叶酸的测定方法
微生物培养法测定血清中的叶酸浓度
３．３影响试验的其他因素叶酸的化学性质不稳定，容易被 氧化，因此笔者在培养基中添加抗坏血酸，以起到保护叶酸 的作用。抗坏血酸是强还原剂，极易被氧化，宜在临用前配 制。９６孔细胞培养板的质量可影响结果的准确度。因此要求 培养板的内表面光洁、无有机杂质、底面平滑无折光、能被封 口膜牢固封闭。由于微氧环境有利于干酪乳酸菌生长，也为 防止水分蒸发和空气中的氧对叶酸的破坏，故培养过程中必 须将９６孔板用封口膜贴牢。 笔者使用该法检测天津市结婚登记者的血清叶酸．结果 表明男性叶酸缺乏更为普遍，其原因可能与饮食习惯有关， 这可能是男性心血管系统疾病多于女性的原因之一。 ３．４微生物培养法在临床工作中的使用价值在我国，人群 缺乏叶酸的比例很高四。２００９年国家已将增补叶酸工作列入 重大公共卫生项目之一，对全国农村孕妇进行孕前３个月至 孕早期３个月补服小剂量叶酸工作，因此亟待建立一个既准 确，又简便、快速、廉价的叶酸检测方法。使用活性炭粉末处 理的水配制实验所需试剂，有助于开展人群叶酸筛查和 监测。
２．３精密度取高、中、低３种叶酸浓度的血清样品，用本法
连续测定２０次，测定的平均值分别为１９．８、９．６６和４．５１删Ｌ，
批内变异系数（ＣＶ）分别为３．Ｏ％、３．２％和３．４％；连续测定２０ ｄ，批间变异系数（ＣＶ）分别为３．８％、４Ｄ％和４３％，精密度良好。 ２．４准确度回收试验：取已测得叶酸含量为１９．８、９．６６和
食品中叶酸的测定方法
中南大学食品分析课程论文题目：食品中叶酸的测定方法学生姓名：毛慧悦所在学院：化学化工学院专业班级：应用化学1105班学生学号：1505110706指导老师: 张泰铭目录1叶酸 (1)1.1叶酸的化学结构 (1)1.2叶酸的理化性质 (1)1.3叶酸的作用效果 (2)2 果蔬中叶酸含量的测定方法 (2)2.1化学发光测定法 (2)2.2离子捕获法 (3)2.3F ENTON试剂氧化-荧光分析法 (3)2.4催化氧化荧光法 (3)2.5衍生荧光法 (4)2.6间接原子吸收光谱法 (4)3 保健品中叶酸的测定方法 (5)3.1铽一环丙沙星稀土敏化荧光猝灭法 (5)3.2表面等离子共振技术（SPR） (5)3.3高效液相色谱法（HPLC）法 (5)3.4高分离度快速液相色谱法（RRLC） (6)3.5氨基硅油修饰碳糊电极阳极伏安法 (6)3.6发光免疫法 (7)3.7PEI修饰的量子点作为叶酸荧光探针 (7)4结论与展望 (7)4.1结论 (7)4.2展望 (8)食品中叶酸的测定方法毛慧悦（中南大学，湖南长沙 410012）摘要：叶酸，又称为维生素B9，是维生素B9的水溶形式。
叶酸是一种重要的一碳载体，在核苷酸合成等重要生理代谢功能方面有非常重要的作用。
因此叶酸在细胞分裂和生长过程（如婴儿发育、怀孕）中有着重要的作用。
叶酸的检测已成为食品研究中的热点，本文从叶酸的结构和检测几个方面展开研究，并重点阐述了果蔬和保健品中叶酸的几种测定方法。
关键词：叶酸；测定方法；果蔬；保健品Testing of folic acid in foodsMAO Hui-yue（Central South University，Hunan Changsha 410012，China）Abstract:Folic acid, also known as vitamin B9 or B c, a water-soluble form of vitamin B9. Folic acid is an important one-carbon carrier in nucleotide synthesis, metabolism of many important physiological functions of homocysteine re methylation plays an important role. Therefore, there is a particularly important role of folic acid in the rapid cell division and growth (such as infant development, pregnancy) in. Folic acid food testing has become a hot research paper from