微生物菌种鉴定方法
SMP-QC0028微生物鉴定管理规程
SMP-QC0028微⽣物鉴定管理规程⼀、⽬的：规范菌种以及控制菌检查中疑似菌的鉴定程序，以减少菌种污染和⽣长特性的改变，确保实验室安全和实验结果可靠。
⼆、范围：适⽤于实验室所⽤标准储备菌株和控制菌检查中疑似菌的鉴定。
三、职责：品质部：确保使⽤的菌株是可靠的，准确鉴别样品中控制菌，保证实验结果可靠。
四、内容：1、试验菌株:⼤肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]⽩⾊念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]⿊曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]沙门菌（Salmonella）[CMCC(B)50094]2、菌种确认试验的主要内容：2.1 菌种的纯度确认。
2.1.1 试验内容。
①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同⼀平板上的单菌落的⼤⼩、形状、颜⾊、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数⽣长期的培养物⾰兰⽒染⾊反应应呈现⼀致性；细胞形状、⼤⼩、荚膜、芽孢等特征应相似。
2.1.2 菌种的特性确认。
⽣化试验：各种微⽣物具有各⾃的独特的酶系统，因⽽在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物⼜具有不同的⽣化特征。
根据此特征，利⽤⽣物化学⽅法来鉴定不同的微⽣物的试验即为微⽣物的⽣化试验。
2.1.3 菌种的确定⽅法。
⽤⽆菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单⼀纯菌落，进⾏⾰兰⽒染⾊、镜检，观察其染⾊特性及菌形。
临床微生物学检验：链球菌属
肺炎链球菌脐窝状菌落（培养48h后）
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肺炎链球菌粘液样菌落 28
3.生化反应
• 分解葡萄糖，产酸不产气。 • 一般不分解菊糖，不被胆汁溶解（鉴别
甲型溶血性链球菌与肺炎链球菌）。 • 触酶（-），与葡萄球菌不同。
•肺炎链球菌： 分解葡萄糖、乳糖和菊糖，胆汁可溶菌， Optochin敏感，触酶（-）
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小结
• 链球菌属细菌种类多，其中某些菌种为毒力强的 致病菌。分类较为复杂，临床分离株仍以传统的 血平板上溶血现象、菌落特点和Lancefield抗原 血清分型，结合生化反应进行鉴定。
• 肺炎链球菌：革兰阳性双球菌，有荚膜，脐窝样 菌落、OP（+）、胆汁溶菌（+）
• A群链球菌：镜下特点、菌落特点、杆菌肽、血清 试验
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链球菌微生物检验程序
涂片染色 G+球菌，触酶（-）
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五、药敏试验药物选择
β溶血链球菌 肺炎链球菌 草绿色链球菌
药敏时药物选择不同
首选青霉素和氨苄西林
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预防分娩妇女B群链球菌感染：
①推荐使用青霉素和氨苄西林。 ②低危险性青霉素过敏者，推荐头孢唑林。 ③高危险性青霉素过敏者推荐克林霉素或红霉素
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血清学检查
抗O试验（ASO test）： 链球菌侵入体内产生SLO，刺激机体产生
相应抗体ASO(血清），加入SLO乳胶试剂，SLO 抗体(ASO)与乳胶试剂(吸附有SLO)反应，产生 凝集，为阳性；无凝集，为阴性。
–原理：中和试验，用SLO检测血清中的ASO –方法：间接凝集 –结果：效价大于400单位 –意义：活动性风湿热及肾小球肾炎辅助诊断
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急性肾小球肾炎的临床表现：水肿、 血尿、蛋白尿等。
微生物菌剂执行标准
微生物菌剂执行标准微生物菌剂是一种利用微生物生长和代谢产物对土壤、植物和环境进行改良和保护的生物制剂。
为了确保微生物菌剂的质量和效果，制定了一系列的执行标准，以规范微生物菌剂的生产和使用。
本文将介绍微生物菌剂执行标准的相关内容。
一、菌种筛选和鉴定。
在微生物菌剂的生产过程中，首先需要进行菌种的筛选和鉴定。
这是确保微生物菌剂质量的重要环节。
菌种的筛选应根据目标作用和环境条件，选择对目标作物有益的优势菌株。
菌种的鉴定则需要通过一系列的实验手段，确认菌株的纯度、活力和稳定性。
二、菌剂生产工艺。
微生物菌剂的生产工艺对菌剂的质量和效果有着直接的影响。
在微生物菌剂生产过程中，需要严格控制发酵条件、培养基配方、发酵时间等参数，确保菌剂的活菌数、活性和稳定性。
