南京工业大学微生物实验自来水大肠菌群的检测

自来水大肠菌群的检测

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（南京工业大学生物与制药工程学院南京 211800）

【摘要】水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次

产品。另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。

【关键词】多管发酵，大肠杆菌，最大可能数(MPN)，发酵实验，革兰染色

前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严

格的常规监测。但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培养条件苛刻，分离鉴定比较困难。因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指标。大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，并且检测方法简单。因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。

大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterbactor）、克雷伯菌属（Klebsiella）。大肠菌群数是指每升水之中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠杆菌数的数目即可判断水源是否被污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。本实验采用多管发酵法对水质微生物进行分析。该方法适用于各种水样，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。初发酵试验室用无菌操作技术向一系列装有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中接种一定量水样，培养。能产酸产气者说明水样中含有大肠杆菌群细菌。再根据产酸产气（阳性）管数求出100ml待测水样中是否存在大肠杆菌群细菌，而且可以检测出待测水样中大肠杆菌群的最大可能数。平板分离试验是对于发

酵乳糖产酸产气的阳性管用接种环以无菌操作技术取一环其中的培养物，在伊红美蓝平板做划线接种，培养。若菌落呈深紫红色，为典型的大肠菌落菌群；菌落为粉红色、粘液状、不透明，为非典型的大肠菌群菌落；否则其他特征菌落均为非大肠菌群菌落。因此，通过平板分离试验可进一步确认水样中大肠菌群细菌的存在。复发酵试验是取典型或非典型的菌落，进行革兰氏染色并镜检，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则再将其接种于乳糖蛋白胨培养基中，培养。如果产酸产气则证实存在大肠菌群细菌。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。

1.1.2 培养基：乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨

2.0g、乳糖1.0g、牛肉膏0.6g、氯化钠1.0g、

1.6%溴甲酚紫溶液0.2ml、蒸馏水200ml、PH7.4。（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）

3倍浓度乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨0.75g、乳糖0.375g、牛肉膏0.225g、氯化钠0.375g、 1.6%溴甲酚紫溶液0.075ml、蒸馏水25ml、PH7.4。（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）

伊红—美蓝（EMB）培养基：伊红—美蓝（EMB）培养基粉末9.0g、200ml蒸馏水、pH7.2。

1.1.3 染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥碘液、番红染色液。

1.1.4 水样：隔夜的自来水水样。

1.1.5 其他：取样器、灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。

1.2 实验方法

1.2.1 初发酵实验：

（1）对15支试管进行标号；

取五支装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量10ml；（编号1—5）

取五支装有乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量1ml；（编号6—10）

取五只装有乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量0.1ml；（编号11—15）

（2）接种：

用移液枪分别取10ml水样加入1—5号试管中；分别取1ml水样加入6—10号试管中；分别取0.1ml水样加入11—15号试管中，摇晃均匀。

（3）培养：

将以上接种后的所有试管放入37℃培养箱中培养48h。

（4）观察实验结果：

培养48h后观察记录各加水量产酸产气的管数，即阳性试管。然后根据大肠菌群存在的管数查大肠菌群数得出每100ml水样中大肠菌群MPN，报告每升水样中大肠菌群数。利用Thomas公式计算最大可能数。

MPN/100ml=阳性管数X100/√(阴性管中的水样体积X全部试管中的水样体积)

1.2.2 平板分离：

（1）将试验中产酸产气试管中培养物以无菌操作技术分别在EMB平板上进行划线接种（要求长出单菌落），于37℃培养24h。

（2）培养24h后观察菌落特征。菌落特征类型有：

①菌落深紫色，有金属光泽——典型大肠杆菌群菌落；

②菌落深紫色，无金属光泽——典型大肠杆菌群菌落；

③菌落粉红色、粘液状、不透明——非典型大肠杆菌群菌落；

④其他特征。

（3）挑取呈①②③菌落特征的菌进行革兰染色、镜检，观察革兰染色反应结果和观察芽孢有无。

1.2.3 复发酵试验：

（1）用接种环分别挑取经确认为革兰阴性、无芽孢杆菌的菌落上的菌种接种于乳糖蛋白胨培养基上（编号1—7），于37℃培养24h。

（2）培养24h后，观察产酸产气情况。凡是产酸产气者，即可最终确认为大肠杆菌

群细菌。

（3）根据复发酵实验结果，再计算100ml水样中大肠杆菌MPN。

2、结果与分析：

2.1 初发酵结果：

15支试管全都产酸，但其中两支试管内的杜氏小管内无气泡，实验数据如下，阳性组合为5-5-3，查阅大肠菌群检数表可得每100ml水样中细菌MPN为920。

表1：初发酵实验结果

2.2 平板分离结果

阳性管培养物划线接种培养24 小时后，EMB 培养基中长出深紫色有金属光泽的单菌落，菌落较小，呈圆形，表面和边缘光滑，是典型大肠菌群菌落

2.3镜检结果

从EMB培养基中挑取上述特征的菌进行革兰氏染色，观察得菌体呈粉红色，为革兰氏阴性菌，镜检照片如下：

2.4 复发酵结果：

经过24h培养后，两支试管皆产酸产气，可认定为大肠菌群细菌。

3.结果与讨论

经过一系列的实验表明，该水样中存在大肠菌群。并且，大肠菌群存在的数量已经超出生活饮用水的卫生标准规定，但是由于该水样是过夜的水样，因而，实验数据不具有准确性，但是过夜的自来水样大肠菌群数严重超标，不宜饮用。

心得体会：这次实验验证了自来水中存在大肠菌群及其数量标准。通过对整个实验的把握、计划及实验步骤的实施，可以看出，在实验当中我们还是缺少对整体实验的细致了解和计划。对实验可能出现的结果不能提前预测分析，缺少对问题的深入理解。这次实验同时也体现了许多我们操作上的不规范，不能完全按照无菌接种计术来完成实验，导致误差

变大，和轻微污染。

参考文献：[1]袁丽红、陆利霞、李霜，微生物实验[M]，化学工业出版社，2006.

[2]国家环境保护总局编，中华人民共和国环境保护行业试行标准[S]，中国环境科学出版社，2007.

[3]高瑞坤，汤琳等.水中粪大肠菌群快速检测方法—固定底物酶法与多管发酵

的比较.[J]中国环境检测.2008.24(4).40~41