DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用
分子标记及其在林木遗传育种研究中的应用
分子标记及其在林木遗传育种研究中的应用
分子标记是指基因组中具有多态性的DNA序列，可用于鉴定
个体之间的差异和遗传相关性。
在林木遗传育种研究中，分子标记被广泛应用于以下几个方面：
1. 遗传多样性评估：通过测定林木种群的遗传多样性，可以评估种群内部和种群之间的遗传变异程度。
分子标记技术可以快速、准确地检测和分析遗传多样性，帮助选择最具遗传多样性和潜力的品种或种质资源。
2. 基因型鉴定与鉴别：通过分子标记的特定模式或图谱，可以识别和鉴别不同品系、种属或个体之间的差异和相似性。
这对于林木品种验证、分辨与筛选、品种保护以及识别杂交后代等都具有重要意义。
3. 亲权分析与近缘关系研究：分子标记技术可以用于研究亲缘关系和家系分析，以确定父本与子代之间的亲源关系、评估遗传遗传连锁与分离、确定近交程度等。
这有助于优化育种方案、提高育种效率以及避免不良遗传事件的发生。
4. 分子标记辅助选择：利用分子标记与相关性分析、基因组关联分析等方法，可以筛选与目标性状相关的分子标记，从而辅助选择目标性状的优良个体，加快育种进程，提高育种效率。
5. 基因定位与功能研究：通过比较表现型和分子标记的相关性，可以进行基因定位和功能研究，从而揭示控制性状的座位、作用机制和相关基因等信息。
这有助于深入理解林木性状的形成
机制和遗传基础，为进一步的功能基因组学和遗传改良提供依据。
总之，分子标记在林木遗传育种研究中具有重要的应用价值，可以加快育种进程，提高遗传改良效率，并为林木的良种选育与遗传资源保护提供技术支持。
DNA分子标记在洋葱遗传育种研究中的应用
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分子标记及其在作物育种上的应用
2002年12月韶关学院学报(自然科学版)Dec.2002第23卷 第12期Journal of Shaoguan University(Natural Science)Vol.23 No.12分子标记及其在作物育种上的应用李海渤(韶关学院英东生物工程学院,广东韶关512005)摘要:分子标记是随着遗传学的发展而诞生的一种基于DNA多态性的遗传标记.主要综述了几种分子标记的基本原理及其在作物育种上的应用,实践证明,分子标记技术为作物育种提供了一种新的研究手段,必将在作物育种领域开拓广阔的应用前景.关键词:分子标记;作物育种;DNA多态性中图分类号:Q341 文献标识码:A 文章编号:1007-5348(2002)12-0100-07作物育种的目标之一是改良现有品种、创造新品种,使之更符合人类生产和生活需要.早期的良种选育工作主要是凭感官对当时所需要的性状进行选择,如植株的高矮、籽粒的饱满度、植株的抗性等.经过这种途径,虽然创造了一些具有优良性状的品种,但这种育种方式尚处于感性和经验性阶段,具有一定的盲目性和机遇性.随着遗传学的发展,遗传标记经历了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记等几个阶段.在此过程中,育种家们试图利用遗传标记指导作物育种过程中的亲本选配和后代目标性状的选择,然而由于技术水平的限制,最初的遗传标记对指导育种工作带有局限性,实用性有限.分子标记的出现与发展,为作物育种注入了前所未有的活力,分子标记在作物育种上得到广泛的应用.1 分子标记的类型分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记.其特点是直接以DNA的形式存在;标记数量无限,遍布于整个染色体组;标记位点非常丰富;性状稳定,不受环境条件影响;许多标记是共显性标记,因而从它诞生的一开始就展示了极大的生命力.分子标记可根据不同的研究手段分为如下类型:111 RFL P(Restriction Fragment Length Polymorphism)标记1980年,Bostein提出了RFL P标记方法.其基本原理是由于DNA序列不同,或DNA序列发生插入、缺失、易位等结构变化,从而造成限制性内切酶的酶切位点发生改变,当基因组DNA与限制性内切酶相互作用后,便会产生不同长度的限制性片段,再通过电泳、转膜,然后用放射性标记的同源DNA片段作为探针与其杂交,经放射自显影来检测样品之间的差异.RFL P标记的优点是不受环境条件和发育阶段的影响;无表型效应;在等位基因之间收稿日期:2002-09-11作者简介:李海渤(1973-),男,河北唐山人,韶关学院英东生物工程学院助教,硕士,主要从事作物遗传育种研究.一般表现为共显性;结果稳定、重复性好.缺陷是该技术对DNA 要求量较大;要求纯度较高;运用同位素标记对人体有害;所花费的人力、物力较大.