第七章 腺相关病毒载体
腺病毒载体构建ppt课件
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
整理版课件
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腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
整理版课件
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腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表整达理版，课整件合突变致癌可能性小。
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几种病毒载体的区别
整理版课件
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整理版课件
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AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
科技成果——靶向型腺相关病毒载体的制备及应用
科技成果——靶向型腺相关病毒载体的制备及应用技术开发单位北京大学适用范围临床基因治疗成果简介腺相关病毒（adenovirus-associated virus，AAV）作为一种备受关注的基因治疗载体，由于具有病原性低和携带的治疗基因表达期长等优势而成为目前最有前景的基因转移载体之一。
然而，在临床基因治疗过程中，AAV具有广泛的宿主范围同时也导致缺乏组织或细胞特异性，对靶细胞的基因转染效率不高，同时也缺乏安全性。
因此，提高重组AAV（rAAV）的靶向能力对于基因治疗成功与否非常关键。
提高病毒靶向能力的一条重要途径就是在病毒衣壳表面偶联一些靶向分子，带领病毒靶向特定组织、器官。
所以，如何对AAV进行无破坏的高效标记及靶向修饰，凸显的尤为重要。
目前的载体改造都是建立在靶向多肽的遗传插入或随机化学修饰基础之上的，但是尽管极尽所能，我们还是很难克服一些AAV本身固有的一些限制，如无法完全摒除病毒的天然嗜性、不能彻底解决修饰对病毒包装滴度的影响等问题。
因此，需要开发出新的具有位点特异性且不具有破坏性的技术来修饰腺相关病毒。
近年来一直在从事蛋白质的非天然氨基酸定点标记技术的研究工作，根据多年研究我们萌发了将该项技术应用在活病毒载体的定点标记上的设想。
该设想的实现将有可能解决活病毒难以任意定点无破坏标记的世界性难题。
由于病毒是由几十、甚至几百个蛋白包裹核酸组成的复杂生命单元，对它实现无破坏标记的难度将大大超过对单个蛋白的标记。
该课题设想的难度大、不可控因素多，失败几率比较大。
我们将这一课题设想申请北京市自然科学基金预探索项目的支持，并成功获得资助。
在北京市自然科学基金的资助下，根据对AAV 晶体结构分析，选择14个标记位点，并在其中6个位点成功地标记叠氮非天然氨基酸。
利用该非天然氨基酸提供的叠氮基团，经点击化学反应，定向偶联了靶向分子（cRGD），实现AAV靶向能力近30倍的提高，进而成功建立了AAV的定点标记及靶向修饰新方法，并将该方法申报PCT专利（定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用，申请号：PCT/CN2014/089880。
病毒转基因技术原理 腺相关病毒ppt课件
动物等的组织中分离鉴定到的。
共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。
通过签名PCR（signature PCR）技术，利用高度保守序列
扩增Cap基因的一小段可变区的DNA序列，以筛检是否是新
的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap
或（和）Rep基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、
转导不同组织器官的AAV最优血清型
不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明
显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极
性（tissue tropisms）
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病毒结构
AAV-2 20–30 nm，基因组为线性、单链的DNA分子。正链和负链的 单链DNA分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长4679个 核苷酸。 基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位 置标示，分别为p5、p19和p40启动子），以及两末端为145个核苷酸的 反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）
精品ppt
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溶原性阶段（lysogenic stage）
染色体q13.4的AAVS1位点中最少 33bp的序列，包含由8个核苷酸分开的 RBE样和 TRS样序列，对AAV的靶向整合是必须而且充分的条件。位点特 异性的整合过程即使是在Rep78和 Rep68蛋白理想表达的条件下，未必是 完全是位点特异的，大约40-70%的整合发生在AAVS1位点
精品ppt
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右端的ORF（Cap基因）
