饲料中沙丁胺醇酶联免疫前处理方法的探究_栗静雅

添加回收率（％）＝ 实 际 测 定 浓 度／真 实 添 加 浓 度 ×１００％ １．２．５ 实际饲料样 本 检 测 选 取 最 优 的 前 处 理 条 件 检 测 不 同 类 型 和 批 次 的 饲 料 样 本，通 过 对 于 ＥＬＩＳＡ 的变异系 数 和 回 收 率 来 确 认 该 前 处 理 方 法 用于 ＥＬＩＳＡ 检测的可行性。 添 加 浓 度 设 置 为 ０、５、 １０μｇ／ｋｇ ３个 梯 度，每 个 样 本 平 行 测 定 ３ 次，通 过 Ｅｘｃｅｌ ２００７ 计 算 平 均 值 、标 准 差 和 变 异 系 数 。 ２ 结 果 与 分 析 ２．１ 标准曲线的建 立 以 不 同 标 准 品 溶 液 浓 度 的 对数值为横坐标，以 相 对 吸 光 度 Ｂ／Ｂ０ 为 纵 坐 标，使 用四参数 ｌｏｇｉｓｔｉｃ 函 数 拟 合 后 的 标 准 曲 线 见 图 １。 由 图 １ 可 知 ，标 准 曲 线 的ＩＣ５０值 为 ０．６０６ｎｇ／ｍＬ，线 性 范 围 为 ０．２２１～１．６５８ｎｇ／ｍＬ，Ｒ２＝０．９９９８。
在给定的可靠程度内可从样品中检测待测物质的最 小浓度或最小量。适量称取空白粉末饲料样本和空 白 颗 粒 饲 料 样 本 各 ２０ 份 ，测 定 ２ 种 不 同 类 型 的 饲 料 样本中沙丁胺醇的检测限。
检测 限 ＝ 空 白 样 本 均 值 ＋３× 空 白 样 本 的 标 准差 １．２．４ 添加回收率 的 计 算 经 上 述 前 处 理 方 法 处 理后，测定 Ｄ４５０ｎｍ值，计 算 抑 制 率，通 过 １．２．１ 所 得 标 准 曲 线 计 算 沙 丁 胺 醇 含 量 ，进 而 得 到 添 加 回 收 率 。
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生理生化
中国畜牧兽医 ２０１４年第４１卷坐 标，以 相 对 吸 光 度 Ｂ／Ｂ０ 为 纵 坐标（各浓度沙丁胺醇抑制时的 Ｄ４５０ｎｍ值为 Ｂ 值，无 检测物标准品抑制时０浓度的标 准 品 溶 液 的 Ｄ４５０ｎｍ 值为 Ｂ０ 值），绘 制 标 准 曲 线。 当 Ｂ／Ｂ０ 值 达 到 ５０％ 时的 标 准 品 浓 度 为 ＩＣ５０ 值，通 过 建 立 的 标 准 曲 线 求得。 １．２．２ 饲料样品前 处 理 方 法 准 确 称 取 空 白 粉 末 饲料样品 和 空 白 颗 粒 饲 料 样 品 各 （１±０．０２）ｇ 于 ５０ｍＬ离心管中，依次加入不同 ｐＨ、不同离子强度、 不 同 浓 度 有 机 溶 液 、不 同 体 积 的 样 品 稀 释 液 ，置 于 调 速涡旋仪上 充 分 涡 动 １ ｍｉｎ，至 饲 料 样 品 分 散。 将 上 述 离 心 管 置 于 离 心 机 中 ，４０００ｒ／ｍｉｎ 离 心１０ ｍｉｎ， 取５０μＬ 进行检测。 １．２．２．１ ｐＨ 按 １．２．２ 所 述 前 处 理 方 法，分 别 用 １０ｍＬ 不同 ｐＨ（６．０～８．０）的 样 本 提 取 液 对 空 白 粉 末饲料样本和空白颗粒饲料样本中添加的沙丁胺醇 进行提取（沙丁胺醇添 加 浓 度 为 ０、５、１０μｇ／ｋｇ），通 过 Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｒｏ ８．５ 计 算 出 各 浓 度 的 添 加 回 收 率，取 平均值，以平均添加回收率为纵坐标，ｐＨ 为横坐 标 作图。 １．２．２．２ 离 子 强 度 本 试 验 根 据 文 献 选 取 了 ０、 ０．０２、０．０４、０．０６、０．０８ｍｏｌ／Ｌ 的 ＰＢＳ缓冲溶液代表 不 同 的 离 子 强 度 ，按 １．２．２ 所 述 前 处 理 方 法 ，分 别 用 １０ｍＬ 的提取液对空白粉末饲料样本和空白颗粒饲 料样本中添加的沙 丁 胺 醇 进 行 提 取 （沙 丁 胺 醇 添 加 浓度分别为０、５、１０μｇ／ｋｇ），通过 Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｒｏ ８．