聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化_仇燕
聚乙二醇诱导鸡红细胞融合实验方案的优化
人工介导或培养条件下，使两个或两个以上的离体细胞合并成为一个双核或多核细胞的过程[1,2]称之为细胞融合技术，该技术作为细胞工程的核心技术，在农、牧、医、药、食品等领域具有广泛的应用价聚乙二醇诱导鸡红细胞融合实验方案的优化李玲刘欢贺亚玲崔林唐慧张君张亮（石河子大学医学院，新疆石河子，832002）【摘要】目的：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合法是最为经济、简单的细胞融合技术，但受多种因素影响，实际实验效果并不理想，为获得高效稳定的细胞融合效率，本研究拟对PEG诱导的鸡红细胞的融合实验进行优化。
方法：调整鸡红细胞的采集与保存方式、细胞浓度、缓冲系统（GKN与1640）、pH、诱导与孵育时间，以及染液的选择等。
结果：弱碱PEG环境（pH≈7.8）下诱导与孵育时间均采用5min时，细胞融合率最高（17.87%），显著高于未调节pH组及诱导与孵育时间20min组（＜0.01）；pH>8时，细胞聚集但胞膜皱缩破裂，计算融合率困难；亚甲基蓝、中性红染色时间>20min时，细胞膜亦皱缩破裂。
结论：宜选择肝素类抗凝管采集及保存鸡血，在GKN或1640缓冲系统中，以全血与试剂1:9比例洗涤及孵育，弱碱PEG环境（pH≈7.8）分别诱导、孵育5min，并在20min内观察亚甲基蓝或中性红染色结果，该方案适宜应用于PEG诱导的鸡红细胞融合实验教学。
【关键词】聚乙二醇；细胞融合；鸡红细胞；缓冲体系；pH；时间；染色剂中图分类号：G642.423；R394-33文献标识码：AOptimization of the Experimental Scheme for Chicken Red Blood Cell FusionInduced by PEGLI Ling，LIU Huan，HE Ya-ling，CUI Lin，TANG Hui，ZHANG Jun，ZHANG Liang（Shihezi University Medical College，Shihezi，Xinjiang832002）【Abstract】Objective：PEG-mediated cell fusion is the most economical and simple cell fusion technique.However the experimental results are not ideal due to various factors.In order to obtain efficient and stable cell fusion efficiency，we optimized the experiment.Methods：Methods of the chicken red blood cell collection and preservation，cell concentration，buffer system(GKN and1640)，pH，induction time and incubation time were adjusted，as well as other methods such as selected different dyes.Results:In the weak alkali environment(PEG pH≈7.8)，the cell fusion rate was the highest(17.87%)when both the induction and incubation time were5min，which was significantly higher than that of the group without adjusted pH and the group with induction and incubation time of 20min(＜0.01).At pH>8，cells gathered trend obvious，but it was difficult to calculate the fusion rate due to the cell membrane shrinkage and rupture.The cell membranes were also crumpled when the staining time was more than 20min with methylene blue or neutral red dye.Conclusion：It is recommended to collect and store chicken blood with heparin anticoagulant tubes，whole blood was washed and incubated with GKN or1640buffer at a ratio of1:9 and then weakly basic PEG was used to induce and incubate the cells for5min respectively，and the cell staining results within20min were observed with methylene blue or neutral red dye，this scheme is suitable for practical experiment teaching.【Key words】Polyethylene glycol(peg)；Cell fusion；Chicken red blood cell；Cell Buffer system；pH；Time；Dye solution基金项目：石河子大学教育教学改革项目（SJ-2018-15）；国家自然基金项目（81600325）。
用鸡红细胞取代Hela细胞进行细胞融合的实验研究
用鸡红细胞取代Hela细胞进行细胞融合的实验研究李小玉 胡火珍 张建国(四川大学生命科学院医学生物学与细胞生物学教研室,成都610041)【摘要】为了探讨更经济、简便、有效的细胞融合方法,作者用鸡红细胞和Hela细胞为材料,聚乙二醇(mw=4000)为诱导剂,诱导鸡红细胞,Hela细胞融合。
结果鸡红细胞和Hela细胞融合率分别为22%和20%,两者无显著差异,但鸡红细胞更优于Hela细胞。
