RNAi鉴定药物靶点及siRNAs治疗疾病

收稿日期：２００８－０９－１６作者简介：王春梅（１９８２－），女，贵州六盘水人，在读硕士，主要从事药物分子方面的研究；黄思贵（１９６７－），男，四川内江人，主治医师。

November ，2008第21卷第6期重庆教育学院学报Vol.21No.62008年11月Journal of Chongqing College of Education１９９０年，Ｃ．Ｎａｐｏｌｉ［１］在研究矮脚牵牛花（ｐｅｔｕｎｉａｓ）颜色时，他将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛花中，希望加深花朵的紫颜色，结果多数花出现了花斑甚至表现为白色，Ｃ．Ｎａｐｏｌｉ将这种现象命名为协同抑制。

１９９８年Ｆｉｒｅ［２］将双链ｄｓＲＮＡ正义链和反义链复性退火后的混合分子注人线虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ），导致了比单独注射正义链或反义链的基因沉默效应要强得多，后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其子一代的同源基因沉默，Ｆｉｒｅ把这种现象命名为ＲＮＡｉ。

现在研究者在很多生物体内如线虫、斑马鱼、果蝇、老鼠、鸡、人中等都发现了ＲＮＡ干扰现象。

２００２年，ＲＮＡｉ被《Ｓｃｉｅｎｃｅ》杂志誉为‘ＢｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｏｆｔｈｅＹｅａｒ’［３］。

２００６年，瑞典皇家卡罗林斯卡（Ｋａｒｏｌｉｎｓｉｋａ）医学院为了表彰ＡｎｄｒｅｗＺ．Ｆｉｒｅ和ＣｒａｉｇＣ．Ｍｅｌｌｏ在１９９８年的巨大发现，将２００６年度诺贝尔生理学或医学奖授予他们［４］。

这些都足以体现ＲＮＡｉ在现代生物学中的地位。

ＲＮＡ干扰技术从被发现至今，已被广泛用于动物、植物、原生生物、真菌的基因功能研究，还被用于药学领域的研究。

ＲＮＡｉ在药学中的运用主要在两方面：一是作为工具用于药物靶标鉴定；二是作为ｓｉＲＮＡ药物治疗疾病。

在药物靶标鉴定过程中，利用ＲＮＡｉ技术大大缩短筛选药靶和先导化合物的时间，加快药物研发的速度。

很多制药公司已经开始研发能导致基因沉默的药物，包括多功能的ｓｉＲＮＡｓ、高功能高活性的ｓｉＲＮＡｓ、非核糖的ｓｉＲＮＡｓ和能与小分子药物作用的ｓｉＲＮＡｓ。

目前，在眼科疾病中已有ｓｉＲＮＡ药物进入临床试验，美国的ＡｌｌｅｒｇａｎＩｎｃ公司研发的ＡＧＮ２１１７４５已进入了Ⅱ期临床试验，它主要用于治疗湿行老年黄斑变性疾病，ＡＧＮ２１１７４５主要抑制脉络膜新生血管的形成，早期的临床试验显示，ＡＧＮ２１１７４５能改善或稳定一部分病人的视力。

ＯｐｋｏＨｅａｌｔｈＩｎｃ研发的Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ通过干扰沉默编码ＶＥＧＦ的ｍＲＮＡ用于治疗湿性老年黄斑变性疾病，已进入了Ⅲ期临床试验，试验证明其安全性和耐受性良好，可有效治疗近视和器官损害，因此被业内看好［５］。

随着越来越多的ｓｉＲＮＡ药物进入临床试验，可以预见在不久的将来ＲＮＡｉ技术将作为治疗病毒感染、癌症、神经系统性疾病、自身性免疫疾病和基因紊乱引起的疾病主要手段之一。

１ＲＮＡｉ与靶标确认１．１药物靶标药物靶标（ｄｒｕｇｔａｒｇｅｔ）是指存在于组织细胞内的一种分子结构，这种分子结构能与我们称之为药的化合物特异性相互作用，从而治疗和诊断疾病。

在已知的４８２个靶标中，鉴定出有３９９个靶标属于１３０个蛋白质家族。

由此可知，传统的药物靶标为蛋白质，如酶、抗体、蛋白质、转运蛋白等，只有少部分是ＤＮＡ或者ＲＮＡ。

２００２年，人ＲＮＡｉ鉴定药物靶点及ｓｉＲＮＡｓ治疗疾病王春梅1，黄思贵2，徐兴然1，李竞1（１.西南大学药学院，重庆４００７１６；２四川内江市第二人民医院，四川内江６４１０００）摘要：ＲＮＡｉ是与靶基因序列同源的双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）所诱导的一种特异性基因沉默现象。

