AFLP分子标记技术及其应用

AFLP分子标记技术及其应用

孙晓鹏

（北京师范大学生命科学学院生态学专业）

摘要：扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos 发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。

关键词：AFLP，分子标记技术，应用

目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Molecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。（Ⅱ）以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。

1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点

1.1. AFLP分子标记技术原理

AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。

进行AFLP分析时，一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切，一种为低频剪切酶，识别位点为六碱基的rare cutter；另一种为高频剪切酶，识别位点为四碱基的frequent cutter。双酶切产生的DNA片段长度一般小于500bp，在AFLP反应中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个识别位点的EcoR I。

AFLP接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。接头(Artificial adapter)一般长14～18个碱基对，由一个核心序列(Core sequence)和一个酶专化序列(Enzyme-specific sequence)组成。常用的多为EcoR I和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。AFLP引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3′端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension，EXT)。

1.2. AFLP分子标记技术流程

AFLP分子标记技术包括3个步骤：(Ⅰ)DNA的准备。即DNA的酶切以及与人工合成的寡聚核甘酸接头(artificial oligonucleotide adapter)连接。为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用双酶酶切，在基因组上分别产生低频切口和高频切口。(Ⅱ)选择性扩增酶切片段。AFLP引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性内切酶识别序列(ENZ)和3′端选择性碱基三部分。一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增，然后用带2～3个选择性碱基的引物进行再扩增。所用引物可用放射性或荧光标记。(Ⅲ)AFLP标记的统计。AFLP产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳(SDS—PAGE)检测样品的多态性，可灵敏地分辨只有一个碱基差异的不同DNA片段。[6](图1)

图1. AFLP分子标记技术流程图

1.3. AFLP分子标记的特点

（1）DNA需要量少，检测效率高，理论上可产生无限多的AFLP标记。一个0.5mg的DNA样品可做4 000个反应。由于AFLP分析可采用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基，因此理论上AFLP可产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组。

（2）多态性高。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。每个反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到的标记数为50～100个，能够在遗传关系十分相近的材料间产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。Becker等(1995)对多态性很差的大麦进行AFLP分析，仅用16个引物就定位了118个位点[7]。

（3）)可靠性好，重复性高。AFLP分析采用特定引物扩增，退火温度高，使假阳性降低，可靠性增高。AFLP标记在后代中的遗传和分离中遵守孟德尔定律；种群中的AFLP标记位点遵循Hardy—Weinberg平衡。

（4）对DNA模板质量要求高，对其浓度变化不敏感。AFLP反应对模板浓度要求不高，在浓度相差1000倍的范围内仍可得到基本一致的结果。但该反应对模板DNA的质量要求较为严格，DNA的质量影响酶切、连接扩增反应的顺利进行。

2. AFLP分子标记技术的应用

AFLP作为一种较新的分子标记，近10年来，AFLP技术获得了很大进步，并展示出良好的发展前景，已经广泛应用于生命科学研究的诸多领域，如动物学、植物学、医学等方面。

2.1. 在动物学研究中的应用

2.1.1. 动物遗传学（以水生动物为例）

AFLP以其数量多、随机分布、稳定遗传、多态性丰富的优点而广泛用于水生动物遗传多样性、系统进化学等研究。Seki 等(1999)用荧光—AFLP技术对三个香鱼群体的遗传多样性进行了分析，结果显示AFLP标记为鱼类遗传变异及多样性评估提供了可靠的信息。Liu等(1998)研究了AFLP标记在斑点鮰、长鳍鮰及其F1、F2和回交后代中的应用，结果显示了AFLP 标记丰富的多态位点、稳定的孟德尔遗传方式和良好可重复性。Miller等(2000)应用AFLP及线粒体序列信息研究了两种濒危琥珀螺的遗传分化及亲缘关系。[8]

水产业是经济的一个增长点，对生物技术的依赖性越来越大。AFLP技术作为一种世代遗传标记，已经成功地应用于水产养殖，并在染色体水平上筛选所需要的鱼种。Montano-Perez等(2006)在最近一篇综述中对此作了详细地总结[9]。另外，人工雌核发育和人工诱导雄核发育可用于性别控制、快速建立家系，从而在多种经济水生动物中的相关工作已广泛展开。

在水生动物的遗传图谱构建上，AFLP技术具有其他同类技术不可比拟的优点。自1996年美国水产经济动物基因组计划启动以来，越来越多的水产动物遗产图谱得以建立。1998年，Kocher等发表了尼罗罗非鱼(Orechromis niloticus)的第一个遗传连锁图；Young等利用雄核发育双单倍体虹鳟以包括AFLP在内的多种标记，构建了一个初步的连锁图，Nichols等在原图上增加了更多的标记(其中包括700多AFLP标记)，使之成为较为详细的连锁图谱。2000年，Naruse等利用633个标记构建了一个较为详尽的青鲢连锁图谱，其中包括488个AFLP标记；2002年Wilson发表了斑节对虾AFLP连锁图谱；Guo 等则构建了太平洋牡蛎的初步连锁图。[8]

2.1.2. 动物系统学（以昆虫为例）

在分类上，AFLP技术可用于种和种下阶元的鉴定。Corsini等(1999)运用AFLP技术分析了智利不同地区地中海实蝇(Ceratitis capitata)遗传多样性，并且克隆了3个富含AT标记片段，可以作为鉴别地中海实蝇属(Ceratitis)其他种类以及果蝇属