【关键词】细胞融合;鸡红细胞;聚乙二醇【中图分类号】Q81312 【文献标识码】AThe study on f usion experiment of chicken red bloodcells instead of H ela cllsL i Xiaoyu Hu Huoz hen Zhang Ji naguo(Depart ment of Cell biolgy and medical biology,lif e science college,S ichan U niversity,Chengdu)【Abstract】Objective To find a more effective and economical and easier method of cell fusion.Method Make chicken red blood cells and Hela cells to fusion by part,which was in2 duced by PEG(mw=4000).R esult The rate of cell fusion in the red blood cells and hela cells were22and20.There were no singificant difference between them.【K ey w ords】cell fusion;red blood cells;Hela cells 细胞融合是两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
PEG诱导鸡红细胞融合影响因素探讨
PEG诱导鸡红细胞融合影响因素探讨马云;何昆;王晓玉;李芬【摘要】细胞融合技术是近年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术,本研究以鸡红细胞为材料,以PEG(Mw=4000)为诱导剂,研究不同的PEG体积分数(0%、25%、50%、75%、100%),不同的融合时间(5min、10 min、15 min、20 min、25 min),不同的融合温度(20℃、30℃、35℃、38℃、40℃)对鸡红细胞融合率的影响.结果显示:PEG的体积分数为50%,融合时间为15 min,温度为38℃时融合的效果最好.【期刊名称】《德州学院学报》【年(卷),期】2011(027)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】细胞融合;鸡红细胞;聚乙二醇(PEG);时间;温度【作者】马云;何昆;王晓玉;李芬【作者单位】信阳师范学院生命科学学院,河南信阳,464000;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳,464000;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华,321004;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳,464000;西华师范大学生命科学学院,四川南充,637002;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳,464000【正文语种】中文【中图分类】Q272;Q781细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒、肿瘤和培育生物新品种的重要手段,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视.在普通高中生物课程标准实验教科书的现代生物科技专题中,已经将细胞融合技术写入了课本.聚乙二醇(PEG)法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器设备、操作方便等优点,被普遍用于生物、遗传、医药等研究领域[1,2].但同时该方法也受许多因素的影响,如 PEG的相对分子质量、PEG的体积分数、融合温度、融合时间、p H 等.为了得到更好的融合效果,本试验以鸡红细胞为材料,探讨了不同体积分数的PEG,不同的处理温度及不同的融合时间对鸡红细胞融合率的影响,并对试验数据进行生物统计,以期得到PEG诱导鸡红细胞融合的最适条件,并为细胞生物学相关实验及动物细胞融合研究参考依据.1.1 材料1)试验材料:新鲜鸡血采自信阳师范学院谭山包菜市场.2)试验仪器:Motic BA200数码互动显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司),TDL-5离心机(上海安亭科学仪器厂),恒温水浴箱,电磁炉等.3)试验试剂及配制:不同体积分数的PEG液, Alsver液,GKN液,0.85%生理盐水等试剂的配制按照参考文献[3,4]进行.1.2 试验方法1)鸡红细胞悬液的制备:按常规方法制备鸡红细胞储备液,具体操作过程参照李玲等的方法[5].2)PEG浓度对红细胞融合效果的影响:取5 mL上述鸡红细胞悬液于5个离心管中,分别加入0.5 mL浓度为0%、25%、50%、75%、100%的PEG液,在38℃条件下融合15 min.然后用詹姆斯绿染3)处理时间对鸡红细胞融合效果的影响:取五个离心管,每个离心管中加入1 mL 1.2中1)中所述细胞悬液,再加入0.5 mL 50%的PEG液,然后在38℃水浴中分别融合5 min、10 min、15 min、20 min、25 min,再进行染色观察并计算融合率.4)温度对鸡红细胞融合效果的影响:取五个离心管,每个离心管中加入1 mL 1.2中1)中所述细胞悬液,再加入0.5 mL 50%的PEG液,分别在20℃、30℃、35℃、38℃、40℃水浴中融合15 min,最后进行染色观察并计算融合率.5)细胞融合率的计算:细胞的融合率由公式:融合率=融合细胞数/总细胞数(100%)计算,然后对试验数据用卡方检验比较处理间细胞融合率的差异.2.1 PEG浓度对鸡红细胞融合效果的影响结果设置了0%、25%、50%、75%、100%的PEG诱导剂以探讨PEG浓度对鸡红细胞融合效果的影响,结果见图1和表1.由表1可以看出,在同一温度细胞融合时间相同的情况下,融合率与PEG(50%以下)的体积分数成正比,随着PEG体积分数的增加对细胞的毒性也增大,影响了细胞的融合率和融合后细胞的存活率,故PEG体积分数到达一定程度时细胞破碎无法计数.所以PEG的体积分数一般在25%～50%,50%效果较好.2.2 融合时间对鸡红细胞融合效果的影响结果融合时间对鸡红细胞融合效果的影响结果见图2和表2.