the structure, preparation of folic acid, extraction and detection aspects of a study, and focuses on the determination of several fruits and vegetables and health supplements of folic acid.Key words：folic acid；testing；vegetables and foods；health products.1叶酸1.1 叶酸的化学结构叶酸(Folic acid)，是维生素B9的水溶形式，也被称为蝶酞谷氨酸。
叶酸Folate定量测定-检验科免疫室作业指导书
叶酸Folate定量测定1.原理反应孔中的玻璃纤维先包被了高分子的四胺化合物，从而使纤维网的表面带正电，得以能够捕捉带负电的反应复合物，通过静电正负离子结合的原理，使反应复合物吸附在纤维上。
反应的复合物是通过抗原抗体反应的原理，并联以荧光标记物，这个复合物通过连接负电的多聚阴离子复合物，吸附到带正电的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，从而决定被测物质的浓度。
2.标本采集：2.1标本采集前病人准备：受检者应空腹2.2标本种类：血清或血浆2.3标本要求：采集血清样本，取被检者静脉血，用无菌取血针抽取病人静脉血3ml，收集干燥试管中，室温放置不超过8小时，2000转/分离心20分钟备用。
采集血浆样本，用无菌取血针取被检者静脉血3ml，收集于含有EDTA作抗凝剂的试管中，室温放置不超过8小时，2000转/分离心20分钟备用。
3.标本储存：待测样本室温不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃可长期保存，避免反复冻融。
4.标本运输：室温运输5.标本拒收标准：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
6.试剂：6.1试剂名称：Folate诊断试剂盒。
6.2试剂生产厂家：美国雅培制药有限公司6.3包装规格：100Test/kit6.4试剂盒组成：Folate诊断试剂6.5试剂储存条件及有效期：试剂盒贮存2-8℃条件，有效期12个月。
7.仪器设备：7.1仪器名称：AXSYM免疫自动分析仪7.2仪器厂家：美国雅培公司7.3仪器型号：AXSYMTm型7.4仪器校准：本仪器校准由厂家工程师负责校准8.操作步骤：8.1样本处理：取待测样本血清或血浆置于样本杯中(不能有纤维蛋白，不能有气泡)。
8.2仪器准备：检查纤维杯，反应杯数量满足实验需要，废物桶和废液桶是否连接好，仪器的光路是否正常，环境温度是否符合要求，打印机的连接。
8.3试剂准备与检查：从冰箱取1号液放入仪器，检查所有试剂和缓冲液量是否足够，是否在有效期内。
分光光度法测定饲料添加剂叶酸含量的方法研究
101.0
95.0~102.0
101.3
96.7
从表 2 可以看出，用两种方法分别测定饲料
添加剂叶酸含量，最大标准偏差≤0.3%，证明本
97.1
0.2
0.3
0.1
0.2
分册,2009,36(03):158-161.
[3] 叶晓利,康文怀,李巧玲,等.高效液相色谱-串联质谱法
测定水果中叶酸及其稳定性[J].食品工业,2020,41(01):
波长 281nm 处用分光光度计测定各溶液吸光度。
20min、30min、40min、50min、60min 后 测 定 其 结
Байду номын сангаас
2.1 标准曲线及相关系数
相对稳定。静置时间≥50min 时，测定结果较之
2
结果与讨论
准确移取 1.2.2 中叶酸标准工作液 0.05mL、
果，测定结果表明静置时间≤40min 时测定结果
叶酸一种水溶性 B 族维生素，是动物机体必
粉、血浆、叶酸片等基质，鲜有用于饲料添加剂叶
需的一种维生素，是脂肪代谢不可或缺的辅酶，
酸的分光光度法。本研究采用简单、快捷的分光
对氨基酸代谢和蛋白质、核酸的生物合成有重要
光度法测定饲料添加剂叶酸的主成分含量，该方
[1]
影响 。在动物机体中，叶酸缺乏会引起巨幼红
[11] 马景宏,张旭,王为黎.微生物分析法测定保健食品中
叶酸[J].中国微生态学杂志,2007(06):576-577.
