第七章 腺相关病毒载体

腺相关病毒载体

腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AA V)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AA V 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。

腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒（adeno-associated virus，AA V）是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。AA V 能感染多种细胞。Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AA VS1位点。这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。

重组腺相关病毒载体（rAA V）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

优点：

以潜伏感染为主；AA V可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。

缺点：

AA V载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；

感染效率比逆转录病毒载体低。

在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。

AA V选择的条件

1. 治疗基因的长度不能过大。AA V的总容量4.7kb，还要包括AA V自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；

2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；

3. 长期表达目的基因，没毒副作用；

4. 不需要目的基因立刻表达；

5. 不需要基因高水平表达；

6. AA V载体对靶细胞具有较高的转导效率。

AA V病毒的感染细胞

AA V载体对于骨骼肌、视网膜、肝细胞、心脏平滑肌细胞、神经元细胞、胰岛B 细胞、关节滑膜细胞等具有良好的感染效果，而对于淋巴细胞、造血干细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞等感染效果较差。

病毒的加样量

病毒量为10-10V.P/Cell时最佳。如果太低，基本检测不出，最低加病毒量为10V.P/Cell，才能检出目的蛋白的表达。

病毒要求

本公司向客户提供三种rAA V载体--rAA V2、rAA V2/1载体的构建、扩增及纯化服务，包括了从实验设计到载体包装、生产、纯化、质量检定、分装等的一系列服务。为基础研究、临床前研究和早期临床研究提供高滴度、高纯度的rAA V载体。其中的对照病毒为携带GFP、LacZ和Luc标记。

除了AA V2和AA V2/1之外，我们也提供AA V1、AA V5、AA V6、AA V7、AA V8、AA V9等。具体情况请电话咨询本公司技术支持。

重组基因的启动子：mCMV、hCMV、PGK、CAG、HRE-miniCMV、hEF1α、AFP（大鼠）等。其中，CAG启动子为肝脏特异启动子。

病毒级别

实验室级别：适用于细胞实验、动物试验研究；

临床试验用级别：适用于药物开发、临床前研究、临床样品申报、临床试验等。

腺病毒相关载体应用

经过十几年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAA V被用于多种疾病的基因治疗的研究（包括体内、体外实验）；同时作为一

种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。目前已发现的AA V至少有十几种血清型，它们主要区别在衣壳蛋白Cap的不同，因此导致各种血清型AA V对不同的组织和细胞的不同感染效率。

9种不同血清型对各组织器官细胞的亲和性

AAV2中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，

AAV3肌肉，肝脏，肺，眼

AAV4中枢神经，肌肉，眼，脑

AAV5肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺

AAV6肺，心脏

AAV7肌肉，肝脏

AAV8肝脏，眼，中枢神经，肌肉

AAV9心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经

腺相关病毒（AA Vs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AA V无辅助病毒系统（AA V Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AA V-2）。AA V HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AA V复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。在AA V HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AA V病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和V A RNA 基

因）大部分由和人AA V-2载体DNA共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AA V-293宿主细胞提供。本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AA V-293细胞。通过消除对活的辅助病毒的需求，AA V Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。

野生型AA V-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。在AA V Helper-Free System中，rep和cap基因从病毒载体中移除并转移到pAA V-RC质粒中，AA V-2 ITRs仍位于病毒载体中。AA V rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。本系统可以容纳最大插入3kb。

在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。在本系统中，包含AA V-2末端重复序列的质粒(pAA V-MCS, pAA V-LacZ 和pAA V-hrGFP 以及pAA V-IRES-hrGFP)与包含rep/cap基因的质粒(pAA V-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AA V-2。为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。特殊情况下，只能用pAA V-RC 作为rep和cap基因的来源和包含ITR的载体进行共转。

在AA V载体生产和AA V储存液滴度测定步骤中，AA V Helper-Free System都消除了对野生型腺病毒进行共感染的需求，使本系统成为彻底的无辅助病毒系统。而传统的AA V载体滴度测定时，需要野生型腺病毒和AA V载体储存液进行共感染。由于细胞类型的不同，进行滴度测定时用腺病毒进行共转染的最佳MOI 值也是不同的，通常需要进行优化，这就导致了共转染进行滴度测定的方法变的复杂。在我们AA V Helper-Free System中独创了一个新颖的无腺病毒滴度测定方法，去除了对腺病毒进行共感染的需求，而且得出同腺病毒共感染方法相同的结果。