由表2可以看出,在PEG的浓度为50%和温度为38℃的条件下,随着处理时间的变长,有较多的鸡红细胞发生融合.当融合时间为15 min时,鸡红细胞的融合效果最好,但从整体来看融合率不随时间的推移而发生显著的变化.2.3 温度对鸡红细胞融合效果的影响结果融合温度对鸡红细胞融合效果的影响结果见图3和表3.由表3可以看出,在最适的PEG浓度和融合的最适时间下,随着温度的升高融合率也升高,但温度过高,融合率又降低,鸡红细胞融合的最适温度在38℃,因此细胞融合须在细胞能承受的温度范围之内,不能太低也不能太高.3.1 关于PEG对鸡红细胞融合效果的影响结果PEG诱导的细胞融合受很多因素的影响,如PEG相对分子量、PEG的体积分数、融合的温度、时间等.细胞的融合的效果与PEG的相对分子量及体积分数成正比,但PEG的分子量越大、体积分数越高,对细胞的毒性也就越大.为了兼顾二者,在实验中常采用的PEG分子量为4000或6000,体积分数一般为25%～60%.大部分研究表明分子量为4000的PEG效果要好些[6].因此本试验所采用的 PEG相对分子量为4000,设计了五个浓度梯度,结果显示,PEG的体积分数为50%时,融合率较高.李秀兰等的研究证明PEG的体积分数在30%～50%时融合效果较好[7],与本试验结果相似.3.2 关于融合时间对鸡红细胞融合效果的影响结果融合时间对鸡红细胞的融合率影响不太明显,在最适温度、最适PEG浓度下,细胞融合的最适时间为15 min,融合率不随时间的推移发生显著变化,其结果与赵彦禹[8]等所做结果一致,李小玉等用鸡红细胞代替Hela细胞融合实验的研究中也得到了这样的结果[6].所以可以说鸡红细胞融合的最适时间是15 min,时间对细胞融合的影响不显著.3.3 关于温度对鸡红细胞融合效果的影响结果温度对鸡红细胞融合率的影响在一定范围内随温度的升高而升高[8].本研究结果显示同一时间、最适PEG浓度下,鸡红细胞融合的最适温度为38℃,原因可能是随着温度的上升,膜的流动性加快,有利于细胞融合的进行[8].但温度过高,融合率又降低,因此融合温度必须在细胞能承受的温度之内.【相关文献】[1]张晓红,夏光敏.青苗碱谷与高冰草的体细胞杂交及杂种性质鉴定[J].上东大学学报,2005,40(5):107-112.[2]夏光敏,陈慧民.普通小麦与族毛麦不对称体杂交的研究[J].中国科学C辑,1996,26(1):31-37.[3]杨汉民.细胞生物学实验(第二版)[M].北京:高等教育出版社,1997:109-110.[4]戴谷,黄晶晶,黄敏.关于开设细胞融合实验的讨论[J].江苏教育学院学报(自然科学版),2006,23(4):1-3.[5]李玲,李雪峰.细胞生物学实验(第一版)[M].长沙:湖南科学技术出版社,2003:114-116.[6]李小玉,胡火珍,张建国.用鸡红细胞取代 Hela细胞融合实验研究[J].四川解剖学杂志,2002,10(3):132-133.[7]李秀兰,姜曰水.聚乙二醇诱导细胞融合影响因素探究[J].菏泽学院学报,2007,29(5):79-81.[8]赵彦禹,张艳华,冯照军.鸡红细胞融合最适条件的探讨[J].生物磁学,2006,6(1):43-45.。
实验一：鸡血细胞融合
实验一：鸡血细胞融合一、实验目的1、熟悉细胞融合的理论；2、掌握PEG诱导的细胞融合方法。
二、实验原理1、细胞融合原理两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。
利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。
学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。
2、细胞融合方法诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较
PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较PEG（聚乙二醇）介导的鸡血细胞融合实验是一种常用的细胞学实验方法，用于研究细胞融合、基因转移、病毒感染等现象。
在这个实验中，PEG起到促进融合的作用。
本文将对常用的PEG诱导鸡血细胞融合实验方法进行比较。
1.直接混合法：直接混合法是最简单直接的方法，将两种不同细胞类型的细胞直接混合，加入PEG处理后，通过细胞的融合产生融合细胞。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至对数生长期。
b.将细胞收集、洗涤后，按照一定比例混合在一起。
c.在混合细胞悬液中加入PEG，进行处理。
d.处理后的细胞悬液进行培养。
优点：简单快捷，操作方便。
缺点：融合效率低，融合细胞的纯度较低，难以鉴定融合细胞。
2.等渗处理法：等渗处理法使用PEG使两个细胞类型的渗透压基本相等，减小由于渗透压差带来的融合细胞死亡的可能性。
实验步骤类似于直接混合法，不同之处在于在混合前要将细胞分别处理加入等量的PEG。
优点：可以减少融合细胞死亡的可能性。
缺点：融合效率仍然较低，难以确保融合细胞的纯度。
3.高瓶底法：高瓶底法是一种间接融合法，将两种细胞性的细胞分别培养到八倍增生指数时接种于两个高菌瓶内，将角质层去除，用高菌瓶口与高速离心的纺棉花轻摩转盘瓶底，离心至指定g数。
因离心后双方菌瓶接触，菌体外膜断裂，细胞在瓶壁内微小空间聚集，有利于融合。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至八倍增生指数。
b.将细胞收集后接种于两个高菌瓶内。
c.去除角质层，将高菌瓶口与高速离心的纺毛轻摩转盘瓶底。
d.将菌瓶离心至指定g数。
优点：融合效率较高，融合细胞纯度较高。
缺点：操作复杂，需要使用专用设备。
4.电熔法：电熔法是利用电场将两种细胞融合的方法。
通过电熔法可以达到融合效率较高的效果。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至对数生长期。
b.将细胞收集后接种于电熔腔中。
c.设置一定的电场参数，通过电场产生的作用使细胞融合。
细胞生物学实验-鸡血细胞的体外融合
鸡血细胞的体外融合
应用领域（微生物）： 对微生物而言，细胞融合技术主要用于改良微生物菌种特性、提高目的
鸡血细胞的体外融合
细胞融合的方法： 聚乙二醇诱导融合：聚乙二醇具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质
