粉酶的活性对于了解生物体的消化系统以及酶的功能机制具有重要意义。
本实验旨在通过测定淀粉酶的活性，探究其在不同条件下的变化规律，从而加深对淀粉酶的认识。
材料与方法：1. 实验器材：试管、移液管、恒温水浴、分光光度计。
2. 实验试剂：淀粉溶液、淀粉酶溶液、碘液、磷酸盐缓冲液。
3. 实验步骤：a. 准备一系列稀释淀粉酶溶液，分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。
b. 取一定量的淀粉溶液置于试管中，加入相应浓度的淀粉酶溶液，混匀。
c. 将试管置于恒温水浴中，保持温度在37°C，反应10分钟。
d. 在反应结束后，加入适量的磷酸盐缓冲液停止反应。
e. 加入适量的碘液，使溶液变为蓝黑色。
f. 使用分光光度计测定溶液的吸光度，记录下吸光度值。
g. 重复以上步骤，分别测定其他浓度的淀粉酶溶液。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了不同浓度淀粉酶溶液的吸光度值，并以吸光度值作为淀粉酶活性的指标。
根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 淀粉酶活性与浓度呈正相关关系：实验结果显示，随着淀粉酶溶液浓度的增加，吸光度值也随之增加。
这表明淀粉酶的活性与其浓度呈正相关关系。
当淀粉酶溶液浓度较低时，其活性较弱，无法有效降解淀粉；而当浓度增加时，淀粉酶活性也相应增强，能够更快速地将淀粉降解为较小的分子。
2. 淀粉酶活性受温度影响较大：实验中将反应温度保持在37°C，这是因为淀粉酶在人体内的最适温度为37°C。
然而，当温度偏离最适温度时，淀粉酶的活性会受到显著影响。
过高或过低的温度都会导致淀粉酶的构象变化，从而影响其催化效率。
因此，合适的温度对于淀粉酶的活性至关重要。
3. 淀粉酶活性受pH值影响：酶活性与pH值之间存在一定的关系。
淀粉酶的制备及活力测定
• 3、酶活力的测定：取5支干净的试管，编号，按表 进行操作
反应顺序 样品（重 复3个）
标准空白
样品空白
样品稀释液 （ml）
蒸馏水 依次加入淀粉 溶液（ml） 依次加入DNS 试剂（ml） 加入蒸馏水至 总体积（ml）
1
0 0 60℃预热5min 1.5
1
1
0
1.5
1.5
混合60℃保温30min 1.5 1.5 1.5
二、实验原理
• α －淀粉酶是内切酶，酶的作用点仅限于淀粉链的α －1，4 糖苷键，对α －1，6糖苷键不能作用，但能越过α －1，6糖 苷键，将α －1，4糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精， 而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色。 • 在酶解的最初阶段，α －淀粉酶对淀粉的水解速度很快，但 当水解到一定程度后，水解虽在继续进行，水解速度却变得 缓慢。该酶的最小作用底物是麦芽三糖以上的低聚糖，对麦 芽三糖的作用很弱，对麦芽糖没有水解能力。 • 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶制剂的主要生 产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。 • 本实验利用高产α －淀粉酶的枯草芽孢杆菌T2生产α －淀粉 酶用于制备淀粉水解糖。
三、材料、试剂与仪器
• 实验材料：萌发的小麦种子（芽长1厘米左右） • 仪器：722光栅分光光度计，恒温水浴锅，离心机，容量 瓶，小台秤，研钵，具塞刻度试管，试管，移液器，烧杯 • 试剂：① 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸 馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）； ② pH5.6的柠檬缓冲液： • A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） • B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L） • 取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；
淀粉酶的制备
0时刻5min时 刻Fra bibliotek0时刻
5min时 刻
0时刻
5min时 刻
B1 B1’ F1 F1’ B2 B2’ F2 F2’ B3 B3’ F3 F3’
淀粉酶液 (ml)
0.3
0.2
0.5
H2O (ml) 3.5 pH 6.8缓冲液
0.3 ％ NaCl
预热
各 1 ml 各 1 ml 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min
一、实验目的
掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法
本实验是以一定量的α -淀粉酶液，于37 ℃ 、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将 淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用， 比色测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反 应的初速度，即酶的活力
这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37 ℃ 、 pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1 mg还原 糖所需要的酶量。
酶提取液解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释 到25 mL，摇匀备用 （2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析 蛋白质解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释到 25 mL，摇匀备用 （3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取 0.05 mL，稀释。
收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL
NaOH (ml)
11
11
11
预热的淀粉
各 1 ml，迅速摇匀
酶促反应
37 ℃ 水浴 5 min (准确计时)
NaOH (ml) DNS试剂 显色反应
比色
11
11
11
各 2 ml，摇匀
沸水浴 5 min，冷却，各用水定容至25ml，摇匀
实验四 α-淀粉酶的固定化及其酶活测定
酶活力测定
吸取20.0 mL可溶性淀粉溶液于烧杯中，加入磷酸缓冲液
5 mL，摇匀后，置于40℃±0.2℃恒温水浴中预热8 min；
加入1g固定化酶，立即计时，100r/min条件下准确反应5 min；
立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL
盐酸溶液和5. 00 mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL 盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用 10 mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1， 求得测试酶液的浓度。