重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具。AA V Helper-Free System 具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。AA V 具有广泛的细胞类型感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。另外，由于本系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允

许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力是必须要顾及的。AA V Helper-Free System可以生产出重组病毒滴度≥107病毒颗粒/毫升的病毒原液（浓缩后可以获得更高的滴度，文献报道浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。浓缩及纯化方法见参考文献）。

AA V-2在复制许可的前提下具有复制到染色体上的能力，所以AA V-2在长期基因表达方面有特别重要的价值。缓慢分裂期或非分裂期细胞可以长期保存AA V-2基因组于染色体上，并能稳定表达。高速分裂期细胞在细胞复制和分裂后失去染色体上病毒基因组，并因此失去基因表达能力。病毒整合进基因组也会发生，但是整合事件是罕见的。如果进行极高的复感染或者细胞被感染过并表达腺病毒复制酶，整合事件发生的频率则会增加。

腺相关病毒用于基因传递和表达的优势

较高的生物安全级别

AA V-2是天然缺陷型病毒（生产性感染依赖于几个额外的反式因子），并且目前还没有发现它和任何的人类疾病有关联。在AA V Helper-Free System中，AA V-2 反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，以阻止生产出重组野生型病毒。这样特征赋予了作为病毒来源的基因传递和表达系统的AA V Helper-Free System一个较高的生物安全级别。

宿主细胞范围广

腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞并且以成功应用于人类和非人来蛋白的表达。和其它病毒来源各种载体相比，已证明用于具有免疫活性细胞的基因表达时，腺相关病毒载体效果更好。

高滴度

按照此手册重组AA V-2可以生产出≥107 病毒颗粒/毫升的高滴度病毒。文献报道病毒原液经浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。

宿主细胞活跃的分裂不是感染的必要条件

重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞。

表达出的人类蛋白质可以正确的折叠和修饰

因为AA V Helper-Free System可以传递基因进入宿主人类细胞系，所以利用此系统表达的人类蛋白质可以正确的进行翻译后的修饰和折叠。

长期的基因表达潜能

重组AA V-2能保存于人类宿主细胞中，保持长期的基因转录潜能。在所有的细胞群中，病毒基因组通常存在于染色体上，一般形成串联体。这些串联体在缓慢分裂或非分裂细胞内稳定存在，在细胞群内长期进行基因转录和表达。然而，在处于高速分裂的细胞群内，则会丢失染色体上AA V基因组。病毒能整合今进宿主基因组，导致基因在分裂期细胞内长期表达，但是这是稀有事件。如果使用极高感染复数（MOI）的AA V进行感染或细胞被感染过野生型腺病毒并表达腺病毒复制酶，则整合发生的可能性会增加。然而，使用野生型腺病毒来增加整合事件会降低AA V系统的生物安全性。

AA V Helper-Free System简述

使用AA V Helper-Free System生产重组AA V颗粒示意图见图1。第一步是把外源基因克隆进合适的载体。大多数情况下，外源基因被克隆到一个包含ITR/MCS 的载体中（pAA V-MCS 或pAA V-IRES-hrGFP）。这些载体中反向末端重复（ITR）序列提供所有AA V-2复制和包装必须的顺式作用元件。

在一些情况下，插入到含ITR的载体的某些序列由于大肠杆菌内ITRs之间的同源重组而发生序列重排。这时，外源基因应首先克隆进穿梭载体pCMV-MCS 中，构建鉴定完成后，将包含表达框的Not I片段亚克隆进已经经Not I酶消化好的包含ITR的pAA V载体中。

重组表达质粒同pHelper（携带腺病毒来源的基因）和pAA V-RC（携带AA V-2复制和衣壳基因）共转染进AA V-293细胞（提供AA V复制和包装所需的所有反式作用因子）。从被感染AA V-293细胞中收集AA V-2病毒颗粒，随后用于感染各种哺乳动物类细胞。

感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒。病毒互补链的合成依赖于细胞复制因子。这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷（喜树碱或丁酸钠）来加速。然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。因此依托泊苷只能短期