同时，生产过程中需要遵循相关的卫生标准，防止杂菌的污染。
三、产品质量检测。
微生物菌剂的质量检测是保证菌剂质量的重要环节。
常用的检测项目包括菌剂的活菌数、菌剂的纯度、菌剂对抗性等。
通过对菌剂质量的检测，可以确保菌剂的质量符合标准要求，从而保证菌剂的使用效果。
四、包装和储存。
微生物菌剂在包装和储存过程中需要符合相关的标准要求。
包装应选用符合食品级标准的包装材料，确保菌剂在运输和储存过程中不受外界环境的影响。
同时，菌剂的储存条件也需要符合相关的标准，避免菌剂的失活和变质。
五、使用方法和注意事项。
在微生物菌剂的使用过程中，需要遵循相关的使用方法和注意事项。
首先需要根据目标作物和土壤环境选择合适的施用方法和剂量。
其次，在施用过程中需要避免与化肥、农药等农产品发生混用，以免影响微生物菌剂的效果。
同时，需要注意施用时间和环境条件，确保微生物菌剂能够充分发挥作用。
六、效果评价和监测。
微生物菌剂的使用效果需要进行评价和监测。
通过对作物生长情况、土壤改良效果等指标的监测，可以评估微生物菌剂的使用效果。
同时，也可以根据监测结果对微生物菌剂的使用方法进行调整和优化，以提高微生物菌剂的使用效果。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求(一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种得性能就是最重要得因素。
(二)、微生物工业对菌种得要求就是:(１)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力;(２)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物;(3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力;(4)能够高效地将原理转化为产品;(５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小;(６)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;(7)在发酵过程中产生得泡沫要少;(8)具有抗噬菌体得能力;(9)遗传稳定性,二、工业用微生物菌种得来源及选育(一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选:(1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;(２)从大自然中采集样品分离;(3)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株、当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。
(二)微生物工业菌种得分离1、野生菌株得分离、筛选过程(１)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下:标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—1５cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。
为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离、②标本预处理④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落、⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。
atcc 0代菌种标准
ATCC 0代菌种标准一、菌种识别ATCC 0代菌种是指由美国菌种保藏中心（ATCC）保存的、具有特定基因型和表型特征的微生物菌种。
在菌种识别方面，ATCC 0代菌种的标准包括：1.微生物分类学鉴定：通过形态学、生理学和分子生物学等方法对菌种进行分类学鉴定，确保其属于正确的物种。
2.基因型特征：通过基因测序、PCR等方法确定菌种的基因型特征，以确保其与所保藏的菌种一致。
3.表型特征：观察菌种的表型特征，如形态、大小、颜色、运动性等，以确保其与所保藏的菌种一致。
二、培养条件ATCC 0代菌种的培养条件应符合微生物培养的基本要求，包括培养基、温度、湿度、气体环境等。
具体培养条件应根据不同菌种的要求进行设置。
在培养条件方面，ATCC 0代菌种的标准包括：1.培养基：选择适宜的培养基，以支持菌种的生长和繁殖。
培养基的成分和制备方法应根据不同菌种的要求进行选择和制备。
2.温度：控制培养温度，以支持菌种的生长和繁殖。
不同菌种所需的温度条件可能不同，应根据菌种的要求进行设置。
3.湿度：控制培养湿度，以支持菌种的生长和繁殖。
不同菌种所需的湿度条件可能不同，应根据菌种的要求进行设置。
4.气体环境：控制培养气体环境，以支持菌种的生长和繁殖。
不同菌种所需的气体环境可能不同，应根据菌种的要求进行设置。
