腺相关病毒操作技巧——轻松入门
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介13.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第二章应用重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5血清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠乙二胺四/二硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸乙酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化乙锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎牛血清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白小时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野生型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
腺相关病毒（AAV）包装技巧
腺相关病毒（AAV）包装技巧上文已经介绍了腺相关病毒的基础知识，具有如此多优点、功能如此强大的腺相关病毒是如何生产的？本文将为大家揭开腺相关病毒生产的神秘面纱。
腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下文分解？怎么可能，下面就是腺相关病毒生产流程。
1）根据订单不同选择不同的载体，在此以人源基因克隆为例。
2）Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF （注：维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。
细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加入 50ml 离心管中， 800g 离心5min。
2) 配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。
3) 离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和日期。
5) 放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80度冰箱过夜。
（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）。
6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。
1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基，放培养箱预热至 37℃。
2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。
3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。
4) 摇晃均匀，放培养箱培养。
5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO 对细胞的毒害作用。
也可在第 3步中 800g 离心 5min，除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中）。
1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统【维真⽣物】提供AAV现货和AAV包装服务，已助⼒多位客户在顶级期刊发表⽂章。
产品说明书【详见维真⽣物官⽹→（腺相关病毒包装+腺相关病毒制备+腺相关病毒案例分享+腺相关病毒技术⼿册），或联系官⽹在线客服索要相关内容的链接。
】本产品仅限⽤于研究，严禁⽤于疾病诊断。
本产品仅供购买⽅内部研究使⽤，未经维真⽣物公司书⾯许可，严禁转售。
产品有限责任担保维真⽣物保证您收到的产品符合产品⽬录上的规格。
本担保规定了维真⽣物更换产品的责任。
维真⽣物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康⽤途的保证。
维真⽣物不对任何由于使⽤或不正确使⽤本公司产品造成的直接、间接的、衍⽣的或偶然的损害所产⽣的后果负责。
腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2⽣物安全⼆级⽣物安全柜中操作病毒。
2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴⼝罩和⼿套。
3. 请⼩⼼操作，避免产⽣⽓雾或飞溅。
被病毒污染的超净⼯作台，请⽴即⽤70%⼄醇加1% SDS溶液擦拭⼲净。
接触病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请使⽤新鲜配制的10％漂⽩粉进⾏消毒操作后丢弃。
4. ⽤显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，⽤70%⼄醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。
观察完毕，请⽤70%⼄醇再次擦拭显微镜实验台。
5. 离⼼病毒时，应使⽤密封性好的离⼼管，或⽤封⼝膜封⼝后进⾏离⼼，请尽量使⽤组织培养室内的离⼼机。
6. 实验完毕脱掉⼿套后，请⽴即⽤肥皂和⽔清洗双⼿。
个⼈保护措施1. 使⽤⼀次性⼿套。
2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使⽤⼀次性⼿术服或是相当的⾐物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服。
3. 佩戴护⽬镜或是⾯罩。
4. 所有的操作应当是在 Class II ⽣物安全柜中进⾏。
如果实验条件不能满⾜，则应当在空⽓稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间。
不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是⽓溶胶与⼈体接触–眼，⽪肤或是粘膜⽤⼤量清⽔冲洗眼睛或是其他接触的部位⾄少15 分钟。
ips操作指南-腺病毒版本
IPS操作指南第四版IPS操作指南--腺病毒版本IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。
现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。
2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。
他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
用Retrovirus、Lentivirus诱导IPS成功的例子已经非常多，但是由于retrovirus和lentivirus的基因组整合性，往往伴随基因组的破坏与癌化。
用Lentivirus和retrovirus 建立的IPS子宫移植繁衍而成的克隆鼠往往都伴随着肿瘤的高发生率。