由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白， 即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。 构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染 性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。
腺相关病毒载体的杆状病毒生产系统的构建
应用 于基 因治疗 的一个 重要 原 因 。由于杆状 病毒 不像 腺病 毒 和单 纯疱 疹 病 毒那 样 会 对人 体 产 生毒 性 ， 近 最
基于 杆状病 毒一 昆虫 细胞 的 ｒ ＡＡＶ 生产 系统 引起 了广泛 关注 。杆 状病 毒一 昆虫 细胞 ｒ ＡＶＶ 生产 系统需 要 以下 两类 反式组分 ： 个复 制蛋 白 Ｒ ｐ ８ Ｒ ｐ ２以及 ３个外 壳 蛋 白 ＶＰ 、 ２ ＶＰ 。Ｕｒｂ 等 ［ 首 次采 用 ３ 两 ｅ７ 、 ｅ５ １ ＶＰ 、 ３ ａｅ ６ ］ 个
重组 ＡＡＶ 载体 （ＡＡＶ） 基 因治疗 领域备 受关 注 。ｒ ｒ 在 ＡＡＶ 只保 留了两端 的 Ｉ ＴＲ序列 ， ＡＡＶ 的 Ｒｅ ｐ及
Ｃ ｐ基 因 由外 源基 因表 达框替 代 。在生产 ｒ ａ ＡＡＶ 时 ， 要提供 Ｒｅ 只 ｐ和 Ｃ ｐ蛋 白的反 式 功能 以及其 它辅助 病 ａ
浙 江理 工大 学学报 ， ２ 第 ７卷 ， ５期 ，０ ０年 ９月 第 ２１
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｈ ｊ ｎ ｃ ＴｅｈＵｎｖｒｉ ｏ ｒ ａ ｏ ｅｉ ｇＳ ｉ ｃ ｉｅｓ ｙ Ｚ ａ — ｔ
Ｖｏ ． ７，Ｎｏ． １２ ５，Ｓｅ ． ２ ０ ｐｔ ０１
文 章 编 号 ：１７ ８ １（Ｏ ０ ０ ７３ ０ ６ ３ ３ ５ ２ １ ） ５０ ７ —６
腺 相 关 病 毒 载 体 的 杆 状 病 毒 生 产 系 的 构 建
雷求刚 ，徐增辉 钱 其军 ， 。
（．浙 江 理 工 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 州 ３ ０ １ ； ．第二 军 医 大 学 东 方肝 胆 外科 医院 ，上 海 ２ ０ ３ ） １ 杭 １０ ８ ２ ０ ４ ８
和转 录调 控等 ； 右边 Ｃ ｐＯＲ ａ Ｆ的 ３ 产物 ＶＰ ，ＶＰ 个 １ ２和 ＶＰ ３主要负 责病 毒颗粒 的装 配 ， 构成 ＡＡＶ 的外 壳 并将 ＡＡ 单链 Ｄ Ｖ ＮＡ基 因组 包裹 在壳 内 形 成 成 熟 的 ＡＡＶ 病 毒 颗 粒 ｌ］ ＿ 。ＡＡＶ 基 因组 的 两端 各 有 一 个 ２ 。 １５ｐ的末 端 重复序 列 （ＴＲ）其 中靠 近末 端 的 １５个碱基 是 一 个较 长 的 回文结 构 ， ４ｂ Ｉ ， ２ 自身能 通 过碱 基互 补 配 对进 行折 叠 ， 得 Ｉ 使 ＴＲ呈现 出 Ｔ字 型 的发 卡结 构 ， 也是 ＡＡＶ 复制 和包 装所需 的唯 一顺 式作 用元 件 。 ］
第七章腺相关病毒载体
腺相关病毒载体，AA V)是一类单链线状DNA缺陷腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus型病毒。
其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。
AA V 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后，AA V）产生的一种可供人工转基因的载体。
腺相关病毒（adeno-associated virus是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。
基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。
ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。
Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。
AA V 能感染多种细胞。
Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AA VS1位点。
这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。
重组腺相关病毒载体（rAA V）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
优点：以潜伏感染为主； AA V可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。
缺点：AA V载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。
在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。
AA V选择的条件1. 治疗基因的长度不能过大。
AA V的总容量4.7kb，还要包括AA V自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AA V载体对靶细胞具有较高的转导效率。
腺相关病毒载体在阿尔茨海默病中的应用
［ 关键词 】 相关病毒 ； 腺 阿尔茨 海默病 ； 开放 阅读框 ； 神经生 长因子 【 中图分 类号 】 ７ ９１６ Ｒ４． ［ 文献标 识码 】 Ａ ［ 文章 编号 】 ６ ３ ９ ０ ２ １ ） １ １ 一 ２ １７ — ７ １（ ０ １ ３ — ５ Ｏ
Ｉｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｘ ｅ ｉ ｎ ａ ｅ ｕ ｔｉ ｉ ｅ １ Ｉｓ ａ ｖ ｎ ｅｏ ｅ ｒ ａ ｉ ａ ｉ ｎ ｂ ｉ ｇ ｏ ｅ ｔ ｕ ｕ ｅｇ ｎ ｈ ｒ ｐ ｎ ｔｌｙ ｏｉ ｏ ｎ ａ ｉ ｎ ｔ ｒ — ｌｎ ｃ ｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ｌｒ ｓ ｌ ｄ ａ ． ｔ ｄ ａ ｃ ｆｒ ｏ ｇ ｎ ｚ ｔ ｒ ｓ ｈ ｐ ｏｆ ｔ ｒ ｅ ｅ ｔ ｅ ａ ｙ ａ ｄ ｉ ａ ｓａ ｓ ｌｄ ｆ ｕ ｄ ｔｏ ｓ ｏ ｎ