该技术广泛应用于生物的遗传作图、基因定位、种质资源评估、分子标记辅助选择等方面.112 RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA )标记该标记是由Williams 等和Welsh 等在PCR 技术基础上发展起来的一种分子标记[1,2].其原理是采用人工合成的10个碱基的寡聚核苷酸作为随机引物,以基因组DNA 为模板,在94℃左右变性后,在较低温度下分别与DNA 的两条单链发生退火反应,在DNA 聚合酶的作用下对基因组特定的DNA 区域进行反复扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的差异.造成RAPD 谱带差异的原因可能是:核苷酸置换造成引物无法与结合位点匹配;结合位点的缺失;结合位点间大片段的插入造成扩增中断;由于插入或缺失突变使扩增产物大小发生改变.RAPD 技术的优点是自动化程度高;费用低;无放射性污染;信息量较大及简便快速等.其缺陷是不十分稳定;重复性较差;对反应条件比较敏感.该技术现已广泛应用于遗传多样性分析、物种进化、品种鉴定、分类等研究领域.113 SSRs (Simple Sequence Repeats )技术生物体基因组中,普遍存在1～4个碱基组成的简单重复序列,其重复次数可达百次以上,且重复次数变化很大,但在该重复序列两端的序列却是高度保守的.SSRs 技术就是利用其两侧保守序列设计一对引物,再利用PCR 技术对每个位点的微卫星序列进行特异扩增,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物,便可确定该物种扩增片段的多态性[3].该技术的特点是需DNA 量较少;为共显性标记;显示的带型简单、客观明确.现在该技术被广泛应用于遗传图谱的构建、种质资源的鉴定、遗传多样性评估等方面.114 AFL P (Amplified Frangement Length Polymorphism )标记该技术是Vos 等于1992年发明的一种选择性扩增DNA 片段的方法[4],其基本原理是某生物基因组DNA 在两种具有不同酶切位点的限制性内切酶作用下,产生大小不同的酶切片段;再在这些片段的两端接上已知序列的接头,最后再利用根据接头序列设计的特异引物对双酶切片段进行选择性地扩增,最后通过电泳、染色,分析条带差异.AFL P 技术结合了RFL P 和PCR 的优点,具有多态性丰富、稳定性好和重复性高的特点,被广泛地应用于基因定位、基因作图、鉴定亲缘关系等领域.115 STS (Sequence -tagged Sites )标记STS 标记是由一段长为200-500bp 的序列所界定的位点,它在基因组中只出现一次.前述任何单拷贝的多态性标记都可以作为基因组的界标转变为STS 标记,转变的前提是测定长度适合的单拷贝片段两端的序列,并据其设计一对专一扩增的引物(长度为20个核苷酸左右),经PCR 途径显示STS 的特异片断[5].STS 标记的优点在于其共显性的遗传方式,因而很容易在不同组合的遗传图谱间进行转移.2 分子标记在作物育种中的应用・101・第12期李海渤:分子标记及其在作物育种上的应用由于分子标记所表现出的极大的优越性,所以在作物育种中得到广泛的应用,主要表现在以下几个方面:211 亲缘关系与种质资源多样性的研究研究物种的亲缘关系以及种质资源的多样性对作物育种有着重要的指导意义.然而,由于作物易受生长环境及发育阶段的影响,因而仅凭作物的形态学特征来研究其亲缘关系及多样性易受主观因素的影响,结果可靠性较低.分子标记所代表的是基因组DNA 水平上的差异,不受外界环境及作物生长发育阶段的影响,因而利用分子标记研究作物的亲缘关系及多样性,其结果具有客观、稳定的特点.Dires 等采用RFL P 技术对83个甘蓝型油菜品种进行了聚类分析,并将之分为三大类群,即春油菜类群、冬油菜类群及中国—日本油菜类群,该聚类结果与已知系谱大致相符[6];安贤惠通过RAPD 技术,采用31个随机引物分析了72份芥菜型油菜品种的遗传多样性,并将之划分为六大类[7].212 DNA 指纹和种子纯度的鉴定在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记,DNA 指纹就是一些特异DNA 标记的组合.通过DNA 指纹可以进行物种鉴定,不仅克服了根据形态特征鉴定物种的可靠性差的缺点,而且对于品种专利权的申请及保护提供了可靠途径.另外,通过DNA 指纹也可以进行种子纯度的鉴定,这种方法同样克服了根据田间表型性状以及同工酶进行种子纯度鉴定的缺陷,具有快速、准确、简便、成本低的特点,而且在幼苗或种子阶段就可对种子纯度进行鉴定.213 构建分子标记连锁图构建高密度的分子标记连锁图为基因的精细定位、物理图谱的构建和以图谱为基础的基因克隆奠定了条件.利用克隆的基因来转化其他的作物无疑是一种新的育种途径,例如转基因植物.