[12] 柳琪,滕葳,王利民,等.氨基酸分析仪测定饲料添加剂
作者（通信作者）简介：霍艳杰，
（1979-），女，陕西渭
南人，主要从事食品、农产品、环境等常规理化项目的测
高效液相色谱法测定叶酸复合维生素片叶酸含量
高效液相色谱法测定叶酸复合维生素片叶酸含量左志学【摘要】目的建立测定叶酸复合维生素片中叶酸含量的高效液相色谱法.方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液[pH值＝(6.3±0.1)]-甲醇(89:11)为流动相;检测波长256 nm;流速1 mL·min-1;柱温35 ℃;按外标法以峰面积计算.结果叶酸在0.02～0.50 mg·mL-1范围内的测定线性关系良好(r＝0.999 7),测得平均回收率为99.6%,RSD为1.01%(n＝9),最低检出量为0.1 ng.结论该方法简单快速,专属性强,灵敏度高,重现性好,结果准确可靠.【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2010(029)002【总页数】2页(P258-259)【关键词】维生素片/复合;叶酸;叶酸;色谱法;高效液相【作者】左志学【作者单位】湖北省黄冈市中心医院药剂科,438000【正文语种】中文【中图分类】R977.2;R927.1笔者在本实验中采用高效液相色谱法测定叶酸复合维生素片叶酸含量,该方法简单、快速,灵敏度高,重复性好,结果准确可靠。
1 材料戴安 UltiMate3000高效液相色谱仪,UltiMate3000紫外检测器,Chromeleon色谱工作站;叶酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100074-200712),叶酸复合维生素片(武汉福格森保健食品有限公司,批号:20080501,20080502,20080503);水为纯化水,甲醇、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果2.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液[pH值=(6.3±0.1)]-甲醇 (89：11)为流动相;流速:1mL·min-1;检测波长:256 nm;柱温:35℃。
2.2 试液的制备2.2.1 对照品溶液的制备精密称取叶酸对照品约5 mg,置于 50mL量瓶,加 0.5%氨溶液 15mL使溶解,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
高效液相色谱法测定叶酸片的含量
高效液相色谱法测定叶酸片的含量【摘要】叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素，相当于蝶酰谷氨酸。
固定相为：依利特hypersil BDSC18 色谱柱（4.6*250*5u ），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相，检测波长为254nm；叶酸在20～280μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
叶酸的平均回收率为99.3%。
本法简便、重现性好、回收率高，可用于叶酸片中叶酸的含量测定。
【关键词】叶酸片；叶酸；测定叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B 族维生素，相当于蝶酰谷氨酸[1-2]。
叶酸从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。
叶酸对孕妇尤其重要。
叶酸用于预防胎儿神经管畸形，准妈妈在备孕期间就服用0.4毫克叶酸可以下降胎儿神经管畸形率85%[3-4]。
如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。
人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状[5-7]。
本文用高效液相法对叶酸片中的叶酸的进行了含量测定。
1.仪器与试药1.1仪器LC-100（梯度配置）高效液相色谱仪（上海伍丰科学仪器有限公司）；CO-1000型色谱柱温箱（武汉恒信世纪科技有限公司）；制冷和加热循环槽（上海汗诺仪器有限公司）；UV-1800紫外/可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ELGA超纯水器（上海澜锐仪器科技有限公司）；ABS 220-4分析天平（德祥科技有限公司）；3升基本型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）；TΜ-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1.2试药乙腈（杭州兴成化工有限公司）、磷酸（江西省新干县金成化工厂）、盐酸（襄樊金译成精细化工有限公司）、磷酸氢二铵（淄博市淄川区鑫川化工厂）、冰醋酸（吴江市龙申化工有限公司）、甲醇（江西省新干县金成化工厂）、冰乙酸（杭州兴成化工有限公司）、四氢呋喃（吴江市龙申化工有限公司）。
红细胞叶酸的微生物检测法
红细胞叶酸的微生物检测法个人简介：关丹丹，1987年12月，女，汉，天津市静海县人，本科学历，助理工程师（职称），研究方向：生物技术专业。
摘要：叶酸是一种水溶性B族维生素，红细胞叶酸与红细胞更新过程有关，通常能准确反映一个人体内叶酸的长期营养变化,是作为评价人体营养状况的常用科学指标之一,用以帮助判断各种预防性营养干预。
