基因工程-4-PCR及文库克隆法
基因工程作业
1、DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有碱性磷酸酶处理使5’磷酸基团羟基化。
2、切口平移是指在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，使5’磷酸基团带上放射性标记。
在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是提高蛋白质浓度防止酶失活。
3、下列哪一种酶作用时需要引物（B）反转录酶在作用时需要DNA聚合酶，而后者需要引物A、末端转移酶B、反转录酶C、DNA 连接酶D、限制酶4、下列DNA片段，最可能含有SstI 酶切位点的是（A）ＡGGAGAGCCTCT ＢGAGCACA TCT ＣCCCTGTGGGAＤA TCCTACATG ＥAACCTTGGAADNA连接酶的作用特点有哪些？1、DNA 3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）2、需要能量、Mg2+3、被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分4、只封闭双螺旋DNA骨架上的nick大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。
1、5’—3’聚合酶活性：以DNA为模板利用四种dNTP合成DNA链2、3’—5’外切酶活性：主要起校对作用3、5’—3’外切酶活性：从5’端降解DNA分子何谓Star activity？简述Star activity 的影响因素及克服方法？限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为星号（*）活性。
（1）高甘油含量（>5％, v／v）；（2）限制性内切核酸酶用量过高（>100U／ugDNA）；（3）低离子浓度（<25 mmol／L）；（4）高pH（8.0以上）；（5）含有机溶剂，如DMSO（二甲基亚砜），乙醇等；（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。
PCR技术
PCR技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）又称为无细胞克隆系统或特异性DNA 序列体外引物定向酶促扩增法，是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段快速进行体外酶促扩增的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。
这一反应是指数反应，可在短时间内使极微量的目的DNA片段特意的扩增上百万倍，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．在聚合酶链式反应实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但往往DNA聚合酶不能耐高温，耐热DNA 聚合酶—TaqDNA聚合酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用。
PCR工作原理将适当的反应体系置于特殊的装置自动温度循环器中，加热至高温（一般为94℃，90s），将所需要扩增的靶DNA单链热变性处理，解开为两个寡核苷酸单链。
降低温度（退火如55℃，90s），引物与互补DNA结合后，以把DNA为模板，TaqDNA聚合酶催化四种dNTP按从5’到3’方向将引物延伸，自动合成新的DNA链，使DNA重新复制成双链。
然后又开始第二轮循环扩增。
引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特意的限制扩增DNA片段大小的作用。
新合成的DNA链含有引物的互补序列，又可作为下一轮聚合反应的模板。
PCR的反应循环周期如下1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
基因工程主要知识点整理
第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。
构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。
亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。
PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。
但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。
第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。
限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。
甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。
并且能够保证自身的DNA不被降解。
使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。
如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。
II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。
其限制反应与甲基化反应是分开的反应。
不需要ATP的参与。
限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。
回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。
但他们的切割位点有可能不同。
分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。
基因克隆实验手册
插入片段 线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶 回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
基因工程复习资料
基因工程复习资料克隆：是指从一个合营祖先无性滋长下来的一群遗传上雷同的DNA 分子、细胞或个别所构成的专门的生命群体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的对象。
化学本质：DNA 1.输送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因供给复制才能或整合才能3.为外源基因的扩增或表达供给前提。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，应用现代分子生物学技巧，专门是酶学技巧，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直截了当进行体外重组操作与改革，并转移到别的一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改革与改进。