实践证实采用分子标记构建基因连锁图具有很高的实用价值.Cheung 等用RFL P 技术构建了包括343个RFL P 标记的芥菜型油菜的遗传图谱,为辅助选择育种提供了重要的理论参考[8].美国的Cornell 实验室发表了一张水稻的分子标记连锁图,该图谱中有700多个标记,其中绝大部分是RFL P 标记[9].在玉米中已建立了数百个RFL P 标记图谱,而在西红柿中则建立了带有1000个RFL P 标记遗传图谱[9].214 基因定位和数量性状的选择利用不同的分离群体如F2群体、回交群体、DH 群体、重组自交系等可对目的基因进行定位.Jean 等找到了与Pol cms 恢复基因Rfp1紧密连锁的1个RAPD 标记和10个RFL P 标记[10].1998年,他们又用RFL P 标记和RAPD 标记将Pol cms 恢复基因Rf p1定位[11].王俊霞等在860个随机引物中找到了与Pol cms 恢复基因Rf p 连锁的两个RAPD 标记[12].另外,作物的许多经济形状是由数量性状位点(Q TL )所控制的,如产量、品质、水平抗性等.由于这些数量性状的遗传差异是由多个基因座位决定的,每个座位只对表型起较小的作用,由于遗传和环境的互作无法区别单个基因座位的贡献和各个基因座位之间的互作,因而无法对单个Q TL 进行操作.分子标记的产生和发展可把控制数量性状・201・韶关学院学报(自然科学版)2002年的单个Q TL 区分开来,为Q TL 的定位、克隆和选择提供了有力的工具.例如Toroser 等采用RFL P 标记,对甘蓝型油菜硫苷含量控制基因进行了定位,结果将两个主要控制位点GSL -1和GSL -2分别定位于L G20和L G1,三个次要控制位点GSL -3、GSL -4和GSL -5分别定于L G18、L G4和L G13[13].Tanhuanpaa 等采用RAPD 技术对油菜的亚麻酸含量控制基因进行了定位[14].215 利用分子标记进行辅助选择利用分子标记辅助育种可以方便、快速的实现品种之间的目的基因的转移,或将近缘野生种的新基因导入,给传统的育种带来了巨大的活力.利用分子标记辅助选择有以下优点:1)不受时间和环境条件的限制,在作物不同的发育阶段均可进行检测,而性状的传统鉴定方法则需要在某一特定发育阶段进行;2)利用分子标记可以实现优良基因的快速聚合,弥补了传统育种方法的费时、费力以及盲目性高的缺点.作物育种程序中对分子标记辅助选择的要求:1)分子标记与目的性状位点共分离或紧密连锁(1cM 或更小),否则会因标记与目的基因之间的交换而使检测过程中的假阳性频率变得很高;2)分子标记能对大群体进行有效检测,目前基于PCR 的分子标记技术较为容易;3)检测技术在实验室之间应该有很高的重复性,并且较为经济.在实践中,育种工作者采用分子标记辅助选择的途径培育出了一批优良品种.薛庆中等应用与Xa21紧密连锁(遗传距离仅为011cM )的分子标记,通过辅助选择培育出了一批具有Xa21基因的抗白叶枯病恢复系[15].Sheng 等利用分子标记辅助选择的方法将Xa21导入明恢63中,建立了基于分子标记辅助选择的PCR 反应体系,其中两个标记距离Xa21分别为018cM 和310cM.用均匀分布于水稻12条染色体的128个RFL P 标记进行背景选择,证明改良性明恢63除了含Xa21的318cM 片段外与原始材料完全一样[16].Huang 等利用DNA 标记辅助选择将Xa4、Xa5、Xa13、Xa21等4个水稻抗白叶枯病基因进行了聚合,聚合系表现出比单基因系更广的抗谱和更强的抗性[17].216 杂种优势的预测杂种优势利用是品种改良的一条重要途径.育种家们为了更好地利用杂种优势,对于预测杂种优势的方法和途径进行了多年的研究,其中,以玉米和水稻为对象的研究较为广泛和深入.关于杂种优势的预测,人们曾通过生理生化、形态解剖、地理距离等途径进行探索,结果都不理想.80年代末,分子标记开始运用于杂种优势预测的研究.Lee 用33个RFL P 探针检测了8个玉米自交系及其28个杂交组合,结果认为RFL P 的遗传距离与F1产量呈显著正相关[18].Smith 用分布于整个玉米基因组的257个RFL P 探针检测了37个玉米自交系及其123个杂交组合,结果表明,亲本的RFL P 遗传距离与F 1产量和杂种优势相关达极显著水平[19].Stuber ,Melchinger 等均采用RFL P 标记方法发现RFL P 遗传距离与F1杂种优势表现存在高度的相关性[20].但也有与上述研究不一致的结果,如Melchinger 等研究发现亲本间RFL P 遗传距离与杂种F 1产量相关性很低,不能用于杂种优势的预测[21].Dudley 等用52个RFL P 标记和14个同工酶标记研究了14个玉米自交系・301・第12期李海渤:分子标记及其在作物育种上的应用与其F 1产量的关系,同样发现遗传距离与产量并无相关性[22].Melchinger 等认为,造成这两种不同结论的原因是亲本来源的不同,当亲本来自于相同的杂种优势群时,亲本间RFL P 遗传距离和F 1表现的关系呈显著相关,当亲本来自于不同的杂种优势群时,这种相关性较低[20].