的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动 物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用，在稀释和除去聚乙 二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的分子机理还不 太清楚。作为化学试剂，聚乙二醇使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比 较高，但是它有一定毒性，对有些细胞（如卵细胞等）不适用。
鸡血细胞的体外融合
成纤维细胞
Байду номын сангаас
鼠肿瘤细胞
植物细胞A
植物细胞B
仙台病毒 融合培养基
融合
去掉细胞壁
原生质体A
原生质体B
形成杂种细胞
在选择性培养 基中杂种细胞 增殖形成克隆
异核体 杂种细胞
原生质体融合 再生细胞壁
杂种细胞 细胞分裂
愈伤组织
杂种细胞克隆
杂种植株
鸡血细胞的体外融合
实验器材：
普通光学显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、滤纸、胶头吸管、 离心机、血细胞计数板、水浴锅、烧杯、容量瓶、酒精灯。
鸡血细胞的体外融合
应用领域（动物细胞）：
1. 用于基因定位和绘制人类基因图谱：根据杂种细胞中某一染色体或其片段的存 在与否和细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染 色体或某一区段上。
PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较
文章编号：2096-0387 (2018) 02-0112-03第4卷第2期 生物化工Vol.4 No.22018 年 4 月Biological Chemical EngineeringApr. 2018PEG 诱导鸡血细胞融合实验方法比较黄伟伟，颜华，高梅，李绍军(西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵712100)摘要:细胞融合技术是细胞生物学的一项核心技术，在科学研究、医药开发、农业育种等方面有着广泛应用。
PEG 法诱导鸡血细胞融合实验也被作为细胞生物学本科实验的一项重要内容，但在实验课程中的融合效果不佳。
笔者查阅相关细胞生物学 实验指导教材和文献，发现存在两种截然不同的PEG 法诱导鸡血细胞融合操作方法。
因此，本文对两种方法进行了比较，并进一 步讨论了影响PEG 法诱导鸡血细胞融合效率的重要因素和改进方法。
关键词：细胞融合；PEG ;鸡血细胞；实验优化 中图分类号：Q813文献标志码：AComparison of Two Experimental Methods of PEG Induced Chicken Blood Cell FusionHuang Wei-wei, Yan Hua, Gao Mei, Li Shao-jun(College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry University, Shaanxi Yangling 712100)Abstract: Cell fusion is one of core technologies of cell biology, which has been widely applied in scientific research, medicine development, agricultural breeding and so on. Experiment of PEG induced chicken blood cell fusion is an important content of cell biology experimental course for undergraduate students, but the fusion effect in the experimental course is not good. The author consulted the relevant cell biology experimental guide textbooks and literature, and found that there are two different protocols for PEG induced chicken blood cell fusion. So in this paper, we compared these two operation methods, further discussed the important factors related with the cell fusion efficiency and give some advice for the operation method optimization.Key words ： Cell fusion; PEG; Chicken blood cells; Experiment optimization细胞融合（Cell fusion )是在自然条件下或人工 诱导条件下使两个或两个以上的细胞合并成为一个 双核或多核细胞的过程。
鸡血细胞体外融合的影响因素研究
鸡血细胞体外融合的影响因素研究王浩;赵锦慧【摘要】The effects of chicken blood cell density ,PEG concentration ,PEG duration ,standing time of chicken blood cell suspension ,calcium ion concentration on cell fusion in vitro were studied .The results showed as follows :cell fusion rate was the highest when cell density was 1 ×107/mL ,PEG concentration was 50% ,PEG duration was 10minutes ,standing time of chicken blood cell suspension was 10 minutes ,calcium ion concentration was 50.0 mmol/L .%实验研究了鸡血细胞密度、PEG浓度、PEG作用时间、鸡血细胞悬液放置时间、钙离子浓度等因素对鸡血细胞体外融合的影响．