使用或为了提高病毒滴度时使用。通常，为了基因的稳定表达，AA V基因组在细胞内会形成高分子量多联体。

图1 重组AA V颗粒的生产

载体特征

pAA V-MCS和pAA V-IRES-hrGFP(目录号#240075,)载体包含CMV启动子和当外源基因克隆进多克隆位点（MCS）时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件。这两个载体同时也包含指导病毒复制和包装的AA V-2反向末端重复序列（ITRs）。

除去这些共有的特征，pAA V-IRES-hrGFP载体还包含一个新型海生生物来源的人源化重组绿色荧光蛋白（humanized recombinant green fluorescent protein, hrGFP），作为翻译自脑心肌炎病毒（encephalomyocarditisvirus, EMCV）内核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）的第二个读码框进行表达。利用pAA V-IRES-hrGFP表达外源基因一个重要的好处是，hrGFP荧光可以用来直接测定重组病毒溶液的滴度。另外，既然两种蛋白质翻译自一个转录本，hrGFP的表达可以用来判断靶细胞的感染效率，也可以充当插入的外源基因的表达标志。pAA V-IRES-hrGFP在MCS的C-端有一个3×FLAG?。克隆的外源基因结构内带有的标签可以用抗-FLAG抗体进行检测或纯化。当转基因编码的蛋白质抗体无法获得时，这个特征就会很有用。由于AA V-2包装大小参数的原因，这些载体的可插入外源基因的大小是受到限制的。较少标记的pAA V-MCS载体推荐插入大小接近3kb，而pAA V-IRES-hrGFP只能容许插入≤1.7 kb。

注：当外源基因克隆进pAA V-IRES-hrGFP时，重组病毒溶液的滴度可以直接测定。然而由于IRES序列位于hrGFP可读框的前面，导致报告基因表达处于相对较低的水平。和重组pAA V-hrGFP-AA V病毒滴度相比，我们测定的pAA V-IRES-hrGFP-AA V的病毒滴度要低10倍。

当不能插入包含ITR的载体时，pCMV-MCS可以作为穿梭载体使用。这个载体提供CMV启动子和其它哺乳动物细胞高水平基因表达元件，但是缺少ITR序列。表达盒侧翼的Not I限制位点由于亚克隆包含外源基因的表达盒到包含ITR的载体中。任何包含ITR的pAA V载体（pAA V-MCS, pAA V-IRES-hrGFP, pAA V-LacZ

或pAA V-hrGFP）都可以用做接受亚克隆的载体。

pAA V-MCS和pAA V-IRES-hrGFP载体包含CMV启动子和当外源基因克隆进多克隆位点时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件。这两个载体同时也包含指导病毒复制和包装的AA V-2反向末端重复序列（ITRs）。

pAA V-LacZ和pAA V-hrGFP但当AA V-293包装病毒时监测转染效率的报告质粒，检测病毒产品的控制点和用作直接测定重组病毒滴度。在这些控制载体中，序列顺序依次为CMV启动子，LacZ或hrGFP表达盒，然是是ITR序列。pAA V-hrGFP 可以用作生产细胞系转染效率的质量评估和荧光显微镜和流式细胞仪（fluorescence activated cell sorting, FACS）监测病毒滴度。

pAA V-RC质粒包含AA V-2的依次编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因。稳固rep和cap基因的表达水平是获得期望的高滴度病毒产品的关键步骤。pAA V-RC利用两个不同的启动子分别控制Rep和Cap的表达，以获得每套基因产品的最佳表达水平。

pHelper质粒包含AA V-293生产高滴度病毒必须的腺病毒基因V A，E2A和E4的集合。AA V-2生产所必需的腺病毒蛋白质E1A和E1B在AA V-293细胞中稳定表达。

AA V-293细胞培养指南

AA V-293细胞说明

我们建议利用AA V-293细胞系来生产腺相关重组病毒溶液。AA V-293细胞衍生自通常使用HEK293细胞系，但是能生产出高滴度的病毒。HEK293细胞是用剪切过的5型腺病毒DNA改变过的人胚肾细胞。和HEK293一样，AA V-293也生产反式E1，这样当细胞用删除E1的腺病毒载体转染或用AA V Helper-Free System 三质粒（包含ITR质粒，pAA V-RC和pHelper）共转时能生产出具有感染能力的病毒颗粒。