吴敏生等采用RAPD 标记对玉米杂种产量进行了预测研究,发现RAPD 遗传距离与杂种产量相关显著,但决定系数很小,表明遗传距离在决定杂种产量方面只占很小的比例,遗传距离大的F 1产量不一定高,遗传距离小的F 1产量不一定低[23].彭泽斌等用RAPD 方法研究了15个6类玉米自交系间的RAPD 遗传距离与其杂交组合F 1产量、特殊配合力、中亲杂种优势值的关系,认为RAPD 遗传距离与组合产量、中亲优势值、双亲特殊配合力存在极显著的正相关,说明用RAPD 遗传距离在杂交组合选配中有一定的参考价值[24].实践证实,关于利用不同分子标记预测杂种优势准确性及其机理有待于进一步研究.3 结语和展望分子标记是随着遗传学的发展而诞生的,在作物育种方面应用虽然仅有十几年时间,却显示了巨大的生命力,成为作物育种的重要途径之一.分子标记的发展和应用不仅促进了作物育种的发展而且对一些经典概念的再认识,提出了一些新的观点.如Huang 等提出质量性状基因和Q TL 可能仅是同一座位的不同等位基因[17].目前分子标记在育种上的应用还有一定的局限性,主要包括以下几个方面:1)开发的分子标记数量较少,很难找到与目标基因紧密连锁的分子标记,需要构建更为精密饱和的遗传图谱;2)分子标记技术本身的局限性造成检测结果的偏差;3)众多的农艺性状是受多基因控制的,而分子标记对数量基因的精确定位还有较大差距;4)有待于建立自动化的实验程序,实现对大群体快速、准确的鉴别;5)分子标记与表型之间的关系有待于进一步研究.分子标记是一种新的技术,它的技术体系并不全面,不能脱离传统的育种技术而单独使用,必须要与传统的育种技术有机结合,分子标记的检测结果和效应最终要到大田中验证.另外,分子标记技术的成本较高,限制了它的广泛应用.随着分子生物学理论与技术的发展,我们相信科学家们必将不断开发出分析速度快、成本低、信息量更大的分子标记.分子标记技术必将在作物育种方面得到更加广泛的应用.参考文献:[1]williams J G ,Kubelik A R ,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic makers[J ].Nucl Acid Res ,1990,18:6531-6535.[2]Welsh J.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J ].Nucl Acid Res ,1990,18:7213-7218.[3]Weber J L.Human DNA polymorphisms based on length variations in simple -sequence tandem repeats [A ].K E Davis ,S M Tilghman (eds ).G enome analysis[C ].New york :Cold S pring Harbor Laboratory Press ,1990.159-181.・401・韶关学院学报(自然科学版)2002年[4]Vos P ,Hogers R ,Beleaker M.AFL P :a new technique for DNA fingerprinting[J ].Nucl Acid Res 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DNA分子标记在甘薯遗传育种中的应用
１ 在 甘 薯起 源 、 化 与 分 类 中 的 应 用 进
甘薯 的起 源 有 美 洲 说 、 洲 说 和非 洲 说 三 种 。 亚
在遗 传 育种 中 ， 用植 物 遗 传 学原 理 进 行植 物 利 品种 改 良已取得 显著 进展 。经典 遗传 学 中通常 将可 识别 的等位基 因称 为遗 传 标 记 ， 类 型 主要 包 括 形 其 态标记、 细胞 学标 记 和同工 酶标 记 ， 而这 些标 记数 然 量有 限 ， 难对它们 的基 因组 进行 详细 的遗 传研 究 ， 很 对 于复合 基 因 控 制 的数 量 性 状 研 究 也 受 到 很 大 限 制 。２ 世 纪 ８ 代 中期 ， 着分 子生 物 学 的发 展 ， ０ ０年 随 产生 了多种 基 于 Ｄ Ａ多 态 性 的 分 子标 记技 术 。 由 Ｎ 于 Ｄ Ａ分子标 记 技 术 具 有 不 受 季 节 、 境 限 制 ， Ｎ 环 多
Ａｐ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｐ ｉ ｔｏ ｆ ＤＮＡ ｏ ｅ ｕ ａ ａ ｋ ｒ ｎ Ｓ ｅ ｐｏ ａ ｏ Ｂｒ ｅ ｉ ｇ ｃ Ｍ ｌｃ ｌ ｒ Ｍ ｒ ｅ ｓ ｉ ｗｅ ｔ ｔ ｔ ｅ ｄ ｎ