目前用于检测叶酸的检测方法很多,其中微生物法则就是用于检测体内叶酸的一种经典检测方法,灵敏度高。
这种检测方法具有临床操作步骤简单、对临床仪器设备精度要求低、成本低等几大优点,适用于对临床结果分析报告，操作时间精度要求低的大中小规模临床研究和早期临床医学检测。
关键词:红细胞叶酸,微生物检测方法,原理,影响引言：叶酸是一种人体日常必需的一种维生素。
叶酸睡眠缺乏与各种神经疾病的早期发生频率有关。
研究结果证实,妇女在初次怀孕前或者在怀孕早期，如果缺乏叶酸激素会直接导致整个胎儿脑部神经和血管发育缺陷。
妇女在外围孕期适当补充叶酸激素可以有效预防孕期胎儿脑部神经和血管发育缺陷。
孕期饮食补充叶酸也能帮助预防孩子出生缺陷,如先天性心脏病。
此外,补充叶酸也可能有助于我们预防一些常见慢性病,如急型心血管疾病。
准确性地检测人体内叶酸营养水平指标是作为评价叶酸营养状况和效果判断各种预防性叶酸干预治疗效果的重要基础,具有重要现实意义。
红细胞叶酸与人体红细胞长期代谢状态更新过程有关,反映了叶酸在人体内的长期不断变化代谢状态。
近年来它被越来越多的人所使用。
目前,检测叶酸的检测方法已经有很多,如放射微生物法、同位素放射免疫光谱分析法、气相色谱-离子质谱法、离子光谱捕获检测法和化学发光检测法。
微生物分析法具有灵敏度高、准确度高、成本低等三大特点。
它被接受并广泛使用,作为检测叶酸的一种标准检测方法。
本文主要重点介绍微生物分析法用于红细胞叶酸检测的工作原理、意义、研究进展及影响因素。
1微生物方法检测叶酸的工作原理和检测意义分析1.1微生物方法检测的工作原理微生物法检查是用于体内叶酸检测的一种经典检测方法。
叶酸的检测方法
叶酸的检测方法作者：王娜娜来源：《教育周报·教育论坛》2020年第11期摘要：目前已经发展的一些叶酸检测的方法各不相同，主要根据测定式样来决定其测定方法，最早发展的是微生物法，灵敏度高，但重复性相对较差，主要有比色法、紫外分光光度法、荧光分析法等等。
关键词：叶酸检测方法微生物法微生物法的检测原理为酪乳酸杆菌的生长必需叶酸，培养基中若缺乏叶酸则该细菌不能生长。
在一定的条件下，酪乳酸杆菌的生长及其代谢产物的浓度与培养基中叶酸的含量成正比关系，可测定细菌代谢物或菌体的浓度，即用酸度或浑浊度测定试样中叶酸的含量。
荧光法超声氧化荧光法叶酸自身荧光很弱，在中性介质中经超声照射后，能被氧化成喋呤羧酸，其荧光强度在462 nm波长处比叶酸自身有显著提高。
基于以上现象，建立了一种超声氧化预处理，荧光检测叶酸的方法。
荧光分光光度法本法利用高锰酸钾在酸性介质中氧化叶酸为1-氨基-4-羟基喋吮-6-叶酸后，其荧光强度可以测定复方制剂中叶酸的含量，其他维生素可用硅藻土吸附除去，本法灵敏度较高，可测得0. l ug/ml的叶酸。
衍生荧光法在酸性条件下，用强氧化剂氧化叶酸，并于254 nm紫外光下照射30 min，其氧化产物均具有强的荧光性质，因此荧光强度大大增强，比叶酸自身灵敏度提高2-3个数量级。
实验结果表明：高锰酸钾氧化一光照体系检出限为3.2 x10 -9mol/L，过氧化氢氧化一光照体系检出限为6. 5 x 10 -9mol/L。
离子捕获法1995年，wilson等提出了离子捕获法检测叶酸。
即在实验中，样品中加入变性剂后，叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与喋酸（叶酸的类似物）结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探测，定量分析样品中叶酸的含量。
色谱法高效液相色谱法在薄膜强阴离子交换树脂（0.01 *300cm pellicular）柱上用氯化钾一磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）在40℃的温度下进行梯度洗脱，可将三经基叶酸（THF）， N5-甲基一三经基叶酸（N5-CH3， -THF），去氢叶酸（DHF）、叶酸（FA）等异构体的混合物分离，洗脱的顺序是：THF， N5- CH3 -THF， DHF， FA。
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叶酸的测定方法微生物法1.原理叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生长所必需的营养素。
在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。
2.适用范围参考《Methods of Vitamin Assay》，第4版。
本方法适用于各类食物中叶酸的测定。
检测限为0.1ng。
3.仪器与设备（1）恒温培养箱（2）离心机（3）高压消毒锅（4）震荡器（5）接种针和接种环（6）分光光度计4.试剂除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1）菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）（2）磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH6.8):称取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。
临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。
（注：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。
）（3）鸡胰酶溶液：称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备用。
临用前现配。