５计 算 出 各 浓 度 的 添 加 回 收 率 ，取 平 均 值 ，以 平 均 添 加 回 收 率 为 纵 坐 标 ，ＰＢＳ 缓 冲 液 浓 度 为 横 坐 标 作 图 。 １．２．２．３ 有机溶 剂 浓 度 按 １．２．２ 所 述 前 处 理 方 法，分别用１０ ｍＬ 系 列 浓 度 梯 度 （０～９％）的 ＤＭＦ 溶剂对空白粉末饲料样本和空白颗粒饲料样本中添 加的沙丁胺醇进行 提 取 （沙 丁 胺 醇 添 加 浓 度 分 别 为 ０、５、１０μｇ／ｋｇ），依 据 公 式 计 算 出 各 浓 度 的 添 加 回 收 率，取平均值，以平均添加回收率为纵坐标，ＤＭＦ 浓 度为横坐标作图。 １．２．２．４ 样品稀 释 倍 数 按 １．２．２ 所 述 前 处 理 方 法，分别用１０、２０、３０、４０ ｍＬ（即 样 品 稀 释 倍 数 分 别 为１０、２０、３０、４０倍）上 述 优 化 后 的 样 品 提 取 液 对 空 白粉末饲料样本和空白颗粒饲料样本中添加的沙丁 胺醇进 行 提 取 （沙 丁 胺 醇 添 加 浓 度 分 别 为 ０、５、 １０μｇ／ｋｇ），依据公式 计 算 出 各 浓 度 的 添 加 回 收 率， 取 平 均 值 ，以 平 均 添 加 回 收 率 为 纵 坐 标 ，稀 释 倍 数 为 横坐标作图。 １．２．３ 检测限 检测限（ＬＯＤ）是指某一分 析 方 法
图 １ 沙 丁 胺 醇 标 准 曲 线
２．２ 样 品 提 取 液 优 化 ２．２．１ ｐＨ 由图２可知，ｐＨ 从６．０到８．０的变化 过程中，样 品 的 添 加 回 收 率 发 生 了 显 著 的 变 化，当 ｐＨ 为７．５时，样本的回收率为 １０２％～１０５％，变异 系数为１．５％～２．９％，符合 方 法 的 准 确 度 要 求。 因 此，选择 ｐＨ ７．５作为最优提取液 ｐＨ。 ２．２．２ 离 子 强 度 由 图 ３ 可 知 ，回 收 率 随 着 离 子 强 度（以 ＰＢＳ 缓 冲 液 浓 度 表 征 ）增 加 呈 上 升 趋 势，当 ＰＢＳ缓冲液浓度 ≥０．０４ ｍｏｌ／Ｌ 时 回 收 率 为 ７０％ ～ ７９％，基本满足 要 求，与 此 同 时 当 ＰＢＳ 缓 冲 液 浓 度
选方法 ，后 两 者 主 要 用 作 确 认 方 法 （Ｗａｎｇ 等，２００７）。 饲料按照配合方式可分为单一饲料和配合饲料（陈旭 高 ，２０１１），配 合 饲 料 与 单 一 饲 料 的 基 质 效 应 相 比 较 为 复杂 ，因此本试 验 选 用 了 ２ 种 配 合 饲 料 样 本 ，旨 在 对 酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测配合饲料中沙丁 胺 醇 前 处 理方法的样品提取液条件进行优化，从而为饲料中沙 丁胺醇的检测提供切实可行的参考。 １ 材 料 与 方 法 １．１ 材 料 １．１．１ 样品采集 空 白 粉 末 饲 料 样 本 和 空 白 颗 粒 饲料样本均由中国农业大学兽药安全评价中心实验 动物房提供。 １．１．２ 主要试剂与 仪 器 沙 丁 胺 醇 抗 体 和 沙 丁 胺 醇包被抗原均由中国农业大学兽药安全评价中心实 验室提供。沙丁胺醇标准品购自中国药品与生物制 品检定所；辣根过 氧 化 物 酶 标 记 二 抗 （ＨＲＰ－ＩｇＧ）购 自Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ 公 司；磷 酸 氢 二 钠、磷 酸二 氢 钾、氯 化 钠、氯 化 钾、Ｎ，Ｎ－二 甲 基 甲 酰 胺 （ＤＭＦ）均 购 自 北 京 化 学 试 剂 公 司 。
收 稿 日 期 ：２０１４－０５－０７ 作者简介：栗静雅（１９８９—），女，河北人，硕 士，研 究 方 向：动 物 源