注：使用AA V Helper-Free System，利用AA V-293细胞生产病毒颗粒是必须的。既然重组AA V-2载体需要衍生自HEK293的AA V-293细胞稳定表达腺病毒E1基因产物，那么利用其它细胞替代将不能凑效。所有步骤必须在层流净化罩无菌条件下完成。AA V-293细胞在组织培养盘中贴壁不佳，并具有成团趋势。换液时，吸液管靠在培养皿的边上轻轻地加入而不要直接加到细胞上，避免细胞单层的破

裂。为了确保溶液的完整性，维持高滴度生产表型维持AA V-293细胞≤50%的汇合率是非常重要的。

冻存AA V-293细胞的复苏培养

1. 将10mlDMEM生长培养基（见培养基和试剂的准备）加入15ml圆锥管中。

2. 将细胞冻存管放入37℃水浴中轻轻摇动1-2分钟使之融解。从水浴中拿出冻存管并通过用70%酒精（室温）擦拭管表面进行净化。

3. 将融解的细胞悬浮液移至装有10 ml生长培养基的锥形管中。

4. 200×g，3分钟，室温离心收集细胞。吸去生长培养基。

5. 加入5 ml新鲜生长培养基到锥形管中，用吸液管上下轻轻吹打使细胞悬浮。

6. 将5 ml细胞悬浮液移至75cm2含有10 ml新鲜生长培养基的组织培养瓶中。将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。

7. 每天监视细胞密度。当细胞培养至50%汇合率时要进行传代。接下来进行AA V-293细胞传代或AA V-293细胞液氮存贮液的准备。

AA V-293细胞的传代

注：下述的实验方案是从75cm2组织培养瓶中传代细胞。

当细胞单层达到50%汇合率时需要进行传代，如果细胞汇合率超过70%，AA V-293细胞会失去增强的病毒生产表型。

1. 在37℃水浴中预热DMEM生长培养基和胰酶-EDTA溶液。

2. 移去生长培养基。用10 mlPBS(phosphate-buffered saline)清洗细胞一次。

3. 用5 ml胰酶-EDTA溶液消化细胞1-3分钟。

注：用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。

4. 用5 ml生长培养基稀释细胞以使胰酶失活。

5. 分别转移2 ml的细胞悬浮液到每一个175cm2的组织培养瓶，共5瓶。每一瓶含有28 ml的生长培养基。将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。每天查看细胞密度，细胞汇合率要维持在50%。

§见培养基和试剂的准备。

AA V-293细胞液氮冻存

1．37℃水浴预热DMEM生长培养基，胰酶-EDTA溶液和冻存培养基。

2．收集健康的处于对数生长期的细胞。吸去生长培养基，用10 ml PBS清洗细胞。用胰酶-EDTA溶液作用于细胞1-3分钟。

注：用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。

3．用10ml生长培养基稀释细胞阻止胰酶作用。转移细胞悬液到50ml离心管中。取一小份细胞用血细胞计数器计数。

4．200 ×g，10分钟，室温离心收集细胞。吸除生长培养基。

5．用冻存培养基（见培养基和试剂的准备，不含抗生素）再悬浮细胞至1×106个/ml，然后分装细胞悬液到2ml冷冻管，1 ml/管。

6．通过逐渐降温冷冻细胞。将小管至于泡沫盒然后将盒子放入-80℃冷冻过夜。7．转移冻存细胞的小管到液氮中长期保存。

初级AA V溶液的制备

准备AA V-293细胞

在每一个100-mm组织培养盘10 mlDMEM生长培养基中加入3×106 个AA V-293细胞，48小时后用于转染。

注：为了获得较高的滴度，AA V-293细胞的健康和传代的密度是非常重要的因素。当细胞汇合率达到50%时须传代。当细胞在低代并生长健康是进行大量冻存是非常重要的。当传代和铺板用于转染时要避免细胞成团。在用AA V质粒转染之前细胞或许会生长到较高的汇合率。

AA V-293细胞的转染

尽管大量的转染实验方案可以成功用于这些载体的转染，但是推荐使用磷酸钙转染方法。本实验方案用于转染AA V-293细胞时，可稳定获得>107病毒颗粒/毫升的产品滴度。进一步获得高滴度AA V病毒的实验方法，属于保密资料，暂时不提供