金银花中绿原酸的提取与分离
金银花中绿原酸的提取及纯化方法比较
第２ ６卷第 １ 期
２０ ０ ６年 ３月
林 产 化 学 与 工 业
Ｃｈ ｍｉｔｙ ａ ｄ Ｉ ｄ ｓｒ ｆ Ｆ ｒ ｓ ｏ ｕ ｔ ｅ ｓｒ ｎ ｎ ｕ ｔ ｏ ｏ ｅ ｔＰｒ ｄ ｃｓ ｙ
Ｖｏ ． ６ ．１ １２ Ｎｏ Ｍｆ．２ ６ ｉ ｒ ｏｏ
中图分类号 ：Ｑ ｌ Ｒ ８ ． Ｔ ｇ ；２ ４ ２
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ：２３— ４ ７ ２ ０ ） １ Ｏ １ Ｏ ０ ５ ２ １ （ ０６ ０ 一 １６一 ５
Ｃｏ ａ ｉｏ ｆＴｅ ｈ ｏ ｏ ｉ ｓ ｏ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ｔａ ｔ ｎ ａ ｄ Ｐ ｒｆｃ ｔ ｎ ｏ ｍｐ ｒｓ ｎ ｏ ｃ ｎ ｌ ｇ ｅ ｆ Ｅｘｒ ｃｉ ｎ ｕ ｉｉａ ｉ ｆ ｏ ｏ
论 述 和 比较 ， 且 结 合 实 际 生 产 应 用 的 可 行 性 ， 出 了合 理 的操 作 工 艺 ： 用 水 提 法 提 取 出金 银 花 并 提 先
中的有 效成 分， 再用大孔树脂法对提 出物进行纯化 ， 最终可得 到提取 率及纯度都较 高的绿原酸。
ＸＩ ＡＮＧ Ｎ Ｚ
关键词 ： 金银花 ； 原酸 ； 取 ； 绿 提 纯化
的含量 随提取 时 间延长 而逐 步降低 ， 随浓缩 干燥 时 间延长 、 度升 高而 明显 降低 ； 亦 温 以水 提减 压浓 缩 、 真
空 干燥所 得绿 原 酸含量 较高 。 １ ２ 石硫 法 （ ． 水提 石灰 乳法 ）
在金 银花 水提 液 中加入 石灰 乳 ， 绿原 酸 与钙 盐 生 成 沉 淀 ， 然后 用 硫 酸 分 解 沉 淀 ， 程 见 文 献 ［ ］ 流 ３ 。 该 法操 作简单 、 济 ， 提取 物 和绿 原酸 得 率 均较 低 Ｊ其 原 因 可能 有 ： ） 原 酸 是 奎尼 酸 和 咖 啡 酸 的 经 但 ， １绿
金银花中绿原酸的酶法提取工艺优化
维普资讯
２０ ０ ８年第 ２期
牙
膏
工
业
１ ３
为 ０ ０ ０ ５￣／ 、 ． ０ ７ Ｉ ／ 、 ． ０ ５￣／ Ｌ ． ０ ５ Ｉ ｍＬ ０ ０ ２ ５ ｇ ｍＬ ０ ０ ５ Ｉ ｍ 、 ｇ ￣ ｇ
０． ２ ５Ｉ ／ｍＬ、 ０ ｍ ｇ ０ ７ ￣ｇ ０． ５５ ／ｍ Ｌ、 ０．１ ５￣ｇ ６ ／ｍＬ、 ５ ｇ ０． ５ ／
绿 原 酸的一 些研究 。
流 动相 ： 乙腈 ： ． ％磷酸 ＝１ ：７ 体积 比 ） ｐ ０４ ３８ （ ，Ｈ
＝
２． ４； ０
流速 ：． ｍＬ ｍ ｎ ０ ５ ／ ｉ；
绿 原酸是 胞 内物 质 ， 细胞 壁 主 要 由纤 维 素 组 其
成， 纤维 素酶 是可将 纤 维素 水 解 成 水 溶 性 糖 的复 合 酶类 。金 银花 用纤 维 素 酶 处 理后 ， 胞 壁 中的纤 维 细 素 被水解 成水 溶性 的糖 类 物 质 ， 细 胞 壁 的水 解 破 而 裂 有利于胞 内物质 的 溶 出 ， 因而 酶 法 提 取 能 提 高 绿
公 司 ） ；
２３ 对照 品溶 液的制备 ．
精密 称取绿 原 酸对 照品适 量 ， 置棕色 量瓶 中 ， 加 甲醇溶 解定 容 ， 制成 ５ ０ ｇ ｍＬ的绿原 酸溶 液 （ ５１／ ￣ 冰箱
ｐ Ｓ一 Ｃ精密 ｐ Ｈ ３ Ｈ计 （ 上海 雷磁 精 密仪 器厂 ） 。
冷藏保 存 ） 。将 上述 对 照 品溶 液 用 流动 相 稀 释坪 坝大 药房 ） 重 。 乙腈 、 甲醇 、 磷酸 为市 售分 析纯 ； 实验用 水 为 自制 蒸馏 水 。
２ 方 法与 实验 ２ １ 色谱条 件 ．
波提取 法 、 波 提取 法 、 速 逆 流 色谱 分 离 微 高
指纹图谱方法
方法1 参照物的选择及溶液制备绿原酸为金银花的主要成分，而且所选择的金银花药材供试品溶液提取方法很容易将绿原酸提取出来，在色谱图中容易辨认，所以选择绿原酸作为参照物。
参照物溶液的制备方法：取绿原酸对照品适量，加50％甲醇配制成每毫升含0.06 mg的溶液，即得。
2 检测波长及流动相的选择根据文献报道，绿原酸类化合物是金银花的主要活性成分，经测定绿原酸参照物溶液和金银花药材提取液在327 nm处均有最大吸收，因此，选择327 nm 为测定波长。
在用同一浓度的样品溶液、色谱柱、流速（0.7 ml/min）、检测波长和HPLC 仪器的条件情况下，通过对多种溶剂系统进行考察，最后确定的最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（40∶60），流速为0.7 ml/min，检测时间30 min。