黏性末尾是指DNA分子在限制酶的感化之下形成的具有互补碱基的单链延长末尾构造，它们能够或许经由过程互补碱基间的配对而从新环化起来DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸构成的、具有一个或数个限制酶辨认位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末尾，另一头为平末尾的专门的双链寡核苷酸片段。
当它的平末尾与平末尾的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末尾的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其供给复制和功能基因表达调控体系的对象。
目标基因：基因工程中克隆的目标DNA分子SD序列：mRNA中肇端暗码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的次序，它能够与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从肇端暗码子处开端启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开端的部位基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息经由过程克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，那个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各类cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，那个群体就称为cDNA文库。
pcr复制原理
pcr复制原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，其原理是通过体外复制DNA分子，使其在短时间内得以扩增。
PCR 技术的应用十分广泛，不仅可以用于基础研究，还可以应用于医学诊断、法医学和生物工程等领域。
PCR技术的核心原理是通过DNA聚合酶酶的作用，将DNA分子在体外的温度循环中，反复进行DNA的复制、扩增。
PCR反应是在一种热循环仪中进行的，该仪器可以精确控制反应体系的温度变化。
PCR 反应一般包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先是变性步骤，反应体系中的DNA双链会在高温（通常为95°C）下解开，形成两条单链DNA。
这一步的目的是使DNA分子的双链解开，从而让DNA分子的两条链在后续的操作中能够被复制。
第二步是退火步骤，将反应体系的温度降低至适合引物与模板DNA 结合的温度。
引物是一种短的DNA分子，它们能够与待扩增的DNA 序列的两端互补结合。
在这一步中，引物与模板DNA发生互补结合，形成DNA双链。
最后是延伸步骤，通过DNA聚合酶酶的作用，使引物与模板DNA之间的空隙被填补。
DNA聚合酶能够识别引物与模板DNA的互补碱基序列，然后在引物的3'端开始合成新的DNA链。
这一步的结果是生成了两条新的DNA分子，它们与原始DNA分子具有相同的序列。
上述三个步骤组成了一个PCR循环，一般需要反复进行20-40次，以使DNA的数量呈指数级增加。
通过PCR技术，可以在短时间内从极少量的DNA样本中扩增出足够的DNA，以供后续的分析和研究。
PCR技术的应用非常广泛。
在基础研究中，PCR可以用于克隆、测序、基因突变分析等。
在医学诊断中，PCR可以检测病原体的存在，例如检测病毒、细菌等引起疾病的微生物。
在法医学中，PCR可以用于DNA鉴定，例如通过PCR技术可以进行个人身份的确认。
此外，PCR还可以应用于生物工程领域，用于基因工程的构建和调控。
第四章基因工程(背诵版)
第四章基因工程【课前检测】【例1】核移植前应增加转基因细胞培养液中的血清浓度以提高动物克隆成功率（）why？答案：（x）why？在移植过程中无需提高血清浓度,动物培养液中血清的作用是保证细胞能够顺利生长和增殖,属于营养物质【例2】引物能引导限制酶精准确定目的基因的位置,其原理是,限制酶的作用是答案：引物与目的基因能够进行碱基互补配对，特异性识别特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯键【例2】在转基因浮萍的培育过程中,科研人员用PCR 技术持异性快速扩增了目的基因。
已知PCR 引物序列如图所示,并在每种引物的5'端设计了特定序列引物1:GGAAGATCTTCCCGCGGATCCATGGACTATA ATGTATGGA引物2:AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA两种引物设计的依据是,设计加下划线的特定序列的目的是答案：两种引物设计的依据是目的基因两端的部分DNA 序列,设计加下划线的特定序列的目的是使扩增出的目的基因两端含有相应限制酶的识别序列和切割位点一、【基因工程—原理：基因重组，构建基因表达载体——核心】①限制酶/限制性内切核酸酶：主要存在于？细菌功能？特异性识别特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯键【例】为什么原核生物的限制酶无法切割自身DNA?答案：1.无限制酶识别的相应的核苷酸序列2.DNA经化学修饰【判断】限制酶只对双链起作用，对单链不起作用？√一种限制酶可以识别多个序列？√不同的限制酶可以识别同一序列？√意义？适应不同的反应体系的温度、pH【例】目的基因：使用两种的限制性内切核酸酶切割（注意保证目的基因的完整）——防止目的基因自身环化和反向连接【例】使用相同的两种的限制性内切核酸酶切割利于目的基因和载体质粒的正向连接。
【例】使用相同的限制性内切核酸酶切割利于目的基因和载体质粒的连接。
②DNA连接酶——连接DNA片段之间的氢键——酶具有专一性?种类：T4DNA连接酶——连接黏性末端和平末端EcoilDNA连接酶——只连接黏性末端③载体的种类：质粒/噬菌体——受体细胞：细菌植物病毒——受体细胞：植物细胞动物病毒——受体细胞：动物细胞理想载体的特征：1.复制起点2.有限制酶的识别序列3.具有筛选作用的目的基因二、获取目的基因1.化学合成法/PCR技术——已知目的基因全部序列（适合较短的基因）2.基因文库——未知目的基因序列：（基因组文库、cDNA文库）【例】当目的基因序列未知，获取目的基因时，可以建立cDNA文库：（以抗体基因为例）抗体基因可从B淋巴细胞/效应B淋巴细胞中提取并纯化全部mRNA，并以此为模板，利用逆转录酶合成cDNA（单链）——不同组织细胞的cDNA文库是不同的，why？同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异——原因：基因的选择性表达胰岛素基因的cDNA——只存在于有胰岛β细胞建立的cDNA文库，【判断】胰岛素基因只存在于胰岛β细胞——x（一般来说，同一个体所有细胞的核遗传信息相同）3.【PCR技术（已知或未知基因序列）—聚合酶链式反应—体外扩增DNA—增加基因含量】PCR以待扩增DNA为模板，原理：dNTP(脱氧核苷三磷酸)，耐高温的TaqDNA聚合酶引物：2条不同的DNA单链——两个引物决定扩增DNA的起点和终点（√）一个基因连续扩增4次，需要几个引物？2*4x22=30【例】一个基因连续扩，第n次时需要消耗引物Ⅰ___ 2n1____个。
基因工程
1、基因工程，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
（供体基因、受体细胞、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