腺相关 病毒 （ ｄ ｎ — ｓｏｉｔｄｖｒｓ Ａ Ｖ） ａｅ ｏ ａｓｃａｅ ｉ ， Ａ 载体是 目前基 ｕ
白， 能够促进单链 病毒 Ｄ Ａ 自 ， 于其顺利为外 壳蛋 白所 Ｎ 聚 以利
包 被 。右 侧 Ｏ Ｆ编码 ｃｐ基 因 ， 过 Ｐ ０启 动子 转 录产 物 的 Ｒ ａ 通 ４
因治疗 中最常用 的病 毒载体 。 由于其具有定 点整合 、 无致病性 、 可长期 表达 、 疫反应 性小 等独 特 的生 物学 特性 ， 免 日益受 到人
２ 年 １ 月第 ４ 卷 第３ 期 ０１ １ １ ９ １
・
综 述 ・
腺 关 毒 体 阿 茨 默 的 用 相 病 载 在 尔 海 病中 应
高惠舫
（ 吉林省德惠市人民医院， 德惠 １００ ） 吉林 ３ ３０ 【 要 】 讨腺 相关病 毒载 体在 阿尔茨海 默病 中的应 用 。腺相 关病 毒载体 是 目前基 因治疗 中最常用 的病毒 载体 ， 摘 探 由于 其具 有定 点整合 、 致病性 ， 无 通过 一系列 实验与 研究 ， 明其可长 期表达 、 疫反应 性小 等独特 的生物 学特性 。取得较 证 免 为 理想 的前 临床 实验 结果 ， 重组 腺相 关病毒 载体 的进展 为以后基 因治疗 带来 了希望 ， 来进 入临床 治疗 打下 了 良 为将 好
腺相关病毒常见问题与解答
腺相关病毒常见问题与解答腺相关病毒常见问题与解答1、腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中？如果不是，那么整合率大概有多少？是不是跟靶细胞类型有关呢？野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。
这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的．AAV载体是经过改造的，已经去除了其repcap基因，因此已经失去了特异整合的特性。
对于不同的靶细胞，AAV载体的整合几率是不同的。
越来越多的研究发现，在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合，而以附加子（episome）形式存在，最为典型的是在肌肉中。
也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的，有整合到活跃的基因中的倾向。
2、据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达，为什么？AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。
这是因为AAV基因组是单链的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。
此外，AAV对细胞毒性低，培养的细胞在加入AAV后，细胞分裂生长能力不受太大的影响，这样也对AAV载体有一种稀释作用，也导致其表观表达水平较低。
而在体内应用时，注射部位的组织细胞通常没有显著增殖，不会出现AAV载体被稀释的情况，而且在体内各种促进AAV 载体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富，故体内应用时，AAV载体的表达水平比较高。
研究表明辅助病毒或其它辅助因子可以明显促进单链DNA复制成双链DNA，从而明显提高外源基因的表达水平，故在体外应用可以考虑加入辅助病毒（Ad5）或丁酸钠（终浓度10~50mmol/L），这样可以提高表达水平达5~10倍。
腺相关病毒载体的研究进展
腺相关病毒载体的研究进展摘要：目的：本论文旨在综述腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗领域的研究进展，探讨其在治疗和潜在应用方面的最新发展。
方法：通过查阅相关文献，收集和整理了与腺相关病毒载体有关的研究成果，并结合国内外相关研究进行分析。
结果：在基因治疗方面，腺相关病毒载体已被广泛应用于遗传性疾病、癌症和神经系统疾病等的治疗。
不仅可以有效传递修复基因，还可以调节基因表达，并显示出良好的生物安全性和耐受性特性。
另外，在免疫治疗方面，腺相关病毒载体可用于疫苗开发和免疫调节，提供了一种新的治疗策略。
腺相关病毒载体的研究工作也包括载体优化、体内外评价和治疗效果验证等方面。
结论：腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗方面展现出了巨大的前景和潜力。
通过持续的研究和优化，它们有望成为治疗遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病的有效工具。
然而，仍然需要进一步的研究来解决其在临床应用中可能存在的问题，并确保其安全性和有效性。
关键词：腺相关病毒载体；基因治疗；免疫治疗引言腺相关病毒载体作为基因治疗和免疫治疗的工具，在疾病治疗和防控领域具有巨大的潜力。
本文通过综述相关文献，总结和讨论了腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗方面的研究进展。
这些载体已被广泛应用于遗传性疾病、癌症和神经系统疾病等的治疗，并取得了显著效果。
此外，腺相关病毒载体具有良好的生物安全性和耐受性特性，为治疗提供了更大的安全性和可行性。
在免疫治疗方面，腺相关病毒载体可以用于疫苗开发和免疫调节，为免疫治疗提供新的策略。
然而，仍需进一步研究和探索，以优化腺相关病毒载体的性能和应用。
1资料与方法1.1一般资料本文所使用的资料主要包括相关的研究文献、学术论文和专业书籍。
这些资料覆盖了腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗领域的研究进展、应用案例、载体优化技术等方面的内容。
通过对这些资料的收集、整理和分析，我们可以全面了解和评估腺相关病毒载体的研究进展。
1.2方法通过在学术数据库（如PubMed、Web of Science等）中进行关键词搜索，选择相关的研究文献和学术论文。