Adenovirus（腺病毒）是一类滴度极高，不整合基因组，可以简单实现高效感染的病毒载体，近年来以Adenovirus介导的IPS诱导已被证实成功且安全。
一、实验材料腺病毒OSKM四因子：Ad-OCT4、Ad-SOX2、Ad-KLF4和Ad-c-MYC；病毒扩增细胞：293A细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。
二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。
耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。
三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。
腺病毒载体操作手册1407
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中⽂操作⼿册腺病毒载体操作⼿册中⽂版腺病毒重组系统AdEasyTM操作⼿册⽬录第⼀章简介13.2AdEasyTM系统中产⽣重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第⼆章应⽤重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆⼊AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英⽂全称中⽂全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5⾎清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin⼩⽜⾎清⽩蛋⽩聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide⼆甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate⼗⼆烷基硫酸钠⼄⼆胺四/⼆硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid⼄⼆胺四⼄酸⼄酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化⼄锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎⽜⾎清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋⽩⼩时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野⽣型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第⼀章简介当今基因输送技术的发展⽇趋复杂，⼀些治疗药物（⽣长激素、⼲扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋⽩（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更⾼效的基因输送⼯具。
腺病毒感染细胞具体步骤及方法
腺病毒感染细胞具体步骤及方法操作工具•慢病毒•腺病毒•腺相关病毒•悬浮细胞专用病毒•质粒基因调控•CRISPR/Cas9•RNA干扰•过表达•非编码基因•组织特异性启动子•Cre-loxp疾病研究•心血管领域•肝脏•眼•肺•脂肪、骨、肾脏神经领域•神经系统•光遗传•化学遗传•钙离子成像腺病毒腺病毒（Adenovirus）是一种线性双链DNA无包膜病毒，对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，且具有嗜上皮细胞性。
重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体，它可通过受体介导的内吞作用进入细胞内，但腺病毒基因组不整合进入宿主细胞基因组中。
腺病毒作为一种常用的基因操作工具，在心血管领域、肝脏、肌肉、肺、肿瘤及其他领域广泛应用。
优势腺病毒与其他病毒工具比较，具有以下优势：a. 是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统：腺病毒感染细胞后，1-2 天即可表达，是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统;b. 滴度高：腺病毒系统在转有E1 基因的HEK293 细胞中可进行自我复制，可产生滴度为1010到1011 PFU/mL 的病毒;c. 载体容量大：可容纳不超过5kb 的片段;d. 不整合到染色体中，无插入致突变性：腺病毒除卵细胞以外，几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应。
包装服务质量检测载体选择粒成提供完善的腺病毒产品体系，用于操作编码基因和非编码基因，如lncRNA、microRNA、circRNA。
应用案例1. 细胞感染。
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CAG，广谱 CAG，广谱 CAG，广谱 CAG，广谱 EF1a，广谱
4、汉恒生物AAV-retro神经逆行示踪工具现货列表（表4）
载体类型
载体名称
启动子及其特点
神经逆行标记 神经逆行标记 神经逆行标记 神经逆行标记 神经逆行标记
AAV2/retro-EGFP AAV2/retro-CAG-cre AAV2/retro-DIO-EGFP AAV2/retro-DIO-tdtomato AAV2/retro-EF1a-DIO-Flp
1.5 kb
CAG，广谱，强
mcherry
否
pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen
1.2 kb
CAG，广谱，强
ZsGreen
是
过表达 干扰
pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-GFAP-T2A-EGFP pHBAAV-U6-MCS-CMV-ZsGreen pHBAAV-U6-CMV-mCherry
04
是否Cre依赖
是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否
腺相关病毒操作手册
3、汉恒生物AAV化学遗传学工具现货列表（表3）
载体类型
白喉毒素介导的 细胞毒性
Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子）， 强
CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子）， 强
GFP GFP GFP mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry
02
腺相关病毒操作手册
＋ 汉恒AAV产品特点
● 安全-AAV不参与任何疾病的发生，已经用于临床疾病的治疗； ● 高效-病毒滴度高达1013以上，组织感染能力超强； ● 表达周期久-AAV免疫原性超低，基因持续表达半年以上； ● 最全血清型-拥有全部血清型和一系列突变体亚型，几乎可以感染所有的组织和脏器； ● 组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动子工具箱，如心脏、肝脏、
CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子）， 广谱，强
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子）， 强
CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子）， 广谱，强
CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子）， 广谱，强
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
1.2 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb shRNA shRNA
CAG，广谱，强
mcherry
是
hSyn，成熟神经元，
中强度
ZsGreen
否
hSyn，成熟神经元，
中强度
mcherry
否
CamkII，兴奋性经元
ZsGreen
否
神经特异启动子，强
CamkII，兴奋性经元
--您身边的病毒载体专家
腺相关病毒操作手册
目录
01
一、AAV安全注意事项 二、AAV储存和稀释注意事项
02
三、AAV介绍 四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表
06
五、AAV整体实验流程 六、实验材料
07
七、AAV载体构建 八、AAV包装
九、AAV收集和纯化
08 十、AAV滴度测定
09
十一、AAV感染细胞测试 十二、AAV用于动物实验（重磅干货，五星推荐）
CAG（人巨细胞病毒启动 子CMV和鸡beta-actin嵌 合型启动子），广谱，强
CMV（人巨细胞病毒启动 子），广谱，强
hSyn（人源成熟神经元特 异启动子），中强度
GFAP（星形胶质细胞特异 启动子），中强度
CaMKII（兴奋性经元神经 特异启动子），强
标记基因
EYFP mcherry
EYFP mcherry
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。汉恒生物 已对病毒进行了分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。
b．若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。
01
＋ AAV的稀释
需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用无菌PBS或生理盐水 混匀分装后置于4℃保存（一周内使用完最佳）。
04
接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸的离心管，如有必要请用封口膜封口
后离心。
06 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
07 实验完毕后请用洗手液清洗双手。
二、AAV储存与稀释的注意事项
＋ AAV的储存
收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期 保存请分装后放置于-80℃。
三、AAV介绍
腺相关病毒（AAV）属微小病毒科（parvovirus），为无包膜的单链线状DNA病毒。只有在 腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相 关病毒。典型的AAV2基因组约 4800 bp，包括2个反向末端重复序列（ITR，145 bp）和两个读 码框（ORF）-Rep和Cap（图1）。ITR对合成互补DNA链是必需的；Rep和Cap可以翻译成多种 不同蛋白，如AAV生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及 VP3等。AAV病毒系统就是用目的基因替换掉Rep和Cap，然后与表达Rep和Cap基因的质粒共转 ，从而产生包含目的基因的AAV。目前AAV有12种血清型、100多种变体。不同的血清型对组织 或器官有着不同的亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV被称为目前最 适合在体研究（in vivo）基因功能的利器。
mcherry
否
神经特异启动子，强
GFAP，星形胶质细胞，
EGFP
否
中强度
U6
ZsGreen
否
U6
mcherry
否
circRNA过表达 pHBAAV-CMV-crRNA-EF1-ZsGreen
1.2 kb
CMV，广谱，强
ZsGreen
否
在体敲除 pHBAAV-gRNA-saCas9
gRNA
U6
无
否
03
肌肉以及各种神经元特异的启动子等； ● 病毒产品全部经过无菌、无支原体、无内毒素检测，让实验安全放心。
＋ 汉恒生物AAV主要载体及现货列表
1、汉恒生物AAV主要载体列表（表1）
（部分组织特异性启动子如心脏、肝脏、肌肉等没有在表中列出，欢迎咨询定制。）
载体类型
载体名称
可插入片段大小 启动子及其特点 标记基因 是否Cre依赖
pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen
1.6 kb
CMV，广谱，强
ZsGreen
否
pHBAAV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen
1.2 kb
CMV，广谱，强
ZsGreen
否
pHBAAV-CAG-MCS-T2A-ZsGreen
1.5 kb
CAG，广谱，强
ZsGreen
否
pHBAAV-CAG-MCS-T2A-mcherry
EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP
4.8 kb
rep
cap
ITR
Replication
Capsid
ITR
AAV2基因组示意图
四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表
＋ 汉恒AAV产品分类
● 常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 常规启动子和组织特异性启动子驱动的AAV-Cas9定制； ● AAV介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表3）； ● 双标、单标LC3自噬流监测工具（见表5）； ● 组织特异性AAV-DIO载体的定制（原理见附件1）。
载体名称
启动子及其特点
标记基因
pHBAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFP pHBAAV-hSyn-DTR-2A-GFP pHBAAV-CaMKII-DTR-2A-GFP pHBAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)-mCherry pHBAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry pHBAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry pHBAAV-CaMKII-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-CaMKII-hM4D(Gi)-mCherry