三、仪器和试剂
仪器：
电子天平、分光光度计、水浴锅、烧杯、玻棒、 量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针 头）、纱布等。 试剂：
海藻酸钠、无水氯化钙、无水磷酸氢二钠、氯 化钠、苯甲酸、可溶性淀粉、碘酸钾、碘化钾、 浓盐酸。
四、实验方法
配A液：
取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中， 沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自 然冷却。
作中Ca2+的作用有何区别？
酶的固定化方法
海藻酸钙凝胶包埋法
称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓 度的海藻酸钠溶液一定浓度的氯 化钙溶液中，形成球状固定化酶胶粒。
海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化酶的操作简便， 条件温和，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝 胶的孔径，还适合于多种细胞的固定化。
五、酶活力计算
中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X1 = c× n 式中: X1—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入 固定化酶的量来控制） 。 所得结果表示至整数。 允许差： 平行试验相对误差不得超过5%
六、思考题
淀粉酶的活力测定与制备 打印
淀粉酶的制备与活力测定基础知识淀粉酶是水解淀粉（包括糖原、糊精）中糖苷键的一类酶的统称，广泛存在于动植物和微生物中。
它是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广的一类酶。
1.α-淀粉酶的结构目前，已对很多不同种类和来源的α-淀粉酶（黑曲霉、米根霉、人和猪胰腺、人唾液腺、大麦种子和地衣芽孢杆菌)的晶体结构进行了X-射线衍射研究，并得到了高分辨率的晶体结构图。
研究表明所有α-淀粉酶均为分子量在50ku 左右的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中心区域A由一个(β/α)8圆筒构成；区域B由一个小的β-折叠突出于β3和α3之间构成；而C-末端球型区域C则由一个Greek-key基序组成，为该酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。
为保持α-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是α-淀粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的α-淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的[10]。
2.α-淀粉酶的性质早在1967年，Jones 和Varner就对小麦中α-淀粉酶的活性进行了研究[11]。
不同来源的α-淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重要。
2.1底物特异性α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。
2.2最适 pH和最适温度反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。
因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。
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0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：
A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取
C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容 至1L； B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取 Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并 定容至1L。 取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液； 1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于 100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
(三）α-淀粉酶活力测定： ① 取试管3支 ② 于每管中各加入酶液1mL，在70℃±0.5℃恒温 水浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。取出 后迅速用流水冷却。 ③ 在对照管中加入4mL0.4mol/L氢氧化钠。 ④ 在4支试管中各加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。 ⑤ 将4支试管置于恒温水浴中，40℃±0.5℃保温 15min，再向各管分别加入40℃下预热的1%淀 粉液2mL，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计 时保温5min。取出后向测定管迅速加入 4mL0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
（一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净 的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂。 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水 冷却，加蒸馏水定容至25ml。以1号管作 为空白调零点，在520nm波长下比色测定， 记录吸光度。以麦芽糖含量为横坐标，吸 光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
管号 麦芽糖 标准液 蒸馏水
二、实验原理
• 淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖 等小分子物质从而被机体利用。淀粉酶主 要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α淀粉酶可随机作用于淀粉中的α-1，4-糖 苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、 糊精等还原糖，同时使淀粉的黏度降低， 因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉 的非还原末端进行水解，每次水解下一分 子麦芽糖，又被称为糖化酶。
项目三
淀粉酶的制备及活力测定