三、基因型和表型特征ATCC 0代菌种应具有特定的基因型和表型特征，这些特征是鉴别和区分不同菌种的标志。
在基因型和表型特征方面，ATCC 0代菌种的标准包括：1.基因型特征：确定菌种的基因型特征，包括染色体序列、质粒序列等，以确保其与所保藏的菌种一致。
2.表型特征：观察菌种的表型特征，如形态、大小、颜色、运动性等，以确保其与所保藏的菌种一致。
四、质量控制为了确保ATCC 0代菌种的质量和稳定性，需要进行质量控制。
质量控制包括定期进行菌种鉴定、培养条件检测、基因型和表型特征观察等。
在质量控制方面，ATCC 0代菌种的标准包括：1.菌种鉴定：定期进行微生物分类学鉴定，以确保菌种的纯度和身份。
微生物的鉴定
放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造； 孢予的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
（2）群体形态特征：
a.在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大 小、光泽、粘稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、 质地、气味、是否分泌水溶性色素等； b.在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、
对各种碳源利用的能力能否以co为唯一碳源各种糖类的利用情况等对各种氮源的利用能力能否固氮硝酸盐和铵盐利用情况等能源的要求光能还是化能氧化无机物还是氧化有机物等对生长因子的要求是否需要生长因子以及需要什么生长因子等
微生物的鉴定
微生物的鉴定（identification）:
借助于现有的微生物分类系统，通过特 征测定，确定未知的、或新发现的、或未 明确分类地位的微生物所应归属分类群的 过程。
所谓经典的分类鉴定方法， 是相对于现代的分类鉴定方法而 言的，通常指长期以来在常规鉴 定中普遍采用的一些形态、生理、 生化、生态、生活史和血清学反 应等指标。
1．形态学特征
（1）细胞形态在显微镜下观察细胞外形大 小、形状、排列等； 细胞构造；革兰氏染色反应；能否运动、 鞭毛着生部位和数目；有无芽孢和荚膜、芽孢 的大小和位置；
在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴 定指标尚停留在细胞的形态和习性水平上，这类 方法称作经典的分类鉴定方法；从本世纪60年代 起，后三个水平的分类鉴定的理论和技术即化学 分类的开始发展，度为探索微生物的自然分类系 统打下了坚实的基础，这些方法再加上数值分类 法，可称为现代的分类鉴定方法。
（一）、经典分类鉴定方法
二、微生物鉴定方法
通常把鉴定微生物的技术分成四个不同水平：① 细胞的形态和习性水平，例如用经典的研究方法，观 察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生 长条件等。②细胞组分水平，包括细胞组成成分例如 细胞壁成分，细胞氨基酸库，脂类，醌类，光合色素 等的分析，所用的技术除常规实验室技术外，还使用 红外光谱、气相色谱和质谱分析等新技术。③蛋白质 水平，包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应 等若干现代技术。④基因或 DNA 水平，包括核酸分子 杂交（DNA与DNA或DNA与RNA），G＋Cmol%值的测定， 遗传信息的转化和转导， 16S rRNA （核糖体 RNA ）寡 核苷酸组分分析，以及DNA或RNA的核苷酸顺序分析等。
第一章_微生物的分类与鉴定(2学时)
G菌 gram positives
古细菌 achaca
真核生物 cukarya
紫色硫细菌 purple bacteria 蓝细菌 cyanobacteria 黄杆菌属 flavobacteria themotogales
动物 animal 真菌 甲烷八叠球菌 粘菌类 fungi methanosarcina Slime entanoebae molds 甲烷杆菌属 植物 crenarcaeoya methanobacteria plants 嗜盐菌 halophiles 热变形菌属 甲烷球菌属 thermoproteus methanococcus 纤毛类 ciliates 热球菌属 thermococctus 鞭毛类 热网菌属 flagellates pyrodictum 三分体 korarchaeota trichononds 微担孢体 microsporidia 二分体 diplononods
2、核酸杂交
基本原理：不同菌种的同源序列之间互补结合 形成杂合双链；杂交率越高，其亲缘关系就越 近 具体方法：DNA-DND杂交，DNA-rRNA杂交 ，核酸探针 应用：杂交同源性在20~60%是同属不同种， 在60%以上为同一个种，超过70%为同一个亚 种
3、16SrRNA碱基测序
二、微生物的鉴定
（一）形态学特征测定 （二）生理生化特征测定 （三）血清学试验 （四）核酸的碱基测序与分子杂交 （五）蛋白质的氨基酸序列分析
（五）蛋白质的氨基酸序列分析