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腺相关病毒载体腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AA V)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。
其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。
AA V 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。
腺相关病毒（adeno-associated virus，AA V）是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。
基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。
ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。
Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。
AA V 能感染多种细胞。
Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AA VS1位点。
这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。
重组腺相关病毒载体（rAA V）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
优点：以潜伏感染为主；AA V可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。
缺点：AA V载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。
在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。
AA V选择的条件1. 治疗基因的长度不能过大。
AA V的总容量4.7kb，还要包括AA V自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AA V载体对靶细胞具有较高的转导效率。
AA V病毒的感染细胞AA V载体对于骨骼肌、视网膜、肝细胞、心脏平滑肌细胞、神经元细胞、胰岛B 细胞、关节滑膜细胞等具有良好的感染效果，而对于淋巴细胞、造血干细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞等感染效果较差。
病毒的加样量病毒量为10-10V.P/Cell时最佳。
如果太低，基本检测不出，最低加病毒量为10V.P/Cell，才能检出目的蛋白的表达。
病毒要求本公司向客户提供三种rAA V载体--rAA V2、rAA V2/1载体的构建、扩增及纯化服务，包括了从实验设计到载体包装、生产、纯化、质量检定、分装等的一系列服务。
为基础研究、临床前研究和早期临床研究提供高滴度、高纯度的rAA V载体。
其中的对照病毒为携带GFP、LacZ和Luc标记。
除了AA V2和AA V2/1之外，我们也提供AA V1、AA V5、AA V6、AA V7、AA V8、AA V9等。
具体情况请电话咨询本公司技术支持。
重组基因的启动子：mCMV、hCMV、PGK、CAG、HRE-miniCMV、hEF1α、AFP（大鼠）等。
其中，CAG启动子为肝脏特异启动子。
病毒级别实验室级别：适用于细胞实验、动物试验研究；临床试验用级别：适用于药物开发、临床前研究、临床样品申报、临床试验等。
腺病毒相关载体应用经过十几年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。
在医学研究中，rAA V被用于多种疾病的基因治疗的研究（包括体内、体外实验）；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
目前已发现的AA V至少有十几种血清型，它们主要区别在衣壳蛋白Cap的不同，因此导致各种血清型AA V对不同的组织和细胞的不同感染效率。
9种不同血清型对各组织器官细胞的亲和性血清型组织亲和性AAV1肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织AAV2中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，AAV3肌肉，肝脏，肺，眼AAV4中枢神经，肌肉，眼，脑AAV5肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺AAV6肺，心脏AAV7肌肉，肝脏AAV8肝脏，眼，中枢神经，肌肉AAV9心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经腺相关病毒（AA Vs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AA V无辅助病毒系统（AA V Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AA V-2）。
AA V HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AA V复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。
在AA V HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AA V病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和V A RNA 基因）大部分由和人AA V-2载体DNA共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AA V-293宿主细胞提供。