（4）蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm 10min,取上清液备用。
临用前配制。
（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀。
（6） 01mol/L NaOH: 称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。
（7） 10mol/L NaOH。
称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。
（8）叶酸标准储备液（200mg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98%），用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。
储存于棕色瓶中。
（9）叶酸标准中间液（200ng/ml）：准确吸取1.0ml叶酸标准储备液，用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。
储存于棕色瓶中。
待标定。
标定：准确吸取1ml叶酸标准中间液，用0.1mol/L NaOH定容至10ml。
以0.1mol/L NaOH调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标准中间液浓度。
X1= A×M×10×106 (1)E式中：X1 -- 叶酸标准中间液浓度，ng/ml；A -- 标准中间液平均紫外吸光度值；E -- 摩尔消光系数24,500；M -- 叶酸分子量441.42；10-- 测定紫外吸光度值时的稀释倍数；106 -- 由g/L换算成ng/ml的换算系数。
（10）叶酸标准工作液（0.2ng/ml）:准确吸取1.0ml叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至1L。
（11） 2.4mol/L HCl：量取20ml浓盐酸，加水稀释至100ml。
（12）酶解酪蛋白溶液：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma 公司），用10mol/L NaOH 调节pH至 8.0（调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避免酪蛋白结块）。
加入300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶混匀充分。
再加入2.5ml甲苯，置37℃恒温箱酶解48～72h（此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。
酶解时间不易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长）。
将酪蛋白液从恒温箱中取出，121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。
冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏斗过滤。
向滤液中加入约60ml冰乙酸调节pH至3.7。
称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复三次。
每次过滤时，布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。
最后滤液用水稀释至1200ml，4℃冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间）。
取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已称重的蒸发皿中，沸水浴蒸发至干。
将蒸发皿置于100℃恒温烤箱内干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温。
称量蒸发皿的重量，蒸发皿内固体重量，如固体重量小于400mg，即每毫升酪蛋白溶液中固体含量<40mg，则弃除酪蛋白液，重新制备。
（13）黄嘌呤溶液：取0.4g黄嘌呤，加入10ml氨水，加热溶解，用水稀释至100ml。
冰箱保存。
（14）腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶：分别称取硫酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml，加热溶解，用水稀释至100ml，室温贮存。
（15）乙酸缓冲液（1.7mol/L,pH4.5）：38.65g无水乙酸钠，19.8ml冰乙酸，加水稀释至500ml。
（16）维生素溶液：取10mg核黄素溶解于40 ml乙酸缓冲液中。
取0.2mg生物素，2.5mg NaHCO3，20mg对氨基苯甲酸，40mg盐酸吡多醇，4mg盐酸硫胺素，8mg泛酸钙，8mg尼克酸溶解于50ml水中。
将上述两种溶液混合，加水至100ml。
（17）吐温-80溶液：将2g吐温-80加入100ml 45℃水中，混匀。
（18）还原型谷胱甘肽溶液：取0.1g还原型谷胱甘肽，加水至100ml.（19）甲盐溶液：称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100ml，液面上加入少许甲苯保存。
（20）乙盐溶液：称取2 g硫酸镁，0.5 g硫酸亚铁和0.5 g硫酸锰，加水至100 ml，液面上加少许甲苯保存。
（21）基础培养基：按下表配制，最终定容至500ml。