氨基酸测序：蛋白质的氨基酸序列直接反映 mRNA顺序，同源蛋白质氨基酸序列相似性越 高，其亲缘关系越近 肽指纹图谱测定：蛋白质的肽质量指纹图谱可 以作为种以下分类和鉴定的依据
家蚕肠道微生物的检测
家蚕肠道微生物的分离实验方法1、目的：对4-5龄的家蚕肠道进行解剖，分离出其中的微生物，进行培养纯化，最后得到单一的菌种，进行菌种鉴定分类。
2、材料及试剂2.1 供试材料供试家蚕品种为苏秀×春丰，桑叶品种为育711。
2.2 培养基肉汤蛋白胨培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、蒸馏水1000 ml煮沸后调节ph 7.2-7.4分装到三角瓶中，121 ℃高压灭菌15 min。
富集培养基:称取胰化蛋白胨1 g,酵母提取物0.5 g ,Na Cl g,溶解并定容于100 ml容量瓶中,转入锥形瓶中,高于灭菌,接种,摇床培养6 h。
2.3 主要试剂乙醇、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、稀释液为生理盐水3、试验方法3.1 菌种纯化与分离（1）将4-5龄蚕的头尾夹住，在70 %的酒精中浸泡几秒钟后，在酒精灯上燃烧，进行体表消毒，然后用灭菌剪刀剪开体表，取出中肠，将肠液小心挤入盛有9 ml稀释液的试管中，取肠液1 g。
（2）为了达到对蚕肠道微生物良好的分离效果，有必要对提取的肠液进行较好的稀释。
将4-5龄蚕肠液用灭菌生理食盐水按10-1、10-2、10-3、10-4浓度进行梯度稀释,各浓度稀释液取0.2 ml接种于12 cm 培养皿的肉汤蛋白胨培养基上,均匀涂布,37 ℃下培养2天，挑取单菌落，编号，观察菌生长情况。
根据的生长情况和菌落数，选取最佳稀释均匀浓度。
（3）将得到的菌落进一步纯化，直到镜检为单一菌为止。
将纯化好的菌接种到斜面培养基上进行保存。
3.2 菌种鉴定（1）菌落形态观察将纯化好的菌在相应的琼脂平板上划线，30℃培养箱中培养2天，待长出单菌落后，根据颜色、形状、大小、边缘、透明度、突起等。
（2）菌体特征的显微观察取一个干净的载玻片,在无菌操作条件下,用接种环挑取少许已活化的优势菌菌落均匀地涂布在载玻片上,室温条件下自然干燥。
接着,手执载玻片并使标本面朝上,在酒精灯外焰上快速通过3-4次,使标本固定在载玻片上。
乳酸菌菌种的分离筛选方法解读
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL 培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0 μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80 等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一. 筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6 →选择合适的稀释度涂布→ 37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
微生物考核肛拭子(增菌及质控修改)
微生物质控考核菌种的鉴定常州市疾病预防控制中心杜强徐晓怡王小萍等菌种鉴定是疾病预防控制中心实验室常见的考核方式之一。
它不但证明了该实验室有能力进行规定类型的检测和（或）校准，而且对于该实验室管理和技术的提高也具有十分重要的促进作用。
本中心于今年8月份接受了省疾控的微生物质控考核并获得了较好的成绩，现将情况简述如下。
1 材料和方法1．1 考核材料：一支带有未知致病菌的肛拭子。
1．2 考核要求：假设此肛拭子是来源于一腹泻病人，要求从中检出一至数种致病菌，提示可能菌种范围限定于申报的数种腹泻致病菌。
时间要求3天。
1．3 检验试剂：本次检测培养基为宜兴万石培养基厂产品，微量生化管由浙江省军区后勤卫生防疫检验所提供，沙门菌诊断血清（56种）由成都生物制品研究所提供，志贺菌诊断血清（50种）和出血性大肠杆菌O157由兰州生物制品研究所提供，均在有效期内。
1．4 检验依据：GB/T 4789-2003食品卫生国家标准、《食品卫生检验方法注解（微生物部分）》（孟昭赫）2 检验步骤及结果判断2．1 确定检测目标：首先根据检测要求，确定可能的菌种有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、致病性大肠埃希氏菌共7种。
2．2 增菌及平板划线分离：无菌操作，取肛拭子接种于营养肉汤内，37℃培养24h后分别划线接种于以下各类选择性平板：两块SS平板（编号为1-A和1-B）， 37℃，培养24h；两块血平板（编号为2-A和2-B）， 37℃，培养24h。
两块氯化钠蔗糖平板（编号为3-A和3-B）， 37℃，培养24h。
两块4号琼脂平板（编号为4-A和4-B）， 37℃，培养24h。
2．3 平板生长情况：两块SS平板（编号为1-A和1-B）上有三类菌落，一类为无色半透明，中等大小，圆整润滑，中心黑色的菌落生长（编号为A），一类为中等大小，略微泛红，湿润，光滑的菌落（编号为B）。
一类为较小，扁平，生长不良，有粘性但不易挑起的菌落（编号为C）。