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(完整版)分子标记辅助选择育种
分子标记辅助选择育种传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypieal selection) 。
环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。
例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。
一个优良品种的培育往往需花费7〜8年甚至十几年时间。
如何提高选择效率，是育种工作的关键。
育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。
遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。
棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。
以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。
生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。
它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。
但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。
以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择（molecular marker-as —sisted selection , MAS育种更受到人们的重视。
第一节分子标记的类型和作用原理一、分子标记的类型和特点按技术特性，分子标记可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction ，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。
分子标记技术及其在棉花遗传育种中的应用
一
２ ３ ９ —
摩 业 础 挝她
苷 酸 多态 性
２ ０ １ ５ ． ４ 经 济作 物
摘要 ： 介 绍 了几种 分 子标 记 及 原理 ， 综 述 了其 在棉 花遗 传 图谱 的构 建 、 遗传 多样 性 的鉴 定 、 ＱＴ Ｌ ｓ 的 定位 、 标记 辅 助 育种 、 亲缘 关 系 的鉴 定及 种 子 纯度 的检 测 方 面的应 用情 况 ， 为棉 花 育种等 相 关研 究
提 供 了理论 依据 和技 术指 导 。
生及 产量 的 影 响 ［ Ｊ ］ ． 江西 农 业 学 报 ， ２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ５ ） ： ６ ４ — ６ ５ ．
『 ｌ Ｏ ］ 葛洪滨 ， 刘宗 发 ， 马众 文 ， 等． 不 同 杀 菌 剂 对 连 作 花 生 叶 斑 病
的 防 治效 果及 产 量 影 响 ［ Ｊ ］ ． 花 生学报 ， ２ ０ １ ４ ， ４ ３ （ １ ） ： ５ ２ — ５ ５ ． ［ １ １ 】 王苏影 ， 刘宗 发 ， 马众文 ， 等． 配施 硼肥 ・ 钼 肥 对 花 生 产 量 的
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分子标记在水稻遗传育种中的应用
Ｃ 花 大量 人 力物 力 ．以及 物种 对 染 色体 结 构 和数 目变 根 据所 用 引物 的特点 可分 为 随机 引物 Ｐ Ｒ标 记 和特 异 的耐 受 性 和标 记 常伴 有对 生 物有 害 的 表 型效 应 等 异 引物 Ｐ Ｒ标 记 。随机 引物 Ｐ Ｒ标 记应 用 最广 泛 的 Ｃ Ｃ
． Ｃ 系． 已成功 地 将许 多 质量 性 状 基 因定 位 于染 色体 上 ， ２４２２ 基 于 Ｐ Ｒ的分 子 标 记技 术 ．． Ｐ Ｒ技 术 问世 Ｃ 并建 立 了相应 的连 锁群 。细胞 学标 记 克 服 了形 态 标 不 久 便 以其 简便 、快 速 和高 效等 优 点迅 速 成 为第 二 记 易受 环 境影 响 的 缺点 ，但 标 记 材料 的 培养 获 得 需 代 分 子标 记 技术 的核 心技 术 。在 此之 上 的分 子标 记
．． 育 期 等 因素 的影 响 ．使形 态 标记 在 植 物育 种 中的应 ２４２ 分 子 标 记 技 术 的 种 类
用 受 到一些 限 制
２２ 细 胞 学 标 记 ．
２４ ． 基 于 Ｄ Ａ Ｄ Ａ杂 交 的分 子 标 记 技 术 ．． １ ２ Ｎ — Ｎ