性食品安全。 通信作者：沈建忠（１９６３—），男，教 授，研 究 方 向：动 物 源 病 原 生
物耐药性和动物性食 品 安 全 风 险 评 估。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｊｚ＠ ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 基 金 项 目 ：公 益 性 行 业 （农 业 ）科 研 专 项 （２０１２１０４００３－５）。
８００Ｂ 离心机购自上海安亭科学仪器厂；微孔板 酶标 仪 购 自 Ｔｈｅｒｍｏ 公 司；ＨＹ－４ 型 调 速 涡 旋 仪 购 自国华分析仪 器 厂；微 量 移 液 器 购 自 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公 司；电子分析天平购自 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司。 １．２ 方 法 １．２．１ 标准曲线的建立 间接竞争 ＥＬＩＳＡ 方法的 操 作 流 程 参 照 王 鹤 佳 等 （２００４）方 法 进 行 。 精 确 配 制 浓度分别 为 ０、０．１、０．３、０．９、２．７、８．１ｎｇ／ｍＬ 的 沙 丁胺醇标准品稀释 液 进 行 平 行 点 板，测 定 上 述 各 浓 度沙丁胺醇标准品 对 抗 体 的 抑 制 率，以 不 同 标 准 品
关 键 词 ：酶 联 免 疫 法 ；沙 丁 胺 醇 ；前 处 理 ；饲 料 中 图 分 类 号 ：Ｓ８１６．１７ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１６７１－７２３６（２０１４）１１－０１７９－０５
沙丁 胺 醇 （ｓａｌｂｕｔａｍｏｌ，ＳＡＬ）是 一 种 人 工 合 成 的β－兴 奋 剂 ，临 床 上 用 作 止 喘 药 ，可 以 起 到 松 弛 气 管 平 滑 肌 的 作 用 ，对 于 支 气 管 哮 喘 、肺 气 肿 和 哮 喘 性 支 气 管 炎 等 疾 病 有 很 好 的 治 疗 效 果 （陈 新 谦 等 ，２００７）。 然 而 ，该 药 物 还 具 有 对 于 营 养 重 新 分 配 的 作 用 ，能 够 提高饲料的转化率，故 而 常 被 非 法 用 作 饲 料 添 加 剂 喂食 猪、牛、羊 等 牲 畜 （邱 阳 生 等，２００２）。长 期 使 用 沙 丁 胺 醇 等 β－兴 奋 剂 类 药 物 会 使 其 在 动 物 体 内 不 断 蓄积，从而给人类带来 危 害 （Ｔｒａｙｎｏｒ等，２００３）。人 服食了含有沙丁胺 醇 残 留 的 动 物 源 性 食 品 后，可 能 出现肌 肉 震 颤、心 律 失 常、头 疼、晕 眩、恶 心、呕 吐 等 中 毒 症 状 ，严 重 者 可 导 致 死 亡 （王 建 平 ，２００３）。 世 界 上很多国家都明确规定禁止在畜牧生产中使用沙丁 胺醇，中 国 也 于 ２００２ 年 颁 布 农 业 部 第 １９３ 号 公 告， 其中明确规定，禁 止 使 用 沙 丁 胺 醇 及 其 盐、酯、制 剂 于食品动 物，且 在 动 物 性 食 品 中 禁 止 检 出 （翟 福 丽 等 ，２０１１）。 由 于 饲 料 中 的 非 法 添 加 是 沙 丁 胺 醇 在 动 物 源 性 食 品 中 残 留 产 生 的 根 本 原 因 ，因 此 ，从 源 头 上 对沙丁胺醇的滥用进行检测和控制具有非常重要的 意 义 。 目 前 ，对 于 沙 丁 胺 醇 的 检 测 ，主 要 有 酶 联 免 疫 分析 法 （Ｍｅｎｇ 等，２０１０；Ｓｈｅｕ 等，２００９）、液／质 联 用 分析法（ＬＳ／ＭＳ）（Ｓｕｏ 等，２０１４）、气／质 联 用 分 析 法 （ＧＳ／ＭＳ）（Ｋｈａｍｔａ等 ，２００９），其 中 前 者 主 要 用 作 筛