ＲＮＡｉ是生物体进化过程中抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制，是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。

ＲＮＡ干扰技术的发现及其作为基因敲除工具在模式生物、哺乳动物细胞和体内的成功应用的例子确保了它在药学研究中的作用。

越来越多的研究显示ＲＮＡｉ在药物研发中显示出极大潜力，目前已有部分ＲＮＡｉ药物进入临床试验阶段。

本文将从两个方面来论述ＲＮＡｉ在药学的应用：一是ＲＮＡｉ在药物靶点鉴定中的运用；二是ｓｉＲＮＡｓ作为药物在疾病治疗中的作用。

关键词：ＲＮＡｉ；药靶；基因敲除；基因沉默；中图分类法：Ｒ９６文献标识码：Ａ文章编号：１００８－６３９０（２００８）０６－0025-0525··类基因组测序的完成，估计具有药用价值的靶标会增加到８０００个，有５０００个为传统药物的可能靶标位点，其中近２４００个为抗体药物的靶标，８００个为蛋白药物的靶标；另外３０００个将成为小分子药物作用的靶标，故开发小分子药物将成为未来新药研发的方向［６］。

２００２年，人类基因组计划完成以来，基因和蛋白质研究在横向上和纵向上都具很大的飞跃，基因组学和蛋白质组学的深入研究有助于发现已知基因的未知新功能和现在还不知道的或未能研究的与疾病有关的基因，药物的研发主要是发现新的生物靶标的和鉴定靶标，这一过程通常是：根据以往的资料，从动物研究或临床研究中发现可能，利用分子生物技术分析基因和蛋白质表达的关系、蛋白质的相互作用及其功能。

基因组学和蛋白组学被广泛用于靶标的发现与鉴定中，要分析基因蛋白质的表达和功能表型与疾病的关系和确定基因与蛋白的关系，就需要方法来确定：（１）该基因是怎样引起疾病的？（２）病理学机制是什么？最佳的方法是基因敲除，在动物中敲除或者使基因在体内过度表达来确定基因的功能，鉴定药物靶标。

但是，这一方法耗时而且劳动力需求大。

采用另一种技术虽可以弥补这些缺陷，即反义核苷酸技术，但同时反义核苷酸技术又受到一定限制，如：鉴定特异序列难、低选择性、体内和体外转染表达受限、不适用于高通量筛选。

而ＲＮＡｉ技术则可以满足新药研发中药靶鉴定中的需求，利用ＲＮＡｉ技术鉴定药物靶标，既省时，省力，特异性高，又能满足高通量和高内涵筛选的要求，加速药物的研发进程。

利用ＲＮＡｉ特异性干扰某一疾病目的基因的特定ｍＲＮＡ序列，就可以筛选出合适的药物靶标，开发高效低毒的ｓｉＲＮＡｓ药物。

目前，小分子药物主要是短肽和反义寡义核苷酸，小分子药物作用的药靶主要是蛋白质，而所有的蛋白质是由ｍＲＮＡ编码翻译的，只要干扰ｍＲＮＡ的翻译就能达到抑制蛋白质发挥其作用。

而蛋白质药物的分离纯化较困难，只有在特定的条件和环境下才具有生物活性。

不同组织表达的ｍＲＮＡ不同，同一种ｍＲＮＡ在不同组织中的起始、剪接、腺苷酰化也不同，结合ＲＮＡ特定区域的小分子药物可能只在特定的组织中起作用，而不影响其他组织ＲＮＡ的功能。

ＲＮＡｉ可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的ｄｓＲＮＡ分子，ｄｓＲＮＡ靶点可以从基因组序列获得，选择有效的算法可精确预测靶ＲＮＡ的形状，并构建靶分子模型，设计一系列的ｓｉＲＮＡｓ，注射到靶标中使目的基因沉默或疾病基因沉默而达到治疗疾病的目的。

１．２ＲＮＡｉ技术在药物靶标鉴定中的作用ＲＮＡｉ在药物发现中常被用在靶标的鉴定试验方面，通过ＲＮＡｉ技术沉默某一疾病的基因，形成缺乏特定靶标的小鼠，将药物注射到基因敲除的小鼠中，若药物没有效应，说明该药物是通过这一特定靶标作用的，利用ＲＮＡｉ和ＤＮＡ微阵列联合分析敲除某一个或几个基因后引起的多效应。