该
技术 是 利 用 限制 性 内切 酶酶 解 及凝 胶 电泳 技 术 分 离
２ １ 形 态 学 标 记 ．
映遗 传 多态 性 。 因此蛋 白质标 记 是一 种 较好 的遗 传
标记 ， 已被 广泛 应 用 于 物 种 起 源 、 化 研 究 、 质 鉴 进 种
形 态学 标 记是 指 那些 能 够 明显 显 示遗 传 多 态 性 定 及 分类 和抗病 性 筛选 等 领 域 。但这 种 标 记仍 有 诸
雄 花 序性 状 、 雄穗 分 枝 多少 等 特征 去杂 。对杂 种 苗 、 关 ．严 防人 为 混 杂 ．对每 一个 亲 本种 子 生产 工 序 都 混杂 苗 、 疑苗 等 非典 型苗 都 要及 时 拔 除掉 ， 吐 丝 必 须 分 别 进 行 ．各 种 机 械 和 各 个 场 地 都 要 清 扫 干 怀 在 散粉 以前完 成彻 底 的去杂 去劣工 作 。 净 ，以 防机械 混杂 。
DNA分子标记技术及其在玉米育种中的应用
期的 Ｓ ＮＰ等． 在玉 米 的遗 传 育 种 方 面 ， 分子 标 记 技
术 主要用 于遗传 图谱 的构 建 、 遗传 多样性分 析 、 目标
基 因 的标 记及 基 因定 位 、 杂种 纯度及 真伪 的鉴定 、 杂 种 优势 及产量 的 预 测 、 子 标 记辅 助 选 择 育种 等 方 分
实践． 随着分 子 生物 学 的迅 速 发 展 ， 建立 在 Ｄ ＮＡ 变 异基 础上 的分子 标 记技 术在 玉பைடு நூலகம் 育种 中 已得 到了广 泛 的应 用． 现在 涉及 到 的分 子 标 记 的类 型 主要 包 括
ＲＦ Ｐ Ａ Ｌ 、 ＡＰ Ｓ Ｒ 以及 正 在 处 于 高速 发展 Ｌ 、 Ｆ Ｐ Ｒ Ｄ、 Ｓ
ｔ ｅ ｐ ｅ ｅ ｔ ｓｔ ａ ｉ ｎ ｆ ｍ ｏ ｅ ｕ ａ ａ ｋ ｒ ｎ ｒ ｌｖ ｎ ｔ ｄ ｎ ｐ ｌ ａ ｉ ｎ ｉ ｉｅ ｂ ｅ ｄ ｎ ｎ ｐ ｓ ｈ ｒ ｓ ｎ ｉｕ ｔ ｓ ｏ ｌ ｃ ｌ ｒ ｍ ｒ ｅ ｓ ｉ ｅ ｅ ａ ｔ ｓ ｕ ｙ ａ ｄ ａ ｐ ｉ ｔ ｎ ｍａ ｚ ｒ ｅ ｉ ｇ ｉ ａ ｔ ｏ ｃ ｏ ｙ ａ ｓ ｓ ｃ ｓ ｔ ｅ ｃ ｎ ｔ ｕ ｔ ｎ ｏ ｅ ｅ ｉ ｐ ｃ ｒ ｍ ｎ ｅ ｅ ｌ ｃ ｔ ｇ， ｎ ｌ ｓｓ ｏ ｅ ｅ ｉ ｉ ｅ ｓ ｔ ｔ ｅ ｄ — ｅ ｒ ， ｕ ｈ ａ ｈ ｏ ｓ ｒ ｃ ｉ ｆｇ ｎ ｔ ｓ ｅ ｔ ｕ ａ ｄ ｇ ｎ ｏ ａ ｉ ａ ａ ｙ ｉ ｆｇ ｎ ｔ ｄ ｖ ｒ ｉ ｏ ｃ ｎ ｃ ｙ， ｈ ｅ ｔ ｃ ｉｎ ｏ ｈ ｙ ｒ ｄ ｐ ｒｔ ｎ ｔ ｕ ｈ ｎ ｉｉｙ ｐ ｅ ｉａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｅ ｏ ｉ ， ｎ ｅ ｅ ｔｏ ｒ ｅ ｉ ｇ ａ ｓｓ ｅ ｙ ｅ ｔ ｆ ｅ ｈ ｂ ｅ ｕ ｉｙ ａ ｄ ｉｓ ａ ｔ ｅ ｔｃｔ ， ｒ ｄ ｃ ｔ ｆｈ ｔ ｒ ｓｓ ａ ｄ ｓ ｌ ｃ ｉ ｎ ｂ ｅ ｄ ｎ ｓ ｉｔ ｄ ｂ ｏ ｔ ｏ
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收稿日期:2005-01-12基金项目:山东省自然科学基金(Y002D01)和山东农业大学博士基金资助课题。
作者简介:石运庆(1976-),男,硕士,主要从事作物遗传育种研究。
*作者为通讯作者。
文章编号:1002-4026(2005)02-0022-08*综述*DNA 分子标记及其在作物遗传育种中的应用石运庆,牟秋焕,李 鹏,刘保申*(山东农业大学农学院,山东泰安271018)摘要:本文总结了三类DNA 分子标记:(1)以Southern 杂交为基础的分子标记;(2)以PCR 为基础的分子标记;(3)以串连重复的DNA 序列为基础的分子标记。
综述了这几类分子标记在作物品种鉴定与绘制指纹图谱,基因定位与辅助选择育种,杂种优势群的划分与杂种优势的预测和细胞学研究等方面中的应用现状。
关键词:作物;DNA 分子标记中图分类号: S503.2 文献标识码:A伴随着遗传学的发展,遗传标记(genetic marker)经历了形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA 分子标记四个阶段,其中DNA 分子标记诞生于上世纪80年代中期,与其他遗传标记相比,它具有如下优点:(1)直接以DNA 的形式表现,在生物各个组织,各个发育时期都可检测到,不受季节、环境限制;(2)数量极多,遍及整个基因组;(3)多态性高,并且自然存在许多的等位变异,不需专门创造特殊的变异材料;(4)表现/中性0,即不影响目标性状的表达,与不良性状也没有必然的连锁;(5)许多分子标记表现为共显性(codomainance),能够鉴别纯合基因型与杂合基因型,提供完整遗传信息。