结果表明：细胞密度为1×107个/mL ，PEG浓度为50％，PEG作用时间为10 min ，细胞悬液放置时间为10 min ，钙离子浓度为50.0 mmol/L时细胞融合率最高．【期刊名称】《周口师范学院学报》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】4页(P96-99)【关键词】鸡血细胞融合;聚乙二醇;细胞密度;细胞悬液放置时间;钙离子浓度【作者】王浩;赵锦慧【作者单位】周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001;周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001【正文语种】中文【中图分类】Q233细胞融合，又称细胞杂交，是指在离体条件下人为地将不同种生物或者同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术.PEG法诱导细胞融合，细胞容易制备、活性稳定、不需要特制的仪器设备、操作方便、融合率较高，因而被广泛用于细胞遗传、细胞免疫、基因定位、病毒、肿瘤等基础研究，也用于单克隆抗体制备和生物新品种培育，同时也被作为大学细胞工程实验教学内容［1].在实际操作中，该方法易受许多因素的影响，如PEG浓度、PEG作用时间、鸡血细胞悬液浓度、鸡血细胞悬液放置时间、钙离子浓度等，致使有时融合率不高或不稳定［2].本研究以家鸡血红细胞为材料，探索影响细胞体外融合的各种因素，为动物细胞融合研究和细胞生物学相关实验提供参考.1 材料与方法1.1 实验材料及仪器公鸡全血，PEG，NaCl，Hanks液，0.5%酚红，GKN液.血细胞计数板，刻度离心管，离心机，水浴锅，盖玻片，容量瓶，载玻片，移液管等.1.2 实验方法1.2.1 0.85%NaCl溶液的配制称取NaCl 0.85g，溶于100mL的蒸馏水中.1.2.2 GKN液的配制［3]称取NaCl 8.0g、葡萄糖2.0g、Na2HPO4·2H2O 1.77g、KCl 0.4g、NaH2PO4·H2O 0.69 g、酚红0.01g，溶于1000mL的重蒸水中.1.2.3 Hanks液的配制［3]原液A：称取NaCl 16.0g、KCl 8.0g、MgSO4·7H2O 2.0g、MgCl2·6H2O 2.0g、CaCl2（无水）2.8g，溶于双蒸水至1000mL，滤纸过滤，储存于4.0℃；原液B：葡萄糖20.0g、Na2HPO4·12H2O 0.06g、KH2PO41.2g、双蒸水800mL，用滤纸过滤，加入0.5%酚红80mL，加水至1000mL，储存于4.0℃. Hanks液：A、B液各1份，双蒸水18份，用5.6%NaHCO3调节pH至7.4.1.2.4 不同浓度的PEG溶液（m／V）的配制［3]（1）分别称取PEG 6g置于4个小烧杯中，然后放入恒温水浴锅中水浴加热，使其融化.（2）让PEG缓慢冷却到50～60℃，注意不要使PEG凝固.（3）向4个小烧杯中分别加入预热至50℃的GKN液混匀，配制成10%，30%，50%，70%的PEG溶液.1.2.5 鸡血细胞悬液的配制［3]（1）用注射器在鸡翼下静脉采血，注入试管后，迅速加入肝素（20U肝素／mL全血），混合均匀，制成抗凝全血.（2）向抗凝全血的试管中加入4倍体积的0.85%的生理盐水溶液.混合均匀，制成红细胞贮备液，4℃冰箱保存.（3）取1mL的鸡血细胞贮备液于刻度离心管中，加入4mL 0.85%的生理盐水，混合均匀，放入低速离心机中，1000r／min条件下离心5min，弃上清.按上述条件再离心一次.（4）将沉淀物配制成悬浮液.并采用血球板计数法将悬浮液分别稀释成细胞密度为1×106，1×107，1×108个／mL的悬液.1.2.6 细胞融合实验方法［4，5]（1）不同条件下细胞融合方法①不同鸡血细胞悬液浓度下细胞融合方法分别取1mL细胞密度为1×106，1×107，1×108个／mL的鸡血细胞悬浮液（其中含有的CaCl2浓度为12.6mmol／L）到3支刻度离心管，分别加入4mL Hanks液后混匀，1000r／min条件下离心5min，弃上清，通过用手指多次轻弹离心管底部使沉淀的血细胞团块变得松散.向3支刻度离心管中分别加入0.5mL浓度为50%的PEG溶液（预热至37℃），要沿管壁缓慢加入，边加边摇匀，加入后在37℃水浴锅中静置10min.②不同PEG浓度下细胞融合方法按照①的操作方法进行，其中1mL鸡血细胞悬浮液的细胞密度固定为1×107个／mL，加入浓度分别为10%，30%，50%，70%的PEG溶液.③不同PEG作用时间下细胞融合方法按照②的操作方法进行，其中PEG溶液的浓度固定为50%，加入PEG溶液后静置时间分别为2，5，10 ，20min.④不同鸡血细胞悬液放置时间下细胞融合方法按照③的操作方法进行，其中加入PEG溶液后静置10min，1mL鸡血细胞悬浮液分别放置5，10，15min后再加入到离心管中.⑤不同钙离子浓度下细胞融合方法按照①的操作方法进行，其中1mL细胞密度为1×107个／mL的鸡血细胞悬浮液中含有的钙离子浓度分别为0，12.6，50.0，75.0，100mmol／L.（2）终止PEG作用及染色观察①向各离心管中缓慢加入5mL Hanks液，然后轻轻吹打混匀，在37℃水浴锅中静置5min，终止PEG作用.②为使细胞团分散，多次用吸管轻轻吹打细胞团，1000r／min条件下离心5min，使细胞完全沉降，弃上清.然后按上述条件，再次离心，弃上清，加入少许Hanks 液，混匀.③在上述各离心管中加入Janus green B染液，用牙签搅匀，染色3min.分别用不同的吸管吸取各刻度离心管中溶液制成装片，在显微镜下观察细胞融合情况. 1.2.7 细胞融合率计算［6，7]细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总数的百分比.融合率（%）＝（融合细胞核数／总细胞核数）×100%.每一处理制成3个装片，每个装片统计5个视野，细胞融合率取其平均值.2 结果与分析2.1 细胞融合过程的观察图1 鸡血细胞融合过程1图2 鸡血细胞融合过程2显微镜下观察到的细胞融合过程见图1和图2（箭头所指），两个细胞逐渐靠近，细胞膜首先发生融合，然后再到细胞质，出现融合桥，最后细胞内物质通过这种通道得到转移.2.2 不同鸡血细胞悬液浓度对细胞融合率的影响细胞密度是影响细胞融合的重要因素之一.不同鸡血细胞悬液浓度对鸡血细胞融合率的影响结果见表1.