）2、同尾酶：识别的靶序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。
这两个相同的粘性末端称为配伍未端。
3、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶。
同裂酶的切点位置可相同或不同。
4、1酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割1μg λDNA所需的酶活性5、星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称星号（*）活性。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、PCR扩增引物：是指与待扩增互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在15～30个核苷酸之间。
8、linker：是指用化学方法合成的一段由8~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。
9、衔接头：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶切的粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
10、粘性末端：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称），酶切后形成得具有互补碱基的单链末端结构。
酶切后产生两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
11、平末端：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。
12、基因克隆载体：通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。
也称DNA克隆载体。
13、cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的书暗恋区域称为~~14、受体细胞:又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。
第四章 目的基因的获得-PCR
5’ ATCTTGAAC
模板
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
4. 1个循环的结果
5. 新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
DNA elongation
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2. 亚磷酸三酯法 原理
将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH
与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接， 然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使 用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具 体的合成和延伸过程如图。
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所 要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板
5’ ATCTTGAAC 引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
引物
模板
ACGTACGTA 5’
3. DNA链的延伸
72 oC
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链
(d)
3’
3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
（四）PCR的特点
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利用DNA聚合酶在体外（in vitro）合成特异性DNA片段的 技术,又称体外基因扩增技术。
Kary Mullis
1993年的诺贝尔化学奖
1、PCR技术扩增的步骤—三步曲
高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）
2 PCR反应的DNA聚合酶选择 1 普通Taq酶（rTaq）
无3’-5‘外切酶活性 产物的3′端附有一个“A”碱基
2 高保真DNA聚合酶
具有3‘→5’ 外切酶活性，保真性能极高 PCR产物为平末端
3 长片段Taq酶
具有3’-5‘外切酶活性 可扩增大于10kb的DNA片段 产物3’端附有一个“A”碱基
3.4.1 融合PCR原理
3.4.2 融合PCR构建表达基因
M1 2 3 4 5
2.0 kb 1.0 kb 0.75 kb 0.5 kb 0.25 kb 0.1 kb
3.4.3 重叠延伸PCR的优点：
能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和 连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切 酶消化的方法难以得到的产物.
•提高RT-PCR的优化能力 •适用于在单个样品中检测几个mRNA
3.3 RACE PCR技术
经典的RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术是由 Frohman等发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分 cDNA序列来得到完整的cDNA5′和3′端。
3.2 RT-PCR方法
两步法步骤
起始第一链cDNA合成使用： Oligo(dT)，随机六聚体，GSP引物
一步法步骤
起始第一链合成使用： GSP引物
优点
•灵活 引物选择
优点
•方便 扩增酶同逆转录酶预先混合 转管步骤少，减少污染可能 性 •高灵敏度 •适用于大量样品分析 •适用于定量PCR
扩增酶的选择
3.1 RT-PCR 3.2 反向PCR 3.3 Tail-PCR 3.4 重叠延伸PCR（融合PCR） 3.5 功能蛋白组分离目的基因
3.1 RT-PCR
3.1.1 RT-PCR原理
mRNA (sense) 反转录 GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3’ Primer Antisense: TTTTTTTTTT-5’ oligo(dT)
2 763 110
1 381 550 690 774 345 3862.基因组构建一般流程3.基因的筛选
3.1 原位杂交法 3.2 图位克隆法 3.2.1.染色体步移 3.2.2.染色体登陆
子作探针克隆出突变基因，再用突变基因做探针，从野生型个体 中分离并克隆出野生型基因
cDNA第一条链
PCR GSP1
AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’
GSP (antisense)
GSP、GSP1：gene specific primer GSP