3 提取方法的选择金银花中主要有效成分为绿原酸、异绿原酸，它们是奎宁酸和咖啡酸的酯，其中绿原酸含量高，是金银花及其相关制剂的活性指标成分。
参照文献资料［4，5］，经对多种提取溶剂研究，结果表明，以50%甲醇溶液作为提取溶液进行超声提取，能将金银花中绿原酸类成分充分提取，提取液中有效成份不需要进一步提取分离与富集，可以直接进样分析。
4 供试品溶液的制备取金银花药材，置硅胶干燥器中干燥24 h，研细，取约0.5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加50％甲醇50 ml，超声处理30 min，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
5 测定法及数据处理分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录30min的色谱图。
用中国药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”（版本2004A）进行数据处理，将多个批次的色谱图进行比较，得到可全面反映多个色谱图特征的金银花药材的对照指纹图谱。
以此模式为基准，计算每个色谱图与之相比较的相似度（范围应在0.90～1.99之间）。
金银花提取物中绿原酸含量测定方法(H)
编号:FZD0166 金银花提取物中绿原酸（Chlorogenic acid）含量测定方法
一、色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3 150mm×4.6mm 5μm
流动相：乙腈：水：0.4%磷酸水溶液（13：87，V/V）
流速：1mL/min
检测波长：327nm
柱温：25℃
进样量：10μL
二、溶液制备
1. 对照品溶液制备精密称取绿原酸对照品约5mg于50mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解定容。
2. 样品溶液制备精密称取金银花提取物样品适量，于50mL容量瓶中，加入50%甲醇超声振荡20min后，冷却至室温定容，用0.45μm微孔滤膜过滤即得。
三、样品测定
在上述色谱条件下，待仪器稳定基线平稳后进样测定，绿原酸保留时间约为12min，用外标法计算含量。
金银花中绿原酸和木犀草苷的同时提取及测定研究
金银花中绿原酸和木犀草苷的同时提取及测定研究王海侠;汪玮鑫;时维静;郜尽【摘要】Objective： To optimalize the extracting conditions of chlorogenic acid and galuteolin from Flos lonicerae, and develop one method for the content determination of chlorogenic acid and galuteohn. Methods： Through designing a L9 （34） orthogonal test to screen the best extracting parameters and extract chlorogenic acid and galuteolin in Flos lonicerae of the five different production regions under the condition. Then a HPLC method was dopted to determine the content of those samples. Results： Orthogonal experiment demonstrated that the best extracting conditions included solution of 35mL 50% ethanol and extracting time of one hour at 70~C. HPLC method： the mobile phase was 0.5% acetic acid and methanol, gradient elution separation,and detect at wave- length 350nm. A good linearity of chlorogenic acid and galuteolin was within the range of 0.2 - 1.6 ug and 0.2 -2.2 ug respectively, and the linear equations was y = 1 x 106x - 806 7 and y = 4 x 106x - 119 017, with regression coefficient 0. 