表1数据显示：鸡血细胞密度为1×107个／mL时融合效果最好，细胞融合率达到21.35%，这与李秀兰［8]等研究结果一致.表1 不同细胞密度下的鸡血细胞融合率细胞密度／（个／mL）观察细胞数／个细胞融合数／个细胞融合率／%1×106 35 7 20.001×107 65 14 21.351×108 90 10 11.112.3 不同PEG浓度对鸡血细胞融合率的影响PEG的体积分数大小是PEG融合技术的关键［9].由表2可知：同一细胞密度下，PEG体积分数≤50%时，细胞融合率与PEG的体积分数成正比；PEG体积分数为70%时，细胞融合率反而降低.由于PEG具有一定的毒性，体积分数越大对细胞的毒性越大，并且对融合率和融合后细胞的存活率影响也非常明显，故PEG的体积分数一般为50%时细胞融合效果及融合后细胞的存活情况较好.表2 不同PEG浓度下的鸡血细胞融合率体积分数／% 观察细胞数／个细胞融合数／个细胞融合率／%10 300 2 0.6730 75 13 17.3350 73 14 19.1870 78 13 16.672.4 不同PEG作用时间对鸡血细胞融合率的影响表3 不同PEG作用时间下的鸡血细胞融合率PEG作用时间／min观察细胞数／个细胞融合数／个细胞融合率／%2 108 19 17.595 109 21 19.2710 88 20 22.7320 121 27 22.31不同PEG作用时间对鸡血细胞融合率的影响结果见表3.由表3可知：PEG作用时间≤10min时，细胞融合率随着作用时间的延长呈增加趋势；作用时间为10min 时细胞融合率最大，达22.73%；作用时间为20min时细胞融合率为22.31%.虽然下降不明显，但部分细胞已经破碎.因此，10min为最佳融合时间，这与仇燕［10]等研究结果相一致.2.5 不同鸡血细胞悬液放置时间对细胞融合率的影响不同鸡血细胞悬液放置时间对鸡血细胞融合率的影响结果见表4.表4数据显示，细胞悬液放置时间为10min时细胞融合率最大，达21.54%.因此，细胞悬液最佳放置时间为10min.表4 不同细胞悬液放置时间下鸡血细胞融合率细胞悬液放置时间／min观察细胞数／个细胞融合数／个细胞融合率／%5 40 5 12.5010 65 14 21.5415 87 16 18.392.6 不同钙离子浓度对鸡血细胞融合率的影响表5统计结果说明：CaCl2浓度≤50.0mmol／L时，细胞融合率随着钙离子浓度的增大而增加.当CaCl2浓度＞50.0mmol／L时，细胞融合率随着钙离子浓度的增大而减少.钙离子浓度为50 mmol／L时细胞融合率达到最大，为21.58%.钙离子浓度为100mmol／L时，细胞大部分破裂，细胞融合率为0.这与赵咏梅［11]等研究结果基本一致.表5 不同钙离子浓度下鸡血细胞融合率CaCl2浓度／（mmol／L）观察细胞数／个细胞融合数／个细胞融合率／%0 90 15 16.6712.6 121 22 20.1850.0 139 30 21.5875.0 108 13 12.04100.0 91 0 03 讨论PEG是普遍应用的融合剂，它与水分子的氢键结合，导致细胞质膜结构发生变化，使细胞接触的部位膜脂双层中磷脂分子发生疏散，细胞膜结构发生重排，然后使细胞胞质沟通，相互接触的细胞发生融合.影响PEG诱导细胞融合的因素很多，如细胞密度、PEG浓度、PEG作用时间、钙离子浓度等，将影响细胞融合的因素进行合理的组合就能获得较高的细胞融合率.研究表明［12]，鸡血细胞融合的最适温度为37℃.在此条件下，本实验证明PEG的最适体积分数为50%，在最适PEG体积分数下，细胞融合的最适时间即PEG作用时间为10 min，若超过10min，PEG作用时间越长，对细胞毒害越大，最终会致使细胞破裂.细胞密度为1×107个／mL时融合效果最好，细胞悬液放置10min时细胞融合率最大.钙离子浓度对细胞融合也有明显的影响，本实验结果表明：当CaCl2浓度为50 mmol／L时，细胞体外融合效果最好，融合率高达21.58%.当然，细胞的种类不同，也会导致融合时的最适条件也有差别，有待进一步研究.细胞融合技术为单克隆抗体和抗肿瘤疫苗的制备以及动物、植物远缘杂交育种开拓了新途径.伴随着细胞融合技术的改进，其在各个领域被充分应用，在实际应用中又不断伴随着新的问题出现，在解决实际问题中又促使细胞融合技术跃上一个又一个新的台阶.PEG法以其低廉的成本实现相对较高的融合率，在许多实验中应用更加广泛.因此，对于PEG化学融合方法的改进有着十分重要的意义［13].此外，PEG化学融合方法与其他学科的技术交叉，例如物理、计算机科学等，也将会是细胞融合技术发展的新方向.参考文献：［1]刘哲，张峰，佟丹丹，等.鸡红细胞体外融合最适条件的研究［J].辽东学院学报，2009，16（4）：335-337.［2]赵彦禹，张艳华，冯照军.鸡红细胞融合最适条件的探讨［J].生物磁学，2006，6（1）：43-44.［3]王金发，何炎明.细胞生物学实验教程［M].北京：科学出版社，2004：150-152.［4]徐承水，党本元.现代细胞生物学技术［M].青岛：青岛海洋大学出版社，1995：73-78.［5]赵志强，郑小林，张思杰，等.细胞融合技术［J].生物学通报，2005，40（10）：40-41.［6]杨汉民.细胞生物学实验［M].2版.北京：高等教育出版社，1997：109-111. ［7]王娟娟，贾彦军.微生物原生质体融合方法的综述［J].畜牧兽医科技信息，2005（10）：17-19.［8]李秀兰，姜曰水.聚乙二醇诱导细胞融合影响因素探究［J].菏泽学院学报，2007，29（5）：79-82.［9]马云，何昆，王晓玉，等.PEG诱导鸡红细胞融合影响因素探讨［J].德州学院学报，2011，27（2）：54-58.［10]仇燕，李朝炜，苗芳.聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化［J].生物技术，2011，21（3）：50-53.［11]赵咏梅，郭云婷，马蕊，等.PEG介导细胞融合的最适条件探究［J].西安文理学院学报（自然科学版），2007，10（3）：76-78.［12]李保华.细胞融合技术研究进展［J].安徽农业科学，2008，36（15）：6187-6188，6207.［13]霍乃蕊，韩克光.细胞融合技术的发展和应用［J].激光生物学报，2006，15（2）：209-213.。
peg介导的动物细胞融合
PEG介导的动物细胞融合技术XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)一、实验目的：1、通过PEG介导的鸡血细胞融合实验,对体细胞融合有一个清楚的概念2、并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术3、通过实验操作，进行细胞融合，并测定融合率。