任务1 淀粉酶的制备及活力测定方 案的制定
生药1121 张家敏 2011423225
一、淀粉酶
• 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通 常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料， 由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的 退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、 碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种 类很多，根据织物不同，设备组合不同， 工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有 浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由 于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少， 可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜 明的环保特色。
• 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成 正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准 曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后 生成的还原糖的量，以单位重量样品在一 定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 • 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌 发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其 中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀 粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在 pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热， 在70℃15min钝化。
四、实验步骤
• 1. 将萌发好的稻谷种子去壳，注意别把芽去掉， 称取1g，置于研钵中。 • 2. 加入少量的石英砂和2mL的蒸馏水，研磨匀浆。 • 3. 将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残 渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15至20 分钟。每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。 • 4. 然后在3000转/分转速下离心10分钟。 • 5. 将上清液过滤，倒入100mL容量瓶中，加蒸馏 水定容至刻度，摇匀，即制得α-淀粉酶原液。 装入试剂瓶中，贴标签，保存于低温冰箱中，为 以后的实验使用。
1 0
2 0.2
3 0.6
4 1.0
5 1.4
6 1.8
7 2.0
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0
麦芽糖 含量
3，5二硝基 水杨酸
0
2.0
0.2
2.0
0.6
2.0
1.0
2.0
1.4
2.0
1.8
2.0
2.0
2.0
（二）酶液制备：称取1g萌发3天的小麦种 子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量 石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆 倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗 入离心管。提取液在室温下放置提取15～ 20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提 取。然后在3000r/min下离心10min，将上 清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容 至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上 述淀粉酶原液5ml，放入100ml容量瓶中， 用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶 稀释液。
（四）淀粉酶总活力的测定：另取4支试管编 号，2支为对照，2支为测定管。然后加入 稀释酶液1mL。在对照管中加入 4mL0.4mol/L氢氧化钠。4支试管中各加入 1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。以下步骤重复 α-淀粉酶活力测定第五步的操作，同样准 备测糖。 （五）结果计算： 淀粉酶活力=C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。 式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量 （mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）； Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W 为样品重量（g）；t为反应时间（min）。
操作项目 I-1 淀粉酶原液 钝化β-淀粉 酶 1.0
α-淀粉酶活力测定 I-2 1.0 置70℃水浴15min，冷却 I-3 1.0
3，5-二硝基 水杨酸
2.0
0
预保温 1%淀粉溶液 保温 3，5-二硝基 水杨酸
将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温 10min 1.0 1.0 在40℃恒温水浴中保温5min 0 2.0 2.0 1.0
三、实验器材及试剂
1、材料
萌发的小麦（或稻谷）种子（芽长约1cm）。 2、仪器设备 分光光度计；离心机；恒温水浴（37℃，70℃， 100℃）；具塞刻度试管；刻度吸管；100mL容量 瓶2个；25mL比色管15支；试管8支；电子天平； 研钵。
3、试剂（均为分析纯）： 标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称 取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容 至100mL； 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取 1g3，5－二硝基水杨酸1g，溶于 20mL1mol/L NaOH溶液中，加入50mL 蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解 后用蒸馏水稀释至100mL。盖紧瓶塞， 勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使 用；