999 9 and 0. 999 7. The precision, reproducibility, recovery of the method were all proved perfect. The four content of the chlorogenic acid and galuteolin of the five different production regions are higher than the required standard of Chinese Pharmacopoeia.%目的：优化金银花样品中绿原酸和木犀草苷提取工艺，并建立两者含量同时测定的方法。
金银花中绿原酸含量测定
金银花中绿原酸含量测定摘要】目的：通过测定金银花中主要特征成分绿原酸含量评价金银花品质。
方法：高效液相色谱法。
采用C185柱（250mm×4.6mm），流动相为乙腈-1.0%冰醋酸溶液，0.45μm滤膜抽滤，流速为1.0ml/min，检测波长为242nm。
结果：绿原酸进样量在0.2～1.0μg范围内与峰面积线性关系良好，精密度RSD为1.13%，平均回收率为101.2%。
结论：高效液相色谱法测定金银花中绿原酸含量操作简便，结果准确，可用于对金银花品质的评价。
【关键词】高效液相色谱法；金银花；绿原酸；含量；测定【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）06-0374-02金银花具有清热解毒之功效，绿原酸是其中的主要特征成分，而且也是目前所发现的金银花中药理活性最强的物质。
绿原酸是植物进行有氧呼吸过程中产生的苯丙素类化合物，经现代药理研究证实，这种化合物不仅能够抗病毒，而且可以止血、利肝利胆、抗氧化。
因此，绿原酸含量是金银花品质评定的重要依据。
通过提取绿原酸，并测定绿原酸含量，将为金银花药物开发与利用提供支持。
本文将探讨采用高效液相色谱法测定金银花中的绿原酸含量。
1．材料与方法1.1 材料与仪器材料：将采摘的金银花放置阴凉处，直至质量稳定。
使用粉碎机将金银花粉碎，过40目筛，以备试验使用。
试剂：绿原酸对照品（批号110753-200413）由中国药品生物制品检定所提供；水为纯化水；乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
仪器：采用美国安捷伦公司生产的全自动液相色谱仪系统Aligent1100（四元梯度洗脱泵、二极管检测器、温柱箱等）；昆山市超声波仪器有限公司生产的超声波清洗器；梅特勒-托利多仪器上海有限公司生产的电子分析天平。
1.2 试验方法1.2.1试样制备将金银花粉末精确称取1.0g，放置在100ml量瓶中，加入50%甲醇10ml，放入超声清洗器中震荡，进行减压过滤，然后将滤液放置在25ml量瓶中定容。
正交试验法优化金银花中绿原酸提取工艺的研究
１材料 、 剂 及 仪 器 ． 试 主 要 试 剂 及 材 料 。 金 银 花 （ 于 陕 西 汉 中 药 材 批 发 市 购
场 ）绿 原 酸 标 准 品 （ 安 小 草植 物科 技 有 限 责 任 公 司 ）其 余 、 西 ；
无 水 乙 醇 （ 津 市 富 宇 精 细 化 工 有 限 公 司 ） ９ ％浓 硫 酸 （ 天 、８ 广 东 汕头 市 西 陇 化 工 厂 ） 氢 氧 化 钙 （ 国 医 药 公 司 北 京 公 司经 、 中 销 ） 氢 氧 化 钠 （ 津 市 天达 净 化 材 料 精 细 化 工 厂 ） 均 为 分 、 天 等
正交试验法优化金银花中绿原酸 提 取工艺 的研究
达 超 超 单 磊 呼 延 晓 颖 刘 军 海
（ 西 理 工 学 院 化 学 与 环境 科 学 学院１ 陕
【 摘
要】 以 金 银 花 为 原料 ， 用 乙醇 为 提 取 剂 ， 取 了金 银 花 中的 绿 原 酸 。 通 过 正 交 试 验 优 化 了金 银 花 中绿 原 酸 的提 取 采 提
基 金 项 目 ： 西 理 工 学 院 大 学 生 基 金项 目 （ Ｌ 陕 Ｓ ＧＤＸＳ ０ ９ ０ ２） ２００ １ 。
，
穆
ｅ
（ ） 原 酸 的粗 提 ２绿
绿 原 酸得 率 按 下 式 计 算
－
将 金 银 花 在 ６ ℃下 烘 干 ， 出 ， 用 粉 碎 机 粉 碎 ， 过 ０ 取 利 并 ８ 目筛 。 准确 称 取 １ 的 粉 末 在 一 定 浸 提 温 度 、 液 比 、 ０ 克 料 乙
’． ０
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０． ２
绿原酸的提取实验报告
一、实验目的1. 掌握绿原酸的提取方法；2. 熟悉绿原酸提取过程中相关操作技术；3. 了解绿原酸在植物源天然产物中的应用。