二、实验原理：真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。
人工的细胞融合开始于20世纪50年代,60年代到70代作为一门新兴的技术,发展非常快,应用范围也极为广泛,不仅同种类细胞间可以融合,种间远缘细胞也能融合,细胞与组织不同,不排斥异类、异种细胞,动物细胞如此，植物细胞也是如此。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。
利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。
学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
利用PEG介导细胞融合,其融合效果受以下几种因素的影响。
1.PEG的分子量与浓度:细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。
为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。
2.PEG的pH值:经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。
3.PEG 的处理时间:处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。
故一般将处理时间限制在1分钟之内。
本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。
鸡红细胞融合最适条件的探讨
表2 时间 ( min) 融合率 ( % ) 21
在 39 5 23
, 不同时间下鸡红细胞的融合率 7 20 8 31 10 35 15 31 20 32 30
Best Condition Studies on Fusion of Chicken Red Blood Cells
ZHAO Yan - yu, ZHANG Yan - hua, FENG Zhao- j un School o f Life Science, Xuzhou Normal University ( 221116) ABSTRACT Objective: to find a more effective and easier method of cell fusion. Methods: Make chicken red blood cells to fusion, which was induced by PEG ( Mw = 4000) . Results: the most appropriate condition for cell fusion in the chicken red blood cells is 39 centigrade and15minutes. Conclusion: on this condition, the fusion phenomenon of chicken red blood cells is evident. Key words: cell fusion; chicken red blood cells; PEG 细胞融合是两个或两个以上的细 胞合并形 成一个细 胞的 过程。在自然条件下 , 体内 或体 外培 养的细 胞均 可发 生自 然 融合 , 用人工的方法亦可诱导 细胞发生融 合。目前 , 细胞 融合 这一技术已成为研究细胞遗传、 细胞免疫、 肿瘤和 培育生 物新 品种的重要 手段。进行 细胞 融合 实验 , 一般 实验 条件 是聚 乙 二醇为诱导剂 , 融 合温度 是 37 , 时间为 30min, 融合 效率低 , 观察效果不 明显。本文 以鸡 红细 胞做实 验材 料 , 对实 验条 件 作了一些改进 , 探 讨 融合 的最 适 条件 , 以 达 到更 好 的实 验 效 果。
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1． 1 材料 1． 1． 1 实验材料
鸡全血，市购。 1． 1． 2 试剂
PEG4000 为分析纯（ 25% 、35% 、50% 、75% ） ，美国 Biobasic 公司； Alsever 液、0． 85% 生理盐水、GKN 液、Janus green B 染 液。 1． 1． 3 仪器
取 1． 2． 3． 1 中融合率最高的细胞悬液 1ml，将慢慢逐滴加 入 0． 5ml 预热后的 50% PEG 溶液然后放入不同温度（ 30℃ 、 35℃ 、37℃ 、39℃ ） 水浴锅中 20min，步骤同上。 1． 2． 3． 3 不同浓度 PEG 对鸡血细胞融合率的影响
向 1ml 细胞悬液中慢慢逐 滴 加 入 0． 5ml 不 同 体 积 分 数 PEG 溶液（ 25锅中反 应 20min，步骤同上。 1． 2． 3． 4 不同反应时间对鸡血细胞融合率的影响
将 10% 细胞悬液（ 经血球计数器计数此细胞悬液密度为 2 × 107 个 / ml） 分别稀释 10 倍、20 倍、40 倍和 100 倍。1ml 不 同浓度细胞悬液预热后，慢慢逐滴加入 0． 5ml 预热后的 50% PEG 溶液（ 慢慢沿离心管壁流下） ，且边加边摇匀，然后放入 30℃ 水浴锅中 20min，余下步骤同 1． 2． 3。 1． 2． 3． 2 不同融合温度对融合率的影响
中图分类号： Q813． 2 文献标识码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 03． 074
Optimal Condition of PEG － Induced Chicken Red Blood Cells Fusion
QIU Yan，LI Zhao － wei，MIAO Fang
聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化
仇燕，李朝炜，苗芳
（ 河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018） 摘要：目的：探讨聚乙二醇诱导鸡红细胞融合最适条件。方法：以鸡红细胞为材料，聚乙二醇为诱导剂，从细胞密度、融合温 度、聚乙二醇浓度及反应时间进行单因素实验，并设计 3 因素 3 水平的正交实验计算细胞融合率。结果：鸡红细胞融合的最佳条 件是： 细胞密度为 2 × 106 个 / ml，聚乙二醇浓度为 35% ，反应温度为 35℃ ，反应时间 40min。结论：在该条件下，细胞融合率最高达 33． 06% 。 关键词： 细胞融合； 鸡红细胞； 聚乙二醇