分子标记的这些优点,在作物遗传育种的研究与应用中得到了广泛的体现。
1 DNA 分子标记随着分子生物学的发展,相继出现了多种DNA 分子标记。
这些种标记大多以电泳谱带的形式表现,根据它们所用的技术不同,大致分为以Southern 杂交技术为基础的分子标记和以PCR 技术为基础的分子标记。
另外,由于其中有些DNA 标记和重复序列密切相关,所以就把它们单独列为一类,以突出其独特性。
1.1 以Southern 杂交为基础的分子标记限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)是Grodzicker 在1974年提出的。
其基本原理是由于酶识别序列内的点突变或部分DNA 片段的缺失、插入、倒位和易位而引起酶切位点的缺失或获得,导致限制性位点改变,再利用限制性内切酶切割DNA 时,就产生了大量的多态性片段。
基本操作步骤:DNA 的纯化、酶切、凝胶电泳分离DNA 片段、转膜、利用放射性同位素标记的DNA 探针进行Southern 杂交并放射自显影和结果分析。
RFLP 标记具有共显性特点,可以区别纯合基因型与杂合基因型,能够提供单个位点上较完整的资料。
结果稳定可靠、重复性好,特别适合于连锁图谱的建立,如小麦的RFLP 连锁图揭示了在小麦进化过程中,有多条染色体发生过易位[1],如7B S 上一个片段和5AL 上一个片段易位到4A 上,4AL 片段易位到5A 上,而第18卷 第2期2005年6月山东科学S HANDONG SCIENCE Vol 118 No 12Jun 120055AL 末端一个片段易位到7B S 上,6BS 末端易位到2BS 末端。
以前人们通过小麦非整倍体等研究表明,小麦A 、B 、D 三基因组的功能有相同之处,可以相互补偿。
现代RFLP 连锁图则进一步证明,这三个基因组之间基因数目以及基因在染色体上的排列位置都非常一致。
但是由于RFLP 标记对DNA 需要量较大(5~10L g ),所需仪器设备较多,检测步骤多,技术较复杂,周期长,成本高,还需要同位素标记,所以其应用受到了一定程度的限制。
1.2 以PCR 为基础的分子标记1.2.1 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)RAPD 是1990年Willia ms 和Welsh 发明的一种较为简便的检测DNA 多态性的技术。
它以一个随机的寡核苷酸序列(通常为10个碱基)作引物,通过PC R 对基因组DNA 进行随机扩增,产生大小不同的DNA 片段,再经凝胶电泳分开,进行多态性观察。
RAPD 图谱间的差异可因4种方式产生:¹核苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配;º某个引物结合位点缺失;»两引物结合位点间的大片段插入导致间距过大而扩增中断;¼插入或删除改变了扩增产物的大小。
与RFLP 相比,RAPD 方法简便,快速,灵敏度高,DNA 用量少,且不需要同位素标记,安全性好。
RAPD 结果可以提供足够的多态性以分辨种以下的类型[2]。
Nguyen 等[3]利用40个RAPD 引物对15个小麦品种遗传多样性进行了分析。
海林等[4]利用RAPD 标记分析了小麦耐盐种质的遗传多样性,共产生200条扩增片段,多态性片段数为172条,扩增片段的多态性百分率为86%,供试的24份材料相似系数在0.21~0.97之间。
但是RAPD 技术因使用的引物比较短,对反应条件极为敏感,稍有改变便影响扩增产物的重现,重复性较差,稳定性不好。
另外,RAPD 是显性标记,不能区分杂合型和纯合型,无法直接用于基因型分析。
这些不足在一定程度上也限制了它的应用。
1.2.2 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)它的原理是基因组DNA 双酶切,经PCR 扩增后的限制性片段进行选择。
其基本步骤为:先用两种限制性内切酶(一种为6碱基内切酶,如EcoR Ñ,Pst Ñ等,另一种为4碱基内切酶,如Msel)对DNA 进行酶切,然后在酶切片段上连上一个接头(adapter),根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物,进行特异PC R 扩增,扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。
AFLP 结合了RFLP 和RAPD 的优点,稳定可靠,重复性好,方便快速,只需极少量的DNA 样品,不需要Southern 杂交,不需要预先知道DNA 的序列信息,而且绝大部分为显性标记,显示的多态性信息量也很高。
因而,非常适合于品种指纹图谱的绘制,遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。