本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AA V-293细胞。
通过消除对活的辅助病毒的需求，AA V Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。
野生型AA V-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。
在AA V Helper-Free System中，rep和cap基因从病毒载体中移除并转移到pAA V-RC质粒中，AA V-2 ITRs仍位于病毒载体中。
AA V rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。
本系统可以容纳最大插入3kb。
在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。
在本系统中，包含AA V-2末端重复序列的质粒(pAA V-MCS, pAA V-LacZ 和pAA V-hrGFP 以及pAA V-IRES-hrGFP)与包含rep/cap基因的质粒(pAA V-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AA V-2。
为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。
特殊情况下，只能用pAA V-RC 作为rep和cap基因的来源和包含ITR的载体进行共转。
在AA V载体生产和AA V储存液滴度测定步骤中，AA V Helper-Free System都消除了对野生型腺病毒进行共感染的需求，使本系统成为彻底的无辅助病毒系统。
而传统的AA V载体滴度测定时，需要野生型腺病毒和AA V载体储存液进行共感染。
由于细胞类型的不同，进行滴度测定时用腺病毒进行共转染的最佳MOI 值也是不同的，通常需要进行优化，这就导致了共转染进行滴度测定的方法变的复杂。
在我们AA V Helper-Free System中独创了一个新颖的无腺病毒滴度测定方法，去除了对腺病毒进行共感染的需求，而且得出同腺病毒共感染方法相同的结果。
重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具。
AA V Helper-Free System 具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。
AA V 具有广泛的细胞类型感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。
另外，由于本系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。
对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力是必须要顾及的。
AA V Helper-Free System可以生产出重组病毒滴度≥107病毒颗粒/毫升的病毒原液（浓缩后可以获得更高的滴度，文献报道浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。
浓缩及纯化方法见参考文献）。
AA V-2在复制许可的前提下具有复制到染色体上的能力，所以AA V-2在长期基因表达方面有特别重要的价值。
缓慢分裂期或非分裂期细胞可以长期保存AA V-2基因组于染色体上，并能稳定表达。
高速分裂期细胞在细胞复制和分裂后失去染色体上病毒基因组，并因此失去基因表达能力。
病毒整合进基因组也会发生，但是整合事件是罕见的。
如果进行极高的复感染或者细胞被感染过并表达腺病毒复制酶，整合事件发生的频率则会增加。
腺相关病毒用于基因传递和表达的优势较高的生物安全级别AA V-2是天然缺陷型病毒（生产性感染依赖于几个额外的反式因子），并且目前还没有发现它和任何的人类疾病有关联。
在AA V Helper-Free System中，AA V-2 反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，以阻止生产出重组野生型病毒。
这样特征赋予了作为病毒来源的基因传递和表达系统的AA V Helper-Free System一个较高的生物安全级别。
宿主细胞范围广腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞并且以成功应用于人类和非人来蛋白的表达。
和其它病毒来源各种载体相比，已证明用于具有免疫活性细胞的基因表达时，腺相关病毒载体效果更好。
高滴度按照此手册重组AA V-2可以生产出≥107 病毒颗粒/毫升的高滴度病毒。
文献报道病毒原液经浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。
宿主细胞活跃的分裂不是感染的必要条件重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞。
表达出的人类蛋白质可以正确的折叠和修饰因为AA V Helper-Free System可以传递基因进入宿主人类细胞系，所以利用此系统表达的人类蛋白质可以正确的进行翻译后的修饰和折叠。
长期的基因表达潜能重组AA V-2能保存于人类宿主细胞中，保持长期的基因转录潜能。
在所有的细胞群中，病毒基因组通常存在于染色体上，一般形成串联体。
这些串联体在缓慢分裂或非分裂细胞内稳定存在，在细胞群内长期进行基因转录和表达。
然而，在处于高速分裂的细胞群内，则会丢失染色体上AA V基因组。
病毒能整合今进宿主基因组，导致基因在分裂期细胞内长期表达，但是这是稀有事件。
如果使用极高感染复数（MOI）的AA V进行感染或细胞被感染过野生型腺病毒并表达腺病毒复制酶，则整合发生的可能性会增加。
然而，使用野生型腺病毒来增加整合事件会降低AA V系统的生物安全性。
AA V Helper-Free System简述使用AA V Helper-Free System生产重组AA V颗粒示意图见图1。
第一步是把外源基因克隆进合适的载体。