1ml 鸡血细胞悬液加入 0． 5ml 35% PEG 溶液，35℃ 融合不 同时间（ 20min、30min、40min、50min、60min） 。 1． 2． 4 正交实验
在结合上述单因 素 实 验 的 基 础 上，对 影 响 细 胞 融 合 的 各 因素，即 PEG 浓度、融合时间及融合温度进行三因素三水平正 交实验（ 如表 1） 。
细胞融合（ cell fusion） 又称细胞杂交，是指用人工方法使 两个或两个以上的细胞融合成一个异核体细胞的现象。细胞 融合技术一方面为脊椎动物肌生成、炎症反应［1］、抑制肿瘤［2］ 及基因定位［3］等理论领域研究提供有力的手段； 另一方面也 是制备单克 隆 细 胞 株 及 动 植 物 远 缘 杂 交 育 种 方 面 的 重 要 技 术。依据融合过程采用的助溶剂的不同，细胞融合可分为： ① 生物法： 病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒； ②化学法： 化学因 子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（ PEG） ； ③物理法： 激光、电脉 冲诱导的细胞融合。其中 PEG 介导细胞融合法是最简单最常 用的方法，由于操作简便，不需复杂仪器，融合效果好［4，5］等优 点成为本科生细胞生物学实验课中的首选方法。传统教材中 的融合条件 为： 细 胞 浓 度 常 选 用 2 × 105 个 / ml，融 合 条 件 为 30℃ ，50% PEG（ MW = 4000） 介导反应 10 ～ 15min［6］。但在该 实验条件下细胞融合率较低，计数困难。为此，本实验在单因 素试验的基 础 上 设 计 正 交 试 验 对 融 合 率 进 行 了 全 面 系 统 比 较，以优化 PEG 介导细胞融合的反应条件。
表 1 正交设计试验的因素与水平 Tab． 1 Factors and levels of orthogonal test
收稿日期：2010 － 11 － 23；修回日期：2011 － 03 － 18 资助项目：河北科技大学理工学院教研项目（ 2009Y05） ； 河北科技大学 教研项目（ 2009 － YB010） 资助 作者简介：仇燕（ 1977 － ） ，女，河北井陉人，博士，副教授，研究方向： 细 胞生物学与分子生物学，发表论文 20 篇，Tel： 0311 － 88632198，Email： qiuyan77@ yahoo． com． cn。
KGF 的活性专一性比较强，主要限于上皮性细胞，寻找一 种专一的、敏感的检测细胞一直是目前的研究热点。我们通过 筛选，获得了一种与文献报道不同［8］，对 rhKGF 较为敏感的细 胞—貂肺上皮细胞 Mv － 1 － Lu，初步建立了 rhKGF 生物学活 性检测方法。经检测，纯化的 rhKGF 能刺激貂肺上皮细胞 Mv － 1 － Lu 的增殖，具有显著的促有丝分裂活性，生物学活性与 美国对照品 KepivanceTM 相当。
1． 2． 2 细胞融合 采用血球板计数法将已洗涤纯化的鸡红血细胞悬浮液稀
释成不同的密度，取 1ml 细胞悬液于离心管，放入水浴锅中预 热，同时将不同浓度 PEG 溶液放入水浴锅中预热。待温度恒 定后，在 1ml 细胞悬液中慢慢逐滴加入 0． 5ml PEG 溶液（ 慢慢 沿离心管壁流下融合剂） ，且边加边摇匀，然后放入不同温度 水浴锅中。细胞融合一段时间后，加入 GKN 溶液至 8ml，静止 于水浴锅中 20min 左右。取出离心管，2 000r / min 离心 3min， 使细胞完全沉降。弃去上清液，加入 GKN 溶液至 8ml，再离心 1 次。染色弃去上清液，用手指轻弹底壁使沉淀松散，加入少 量 GKN 溶液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入 Janus green B 染液，用牙签搅匀，染色 3min 后盖上盖玻片，观察细胞融合 情况。 1． 2． 3 单因素实验 1． 2． 3． 1 不同细胞密度对融合率的影响
2011 年 21（ 3）
生物技术
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（ College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）
Abstract： Objective： To find the optimal condition of chicken red blood cells fusion with PEG （ Mw = 4000） as the revulsant． Method： The effects of different cell density，fusion temperature，PEG concentration and reaction time on cell fusion rate were studied． Three factors and three levels of orthogonal test were designed to attain the best cell fusion condition． Result： The most appropriate condition for cell fusion was cell density 2 × 106 / ml，35% PEG，35 centigrade and 40min． Conclusion： Under this condition，the highest cell fusion rate reached 33． 06% ． Key words： cell fusion； chicken red blood cells； PEG
本研究建立了一种适合产业化生产的制备高纯度 rhKGF 的工艺和有效生物学活性的检测方法。该工艺具有表达水平 高、工艺简便、回 收 率 高、产 物 活 性 高 等 特 点。 制 备 工 艺 和 检
测方法的建立将为该因子的进一步研究和临床应用提供良好 基础。
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