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过氧化氢酶（ CAT ）活性的测定：紫外吸收法

一、目的与要求

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗

寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

二、原理

过氧化氢酶（ catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据 H2O2的消耗量或 O2的生成量测定该酶活力大小。过氧化氢在 240nm

波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（ A 240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。三、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦或其它叶片

（二）仪器设备： 1. 研钵； 2.紫外分光光度计； 3. 离心机； 4. 恒温水浴；

5.容量瓶。

（三）试剂：

1. 0.2 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（ pH7.8: 0.2mol/L Na 2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L

NaH2P04 8.5 ml ）；

2． 0.1 mol/LH

2 O (30%的 H O 溶液 5.68ml 稀释至 1000ml) 2 2 2

二、实验步骤：

1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～ 3ml 4℃下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入 25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置 5℃冰箱中静置 10min ，取上清液在 4000r/min 下离心 15min，上清液即为过氧化氢粗提液， 5℃下保存备用。

2、测定 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管， 1 支为空白管，按表 1-1 顺序加入试剂。

25℃预热后，逐管加入 0.6ml0.1mol/l 的 H2O2,每加完 1 管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中， 260nm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全部测完后，按式（ 1-1）计算酶活性。

表 1-1 紫外吸收法测 H 2 O 2 样品测定液配制表

管号

S1 S2 S0 空白

粗酶液 （ ml ）

0.4 0.4 0.4( 失活酶液 ) 0.4 （磷酸缓冲液）

PH7.8 磷酸缓冲液（ ml ）

3.0 3.0 3.0 3.0 蒸馏水（ ml ）

2.0

2.0

2.0

2.0

3、结果计算 以 1min 内 A240 减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（ μ）。

过氧化氢酶活性（ μ.g -1 min -1

）= A 240 t /(0.1*V l

*t*FW) （

）

*V 1-1

式中A 240 01 2

： As -(As +As )/2;

As 0 ：加入失活酶液的对照管吸光值；

1，As 2 ： 样品管吸光值；

As

V t ：粗酶提取液总体积（ ml ）；

V l ：测定用粗酶提取液体积（ ml ）； FW ： 样品鲜重（ g ）；

0.1 ： A 240 每下降 0.1 为 1 个酶活单位（ μ）； t ： 过氧化氢到最后一次读数时间（ min ）