酶解酪蛋白100ml L-盐酸半胱氨酸0.2 g腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶 2.5 ml色氨酸0.2 g黄嘌呤溶液 2.5 ml还原型谷胱甘肽溶液 2.5ml维生素溶液5ml葡萄糖20 g吐温-80溶液 2.5 ml乙酸钠20 gL-天冬氨酸0.3 g甲盐溶液 2.5 ml加水至250 ml，搅拌，用10mol/LnaOH溶液调节pH 6.8±0.1，然后加入乙盐溶液2.5 ml，磷酸缓冲液200 ml,用水补至500 ml。
4℃冰箱内可保存一周。
(甲、乙盐混合后易产生沉淀，所以配培养基时不可同时加入，加入甲盐后先调节pH再加入乙盐。
基础培养基也可直接选购DIFCO公司生产的叶酸测定用培养基)（22）琼脂培养基：葡萄糖 1 g甲盐溶液0.2 ml蛋白胨0.8 g乙盐溶液0.2 ml酵母提取物干粉0.2 g琼脂 1.2g乙酸钠(NaAc·3H2O) 1.7 g加水至100 ml，置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH 6.8±0.1。
尽快倒入试管中，每管3～5 ml，塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min,取出后直立试管，冷却至室温.于冰箱内保存。
5.菌种制备与保存（1）储备菌种的制备：将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。
37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养16～24 h。
贮于冰箱内，每周转种一次留作储备菌种。
（2）种子培养液的制备：取2 ml叶酸标准使用液和10 ml基础培养基，混匀，分装至4支5 ml离心管中，塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min，实验时现制。
6.操作步骤所有操作均需避光进行6.1 样品制备（1）强化剂型样品：称取0.1～0.5 g样品（约含叶酸100～300 ng）于100 ml锥形瓶中，加入50 ml磷酸缓冲液，混匀。
121℃高压水解15 min。
定容至100ml，过滤。
（2）果蔬类：称取样品0.2～2 g（约含叶酸100～300 ng），加磷酸缓冲液经高压水解后过滤，残渣用同样缓冲液再次高压，过滤。
合并两次滤液，定容至100ml。
（3）谷、肉、蛋、鱼、豆、奶类等富含淀粉和/或蛋白类样品：称取样品0.1-2 g（约含叶酸100～300 ng），加磷酸缓冲液高压水解后，冷却。
加入1 ml鸡胰酶和1 ml蛋白酶-淀粉酶液，1 ml甲苯，充分混合，置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16～20h。
酶解后定容至100ml过滤。
另取一支试管，加入1 ml鸡胰酶，1 ml蛋白酶-淀粉酶和磷酸缓冲液，作酶空白。
（4）口服液、饮料、果汁等样品：称取样品0.5～2 ml（约含叶酸100～300 ng），加磷酸缓冲液高压水解后，冷却，加入1ml鸡胰酶，1 ml甲苯，充分混合，置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16～20 h。
酶解后定容至100ml，过滤。
另取一支试管，加入1 ml鸡胰酶和磷酸缓冲液，作酶空白。
6.2根据样品叶酸含量，将上述滤液用磷酸缓冲液稀释到一定倍数，使叶酸终浓度为0.1～0.4 ng/ml。
6.3样品管的制备：取4支试管，每支试管中分别加入稀释后样品液1.0、2.0、3.0、4.0 ml，补充水至体积为5.0 ml，加入5 ml基础培养基，混匀。
同样制作酶空白管。
6.4 灭菌：将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min。
6.5 标准系列管的制备：取试管分别加入叶酸标准工作液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,相当于叶酸含量0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ng，加水补至体积为5.0 ml，再加5 ml基础培养基，混匀。
如样品管一样进行灭菌。
标准系列管进行平行测定。
6.6 接种（1）接种液的制备：接种前一天，用灭菌的接种针将菌种由储备菌种管中转种至2支已灭菌的种子培养液中，37℃±0.5℃恒温培养箱中培养16～24 h。
混悬种子培养液，无菌操作下用接种针管将20滴种子培养液转移至另2支无菌的种子培养液中，37 ℃±0.5 ℃再培养6h。
震荡混匀，制成菌种混悬液。
立即使用。
（叶酸是L.C生长所必需的，但是如果培养基中叶酸含量过高，细菌可在体内贮存，使测定空白值，影响细菌生长曲线。
将接种液转种再培养6h，有利于消耗细菌体内贮存的叶酸。
）（2）接种：在无菌操作条件下向每支已灭菌的标准系列管、样品管和酶空白管接种一滴上述接种液（注意应直接滴在培养基内），混匀。
留一支标准0管不接种，用于测定光密度时调零。
6.7 培养：置于37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养20～40 h。
6.8 测定：用分光光度计，在波长540 nm下，以未接种的标准0管调节零点，测定标准管、样品管和酶空白管的光密度值。
7.计算（1）绘制标准曲线：以标准系列管中叶酸含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制叶酸标准曲线。