Barrett 等[5]利用AFLP 技术评价适应于西北太平洋旱地生产的春、冬小麦代表品种的遗传多样性,结果表明AFLP 对小麦遗传多样性的研究来说是一种很有效的技术。
美国康耐尔大学的Blair 利用AFLP 技术评价54份水稻品种的遗传多样性,研究其系统发育和分类,并与同工酶生化标记及RFLP 标记比较,发现其结论一致,而且认为AFLP 对于研究水稻品种的遗传变异和构建基因图谱更为理想。
但这种方法需经多步操作,并且费用较高。
1.2.3 序列标志位点(Sequence -tagged sites,STS)STS 技术是一种将RFLP 标记转化为PCR 标记的方法。
它通过RFLP 标记或探针进行DNA 序列分析,然后设计出长度为20个碱基左右的引物,对基因组DNA 进行PCR 扩增寻找多态性。
它的扩增产物是一段长几百bp 的特异序列,此序列在基因组中往往只出现一次,因此能够界定基因组的特异位点。
STS 标记的信息量大,多态性好,是共显性标记,能够鉴定不同的基因型。
张泽民等[6]利用RG 227的RFLP 标记转化的STS 标记对水稻F 1花粉不育基因座位S -c 进行了精细定位,认为RG 227STS 与S -c 紧密连锁,遗传距离为0.3cM,为S -c 座位的图位克隆提供了更加准确和简便的检测手段。
陈松柏等[7]利用STS 标23第2期石运庆,等:DNA 分子标记及其在作物遗传育种中的应用24山东科学2005年记对小麦抗白粉病基因Pm4进行了定位,发现STS410与抗病基因Pm4紧密连锁,并认为STS410可用于小麦抗白粉病基因Pm4的分子标记辅助选择。
目前,STS标记也已经应用在了人类基因组物理图谱作图中。
开发STS标记需要测序,所需费用较高,但是一旦开发了适宜的引物,应用价值很大。
1.2.4序列特异性扩增区域(Sequence Charac terized Amplified Re gions,SC AR)SCAR是在RAPD技术上发展起来的。
其方法是将目标RAPD标记克隆并进行末端测序,根据原RAPD 片段两端的序列设计特定引物(通常为24个碱基),对基因组DNA再进行PCR扩增分析。
SCAR标记是共显性遗传,与RAPD标记相比有更好的稳定性,更高的可重复性。
刘志勇等[8]利用SCAR 标记对小麦抗白粉病基因Pm21进行了分子鉴定和标记辅助选择的研究,并认为SCAR标记是稳定、准确、可靠的DNA分子标记,可以用于标记辅助选择。
邹继军等[9]利用RAPD标记转化成的SC AR标记SCS3620&580对62份大豆灰斑病抗感种质资源进行了研究,检测结果与RAPD标记检测结果一致,并认为SC AR标记兼具RFLP和RAPD的优点,在大豆灰斑病抗病育种中具有广泛的应用价值。
1.2.5酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences,C APS)CAPS技术又称为PCR-RFLP。
所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。
其基本步骤是:先进行PC R扩增,PC R扩增产物用限制性内切酶酶切,电泳分析多态性。
与RFLP技术一样,C APS技术检测的多态性是酶切片段大小的差异。
在此基础上又发展出了dCAPS(derived C APS)技术,它是检测单核甘酸多态性的一种良好方法。
钱前等[10]利用CAPS分子标记对水稻脆性突变体基因fp1做了进一步定位,发现C524a与fp1遗传距离为0.4cM。
刘道峰等[11]利用C APS标记对水稻类病变突变体lmi进行了基因定位,发现lmi基因与标记C4135-10共分离,为克隆lmi基因奠定了基础。
1.3以串联重复的DNA序列为基础的分子标记1.3.1简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSRs)SSRs简单序列重复,亦称微卫星DNA(microsatellite DNA)是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记,它是一类短的串连重复序列基序(1~6个核苷酸)组成的简单重复序列,均匀的分布在整个真核生物基因组中,两边有保守的DNA序列。
SSRs标记的等位基因变异来源于基因组DNA复制时的滑动引起的重复序列数目的变化,而不是单个碱基的突变、插入或缺失造成的,因而表现出高度的多态性。
SSRs是一种较理想的分子标记,它具有以下一些优点:¹多数为共显性遗传,可以检测纯合基因型和杂合基因型;º变异丰富,多态性高;»随机均匀地分布在整个基因组中;¼快速,可通过PCR迅速测定分析;½所需DNA量少,且对其质量要求不高,即使是部分降解的DNA样品也可以进行分析;¾技术难度低,实验成本较低;¿很多引物序列公开发表易在各实验室广为传播使用等特点。