HMGB1对缺氧复氧心肌细胞氧化损伤的影响研究

•论著 •HMGB1对缺氧复氧心肌细胞氧化损伤的影响研究邓秋菊1，李慧颖2，向琳3作者单位：1 402160 重庆,重庆市永川中医院心内科;2 100091 北京,北京第三一六医院保健室;3 402160 重庆,重庆市永川人民医院心血管内科通讯作者：向琳,E-mail:316680630@ doi：10.3969/j.issn.1674-4055.2018.08.23【摘要】目的 研究高迁移率蛋白1（HMGB1）对缺氧复氧心肌细胞氧化损伤的影响。

方法 构建H9C2细胞缺氧复氧损伤模型，ELISA法检测培养液上清中HMGB1水平，qRT-PCR检测细胞中HMGB1基因的转录水平。

在H9C2细胞中转染HMGB1 siRNA后进行缺氧复氧处理，硫代巴比妥酸比色法检测细胞中丙二醛（MDA）含量，黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）含量，二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶（LDH）含量，流式细胞术测定细胞凋亡情况，Western blot测定细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Cleaved Caspase-9）蛋白水平。

结果 缺氧复氧后H9C2细胞中HMGB1转录水平升高，细胞分泌的HMGB1水平也升高，与正常培养的细胞相比，差异具有统计学意义（P ＜0.05）；细胞中转染HMGB1 siRNA后可以明显抑制HMGB1的转录和合成；敲低HMGB1可以降低缺氧复氧后的H9C2细胞中MDA水平，促进细胞中SOD合成，减少细胞释放LDH，降低细胞凋亡水平，减少Caspase-3、Caspase-9活化，促进Bax的表达，与单纯缺氧复氧的心肌细胞相比，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

结论 缺氧复氧诱导心肌细胞合成HMGB1，敲低HMGB1可以减弱缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡，减轻氧化损伤。

【关键词】缺氧复氧；HMGB1；心肌细胞；氧化损伤【中图分类号】R542.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1674-4055(2018)08-0979-04Effect of HMGB1 on oxidative damage of hypoxic reoxygenation cardiomyocytes Deng Qiuju *, Li Huiying, Xiang Lin. *Internal Medicine-Cardiovascular Department, Chongqing Yongchuan Hospital of traditional Chinese Medicine, Chongqing, 402160, ChinaCorresponding author: Xiang Lin, E-mail: 316680630@[Abstract ] Objective To study the effect of HMGB1 on oxidative damage of hypoxic reoxygenation myocardial cells. Methods The hypoxia-reoxygenation injury model of H9C2 cells was constructed. The HMGB1 level in the culture supernatant was detected by ELISA. The transcription level of HMGB1 gene was detected by qRT-PCR. The HMGB1 siRNA was transfected into H9C2 cells, and then treated with hypoxia-reoxygenation. The content of malondialdehyde (MDA) in the cells was determined by thiobarbituric acid colorimetry. The content of superoxide dismutase (SOD) in cells was determined by xanthine oxidation. The content of lactate dehydrogenase (LDH) in the supernatant was determined by dinitrophenylhydrazine colorimetry, and apoptosis was determined by flow cytometry. Level of Cleaved Caspase-3, Bax and Cleaved Caspase-9 were determined by Western blot. Results The level of HMGB1 transcription in H9C2 cells after anoxia and reoxygenation was increased, the level of HMGB1 secreted by the cells also increased, compared with normal cultured cells, the difference was statistically significant (P <0.05). The transcription and secretion of HMGB1 could be inhibited significantly after HMGB1 siRNA was transferred to the cells, the level of MDA in H9C2 cells after hypoxia and reoxygenation could be reduced by knocking down HMGB1, promote SOD synthesis in cells, reducing the release of LDH by cells, decrease the level of apoptosis, reduction of Caspase-3 and Caspase-9 activation, promote the expression of Bax, compared with hypoxic reoxygenation of cardiac smyocytes, the difference was statistically significant (P <0.05). Conclusion Hypoxic reoxygenation induced the synthesis of HMGB1 in cardiac myocytes, knocking down HMGB1 can reduce myocardial apoptosis and oxidative damage induced by hypoxia and reoxygenation[Key words ] Hypoxia reoxygenation; HMGB1; Cardiomyocytes; Oxidative damage心肌缺血再灌注损伤是指心肌组织缺血后，恢复组织血液流通加重了缺血性损伤，其与心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）等疾病发生有关，心肌缺血再灌注损伤伴随有心肌细胞氧化损伤、细胞过度凋亡等病理学变化[1,2]。

高迁移率蛋白1（HMGB1）是一种染色体结合蛋白，其在染色体结构维持、基因的转录等过程中具有重要作用。

当组织受到损伤后，HMGB1可作为一种警报素从坏死细胞、应激细胞、活化的免疫细胞等中被释放出来，参与心肌损伤[3,4]。

研究显示，HMGB1参与糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注、心肌肥大等疾病的发生，心肌细胞可以释放HMGB1，参与心肌组织疾病的发生[5-7]。

本研究通过构建缺氧复氧心肌细胞模型，研究缺氧复氧对心肌细胞释放HMGB1的影响，通过小RNA干扰技术下调心肌细胞中HMGB1的合成，研究HMGB1在缺氧复氧心肌细胞氧化损伤中的作用。

1 材料与方法1.1 材料 H9C2细胞购自于美国ATCC；HMGB1 s i R N A和s i R N A c o n t r o l购自英国A b b e x a；Lipofectamine 2000购自美国invitrogen；HMGB1、GAPDH引物由南京金斯瑞合成；qRT-PCR和c D N A合成试剂均购自美国T h e r m o；丙二醛（MDA）含量测定试剂盒购自美国Sigma；乳酸脱氢酶（LDH）含量测定试剂盒购自沈阳万类生物；超氧化物歧化酶（SOD）含量测定试剂盒购自日本DOJINDO；HMGB1含量测定试剂盒购自上海西唐生物；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）抗体、Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Cleaved Caspase-9）抗体购自美国CTS。

1.2 缺氧复氧心肌细胞模型构建 H9C2细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM中。

缺氧复氧模型构建：H9C2细胞密度约为60%时，用移液枪把培养液吸除以后，再添加不含血清的DMEM，把细胞放在95%N2、5% CO2培养箱内孵育12 h。

取出培养板，把原来的培养液倒掉，换成10%胎牛血清的DMEM，把细胞放置于95%空气、5% CO2培养箱复氧约4 h，即为缺氧复氧心肌细胞模型。

1.3 细胞转染和分组 H9C2细胞接种到6孔细胞培养板中，细胞密度约为70%时，进行细胞转染。

取HMGB1 siRNA和siRNA control各5 μl分别与5 μl的Lipofectamine 2000混合后，再与250 μl的Opti-MEM混合稀释。

在室温中结合5 min后，添加到6孔板中，培养6 h后，把细胞培养液换成是含有10%胎牛血清的DMEM继续培养。

H9C2细胞分为正常组、模型组、阴性组、干扰组。

转染HMGB1 siRNA和siRNA control后的心肌细胞经过缺氧复氧处理以后分别记为干扰组和阴性组，以不做转染的心肌细胞经缺氧复氧处理后记为模型组，以正常培养不做任何处理的心肌细胞记为正常组。

1.4 qRT-PCR检测心肌细胞中HMGB1 mRNA水平 正常组、模型组、阴性组、干扰组细胞按照上述方法处理以后，提取细胞中的总RNA，测定提取的RNA OD260 nm/OD280 nm介于1.8~2.0之间。