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR） 相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以 cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RACE PCR的改进
烟草酸焦磷酸酶
3.3 Tail PCR
TAIL-PCR又叫热不对称交错PCR （thermal asymmetric interlaced PCR ） ，能够较好扩增未知序 列。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引 物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度斯质粒基因库 45kb 质粒基因库 <10kb顺序 稳定性——重组体不丢失，不重组，易保藏 易选性——保证基因组完整 cDNA 第1链 cDNA 第2链的合成 将双链RNA tRNA rRNA 2、合成cDNA第一条链 （1）随机引物引导法 （2）oligo（dT）引导法
提高PCR特异性的技术
巢式PCR（Nest-PCR）
第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。 第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部。
巢式PCR的提高特异性的原理：
如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错 误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此， 巢式PCR的扩增非常特异。
3.利用PCR获得目的基因的方法
例如人的基因组.99）/ln（1 – 1.5/3
克隆片段 平均大小 （bp）
2×106（细菌）
2×107 （真菌）
R=A、G Y=C、T M=A、C
K=G、T S=C、G W=A、T
简并度：
H＝ A、C、T B＝ C、G、T V＝A、C、G D＝A、G、T N=A、C、G、T
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304
使用简并引物注意事项：
① ② ③ ④ ⑤ 选择密码子简并度少的氨基酸序列 应避免3‘简并 次黄嘌呤(I)代替N来减低引物复杂度 根据物种密码子偏好选择 可设计巢式PCR来提高特异性
（1）自身引导法
（2）双链cDNA的置换合成
（3）引物-衔接头法双链DNA的合成
Clontech二、基因组的构建1.基因的构建规模
（取决于基DNA片段的出现概率，一般为99%。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
转座子质粒
受体菌染色体
复制性转座子
非复制性转座子
保守性转座子
2. 转座子标签法的主要步骤： ① ② ③ ④ ⑤ 提取转座子质粒 转座子转化导入受体细胞 通过受体表型的改变筛选突变体 通过转座子已知序列获得目的基因 从野生型受体中分离克隆目的基因
转座子标签法对阴沟肠杆菌B8 拮抗水稻白叶枯病 菌相关基因片段的克隆与检测
2×109（动物）
理论克隆数 实际克隆数 理论克隆数 实际克隆数 理论克隆数 实际克隆数
5×103
10×103 20×103 40×103
400
200 100 50
1831
919 458 278
4000
2000 1000 500
18 418
9208 4603 2300
600 000
300 000 150 000 75 000
3.4.4 重叠延伸PCR的用途：
重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段 基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛 而独特的应用。
3.5.1 一步重叠延伸PCR原理
3.6 功能蛋白组分离目的基因
蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表 达产生的总蛋白质的统称。 功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。
黄海宁, 余旭平，陈卫良,龚鸿飞,李德葆 浙江大学学报(农业与生命科学版) 32(3):265～269,2006
与载体（Cos质粒，λ噬菌体）重新组合
转化或转染
每一个克隆中只含有基 因组内的一个片段
但只要切割基因是随机的，而且克隆数目是足够大，那么构建的克隆群体 救可以包含基因组内全部基因片段。因此，这样的克隆群体就象储存有基 因组内各种基因的仓库，故称基因。（1）随机引物引导法 5´
dNTP Klenow酶、连接酶、
3´
mRNA
5´ 3´ （2）oligo（dT）引导法
3´ mRNA 5 ´ cDNA第一条链
5´ห้องสมุดไป่ตู้
dNTP Klenow酶
AAAAAA TTTTTT
3´
mRNA
5´
AAAAAA
3´ mRNA
TTTTTT
cDNA第一条链
3、第二条链的合成
3.6.3 简并引物设计实例
氨基酸：Val
Phe
Asn
Ala
Trp
Lys
Asp
His
核苷酸: GTN TT(T/C) AA(T/C) GCN TGG AA(A/G) GA(T/C) CA(T/C) 引物1： 5’-TT(T/C) AA(T/C) GCN TGG AA(A/G) G-3’ 简并度： 2×2×4×2=32
3.3.1 Tail PCR原理
① 利用简并引物在靶序列上创造结合位点 ② 利用nested PCR提高扩增产物特异性 ③ 利用2轮高温、1轮低温交替的超级PCR循 环提高特异产物的扩增，降低非特异产 物的比例 ④ 模板高倍数稀释以降低非特异产物在下 一轮作模板的比例 ⑤ 通过电泳检测第2轮和第3轮产物相差的 大小来判断产物的特异性
3.4 重叠延伸PCR（融合PCR）
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有 互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从 而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将 不同来源的扩增片段重叠拼接起来.
A基因： 上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切 位点和3个保护碱基；下游（R1）与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端 起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA B基因： 上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序 列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框 终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
3.6.1 功能蛋白质组分离目的基因原理
提取蛋白组 蛋白质双向电泳 高效液相色谱、质谱
等电聚焦：电荷 SDS凝胶电泳：分子大小
蛋白质的序列分析
提取总RNA
设计简并引物 RT-PCR得到目的基因
3.6.2 利用简并引物扩增目的基因
简并引物：一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此 之间仅有一个或数个核苷酸的差异。
3.3.2 TAIL-PCR的优点