二、实验原理绿原酸是一种天然多酚类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血糖血脂等生理活性。
绿原酸的提取方法主要有水提法、回流提取法、超声提取法、微波辅助提取法、酶法等。
本实验采用超声提取法提取植物源天然产物中的绿原酸。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：杜仲叶、金银花等植物源天然产物；2. 试剂：绿原酸标准品、甲醇、无水乙醇、盐酸等；3. 仪器：超声波提取器、分析天平、离心机、分光光度计、恒温水浴锅等。
四、实验方法1. 标准曲线的绘制（1）配制绿原酸标准溶液：准确称取绿原酸标准品10mg，用甲醇溶解并定容至10mL，得到浓度为1mg/mL的标准溶液；（2）取6个试管，分别加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准溶液，用甲醇定容至2mL；（3）以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 绿原酸提取（1）称取杜仲叶粉末2g，置于锥形瓶中；（2）加入10mL甲醇，超声提取30分钟；（3）提取液离心分离，取上清液；（4）用分光光度计在波长327nm处测定吸光度；（5）根据标准曲线计算绿原酸含量。
3. 绿原酸提取工艺优化（1）以超声提取时间为自变量，分别设定20、30、40、50分钟，考察超声提取时间对绿原酸提取率的影响；（2）以甲醇浓度为自变量，分别设定60%、70%、80%、90%，考察甲醇浓度对绿原酸提取率的影响；（3）以料液比为自变量，分别设定1:10、1:15、1:20、1:25，考察料液比对绿原酸提取率的影响。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制根据实验数据，绘制标准曲线，得到线性方程为：y = 0.017x + 0.0013，相关系数R² = 0.996。
2. 绿原酸提取根据实验数据，杜仲叶中绿原酸含量为0.50mg/g。
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精品
现代分离技术实验 安排
一、 实验说明
1、本课程实验为一次性综合大实验，采取分班进行，每班实验必须在连续两天内
完成，各组的实验安排均为周六和周日的上午8点到晚上的8点。
每次实验1个班，每个实验由两个人共同完成，即两人一组，每组一套实验仪
器和一张实验台。每班的班长负责实验室的卫生和安全。
2、 课程考核方法采用实验考察形式进行，每人只安排一次实验机会，过期不补，希
望各位同学能够按时参加。若有冲突，学生之间可相互对调。
3、进入实验室后，各组同学首先按照仪器清单检查仪器的数量和完好情况。若有
仪器短缺或破损等问题，请在上课后20分钟内与实验室工作人员及时联系，
并要求实验人员进行补充或更换。
4、实验结束后，各组同学应对照仪器清单检查，分别洗净后交实验人员验收。如
有损坏或缺少，应按规定缴纳赔偿金。因此，希望同学们爱惜仪器，认真操作。
实验期间，应注意保持实验室台面、地面和水槽的卫生，尤其是自己的工作区域。同时应
注意实验室的财产安全和自身安全，不可在实验室喧哗吵闹。
二、实验内容
题 目：金银花中绿原酸的提取与分离
学习内容：固体中有效成分的提取（索氏法）技术；
减压浓缩（旋转蒸发）技术； 硅胶吸附柱层析；
硅胶吸附TLC技术； 薄层色谱对产品纯度检测
.
精品
金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属多种植物的干燥花蕾，它是一种“药
食同源”的绿色植物，是临床常用的中药之一。具有清热解毒、凉风散热、抗病
毒、保肝利胆的功能，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病
发热、急性支气管炎、肺炎、腮腺炎、胆道感染、关节炎等，能改善放、化疗所
致的白细胞降低，有“中药中的青霉素”的美誉。另外，金银花还被广泛地应用
于保健品、化妆品、卷烟、食品等行业。近代研究一般认为金银花的主要生物活
性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的
优劣
。
绿原酸结构式
HO
HO
O
O
2'
3'4'5'
6'
8'
9'
OH
HO
OH
OH
O
1
2
3
4
5
6
7'
1'
三、实验方案
金银花粉末
75％乙醇，索氏提取回流4h
残 渣 滤液（粗提液）
减压浓缩，60℃干燥
粗提物（浸膏）
1:1硅胶拌样
提取物拌样
硅胶柱
乙酸乙酯：甲酸：水
(不同比例洗脱)
含绿原酸的洗脱液
浓缩至干
绿原酸粗品
.