为了快速筛选到合适的靶标，现有研究将高通量筛选和高内涵筛选与ＲＮＡｉ技术结合。

高通量和高内涵阵列筛选比随机筛选具有更大的优势，如初选中提高敏感性和减少假阳性的数量，不用后续的重复筛选就能直接鉴定出活性的ｓｉＲＮＡｓ等。

为了在大量的哺乳动物细胞中（原生细胞和未分化细胞）中检测与人癌症细胞有丝分裂有关的基因，ＪａｓｏｎＭｏｆｆａｔ等［７］建立了靶向人和老鼠基因的慢病毒亚科ｓｈＲＮＡｓ库，将高内涵与ｓｈＲＮＡ库结合，筛选了靶向人的１０２８个基因的慢病毒亚科表达ｓｈＲＮＡｓ５０００个，并鉴定了已知的几个可能与有丝分裂和增殖有关的１００多个调节子，多个ｓｈＲＮＡｓ靶向同一个基因说明它可能是潜在靶标，再进一步研究确认。

靶标的确认主要有以下途径：（１）重复独立试验，观察表现型的重现性；（２）证实ｓｈＲＮＡ降低了目的基因的表达水平；（３）通过多个ｓｈＲＮＡｓ来靶向同一个目的基因确定表现型与基因抑制的程度及基因沉默水平。

这说明了ＲＮＡ的二级结构、结合能、对靶标的敏感性和靶标序列的热力学性质影响了ｓｉＲＮＡｓ的活性。

迄今为止，许多对ＲＮＡｉ的研究只使用未修饰的ｓｉＲＮＡｓ，而ｓｉＲＮＡｓ往往在体内被核酸酶降解。

为使它具有结构稳定性、酶稳定性和良好的药动学性质，需对ｓｉＲＮＡｓ进行化学修饰，ｓｉＲＮＡ分子只允许在３’或５’端突出物上进行一定的修饰，否则，其ＲＮＡｉ的活性将丧失。

另外，与正义链相比，ｓｉＲＮＡｓ的反义链更加保守，可能是因为反义链修饰后，ＲＩＳＣ的组成蛋白将很难识别ｓｉＲＮＡｓ，这将导致ＲＩＳＣ形成的减少，从而使ＲＮＡｉ效应降低甚至消失。

克服这一困难后，ｓｉＲＮＡｓ才可能被开发成为新药物来治疗疾病。

目前癌症是人类的最大杀手，在癌症中，肿瘤的发生过程主要是原癌基因、生长因子异常高表达和肿瘤抑制因子突变的结果，同时其他蛋白的低表达也可能起到关键的作用。

鉴定和确认肿瘤发生靶点的关键就是找出那些在肿瘤组织中过表达和促进肿瘤发生的靶基因。

设计特异靶向其ｍＲＮＡ的ｓｉＲＮＡ双链序列，来下调该基因ｍＲＮＡ的表达，揭示该基因靶点是否在肿瘤的形成中起到了关键作用，并观察对病理的影响是否为直接的特异作用。

ＰａｔｒｉｃｋＹ．Ｌｕ［８］开发了一种特殊的靶点鉴定方法，他们命名为Ｅｆｆｉｃａｃｙ－ＦｉｒｓｔＴＭ法。

这种方法利用对异种移植肿瘤模型进行有效的核酸运载，诱导出肿瘤生长速度受影响的表型，然后识别出被明显上调或下调的基因，即与肿瘤生长相关的基因。

利用这种方法，ＰａｔｒｉｃｋＹ．Ｌｕ选26··择了一个靶基因文库，那些基因在被ｂＦＧＦ处理过后而加速生长的肿瘤中明显过表达。

为了找出这些靶基因中哪个对肿瘤的生长起到了关键作用，他们设计了特异靶向靶基因ｍＲＮＡ序列的ｓｉＲＮＡ转染到肿瘤模型中，在重复进行ｓｉＲＮＡ双链给药后，通过检测肿瘤生长率来检测ｓｉＲＮＡ对候选靶基因的抑制效率。

Ｍａｒｔｉｎｇｅｚｅｔａｌ．［９］利用合成的ｓｉＲＮＡ在哺乳动物细胞中抑制基因表达时，发现ｓｉＲＮＡ能区别在细胞中表达的突变型和野生型ｐ５３间的单个碱基的不同，结果使野生型ｐ５３功能恢复，具有很高的特异性，存在选择性和个性化抗肿瘤治疗的潜力。

荷兰的Ｂｅｒｎｓ，Ｋ等［１０］已经利用人细胞ＲＮＡｉ库鉴别了ｐ５３信号传导途径中的１个已知的和５个新的调节基因；哈佛医学院Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｒ．等［１１］利用果蝇ＲＮＡｉ库阐明了信号干扰途径，并与脊椎动物基因组相关联，鉴定了肿瘤坏死因子包括Ⅰ型配体引起的细胞程序性死亡中信号传导的几个新的调节因子。