精品
四、方法
1、TLC板的制备与活化
在干净的研钵内加入约6g硅胶GF254，在轻轻研磨的同时缓慢加入15ml 0.5%羧
甲基纤维素钠水溶液。继续研磨约10min，当体系粘稠度适宜时，即可进行铺板。
用药匙将适量糊状物均匀摊在干净干燥的载玻片上，然后用手拿住薄板的一
端在台面上轻轻振动，直至薄层均匀为止。将铺好的薄板平放在水平的台面上，
凉干。
将凉干后的薄板放入预先恒温到105～110℃的烘箱中活化30min。
2、提取（索氏法）
将金银花制成粗粉，称取约100g，用75%乙醇采用索氏提取器回流处理4h，其
提取液减压浓缩、60℃干燥得浸膏。
3、分离
（1）粗分离
取一定量浸膏，按1∶1加入200-300目硅胶拌样，晾干。
用乙酸乙酯湿法装柱（柱型Ø8.5cm×53cm，硅胶200-300目），干法上样，柱
体依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶
0.1）、甲醇洗脱。流速控制在每1/10柱体积即可。分部收集，每管30ml。
（2） 粗分离过程中薄层检测
粗分离过程中对柱子的洗脱情况随时进行薄层检测，展开剂为乙酸丁酯∶甲
酸∶水（7∶2.5∶2.5）。从某个馏分开始有绿原酸出现（λ365nm下显兰色荧光）至
几乎看不到兰色荧光，显示绿原酸已基本收集完全。结合显色剂显色，将相同流
分合并，共分26个部分。其流程图：
绿原酸
硅胶柱
氯仿－甲醇梯度洗脱
.
精品
浸膏拌样
硅胶柱
A1......A4
B1.. ...B8
C1........C12
D
乙酸乙酯
乙酸乙酯∶甲酸∶水
（20∶1∶0.1）
乙酸乙酯∶甲酸∶水
（10∶1∶0.1）
甲醇
图2金银花粗分流程图
具体方法：
收集液的薄层预检：在对各收集管进行TLC分析之前，为了节约薄板，可用
毛细管将各收集管中的液体依次在一块薄板上并对各点样按照相应的管号一次编
号，等样点上的溶剂彻底挥发干后，置于波长365nm的紫外灯下观察，有明显斑
点的表明其对应接受管中含有化合物，没有斑点的表明对应管中没有化合物。然
后再对有斑点的各管按照下法进行TLC分析。
TLC分析：用事先活化好的薄层板对每管收集液进行TLC分析，点样数视板
的大小而定，每两斑点之间最小间距不少于8mm，其中有一个为绿原酸对照点（注
意：每个毛细管只能用于同一个样品；每个试管的点样量应相同；点样时应按管
号依次进行；每个TLC分析的薄层板应依次编号）。等展开剂爬行到板层4/5～5/6
高度时，取出薄层板，室温平放或平放于暖气片上，让溶剂挥发干。然后将薄板
置于波长365nm下，观察和记录薄板上斑点的分布情况及其对应的Rf值。
TLC分析内容如下：
判断斑点数的多少。展开后，斑点数多表明所含化合物越多。只有一个斑点
者表明对应管中可能含有纯化合物。斑点颜色越深表明所含对应化合物的量越多。
.
精品
根据Rf值或斑点高度判断不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有
相同斑点，表明两管含有相同的成分。
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干后
得绿原酸粗品。
（3）精制
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干
后得绿原酸粗品，该部分再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得一化合物（E），
即为绿原酸精品。
4、检测
对B5C1和E两部分分别进行高效液相色谱分析，检测两部分的绿原酸含量。
测定条件：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱
仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，SPD-10AV紫外检测器，以乙腈－0.4%磷
酸（13:87）为流动相，327nm下检测。
附：试验主要用品
1 材料
金银花（为金银花花蕾和开放花的混合样品，经烘房烘干后，备用。）
2试剂
本实验所用有机、无机试剂均为分析纯。
薄层层析硅胶：GF254和硅胶G，化学纯
柱层析硅胶：硅胶G（粒度100-200目）
3主要仪器
旋转蒸发仪、电热恒温鼓风干燥箱、三用紫外仪、电子分析天平、高效液相
色谱仪。
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