cdna文库的构建
634901 SMART cDNA 文库构建实验流程(clontech)
操作一览(PT3000-2)本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。
A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：1–3 μl RNA 样本(对照反应，使用1 μl 的对照RNA)1 μl SMART™ IV Oligonucleotide1 μl CDS III/3' PCR Primer如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。
2. 混匀试剂并瞬时离心。
3. 72°C孵育2 min。
冰上冷却2 min。
4. 瞬时短暂离心。
5. 向每管反应中加入以下试剂：2.0 μl 5X First-Strand Buffer1.0 μl DTT (20 mM)1.0 μl dNTP Mix (10 mM)1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase10.0 μl 总体积6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。
7. 42°C孵育1 hr。
之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。
8.引物延伸合成ds cDNA分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。
B. LD PCR扩增合成cDNA1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)80 μl Deionized H2O10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer2 μl 50X dNTP Mix2 μl5' PCR Primer2 μl CDS III/3' PCR Primer2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix100 μl总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。
cdna基因文库名词解释 概述及应用场景
cdna基因文库名词解释概述及应用场景1. 引言1.1 概述CDNA基因文库是指利用互补式DNA（complementary DNA）技术构建而成的一类基因文库，其中包含了特定细胞或组织内所表达的mRNA分子的DNA 复制品。
通过将mRNA转录为cDNA，并将其插入到合适的质粒载体中，科学家们可以获取到特定时期或特定条件下细胞中所表达的全部转录本信息。
CDNA基因文库构建技术是基于反转录酶作用原理而来，通过选取合适的引物和核苷酸，在体外将mRNA逆转录合成相应的cDNA。
这些cDNA分子可进一步克隆到质粒载体中，并在宿主细胞内扩增。
最终形成一个包含大量不同cDNA 片段的基因文库，可供后续研究使用。
1.2 文章结构本文首先会对CDNA基因文库进行详细的名词解释，包括其定义、合成过程及特点以及构建方法与步骤。
接着，将进一步讨论CDNA基因文库在不同领域中的应用场景，尤其是在基因表达研究、蛋白质研究以及新药研发方面的应用。
最后，我们将总结已有的研究成果，并展望CDNA基因文库在未来的发展前景和应用潜力。
1.3 目的本文的目的是为读者提供关于CDNA基因文库的详细解释和应用场景的介绍。
通过阅读本文，读者将更全面地了解CDNA基因文库的概念、构建过程以及其在科学研究中的重要性和广泛应用。
同时，本文也旨在展示CDNA基因文库在基因表达、蛋白质研究以及新药研发等领域所起到的关键作用，为读者理解该技术在科学研究中所扮演的角色提供深入了解。
最后，通过总结已有研究成果并展望未来发展前景，让读者对CDNA基因文库技术有一个更加清晰的认识，并认识到其仍然具有巨大的发展潜力。
2. CDNA基因文库名词解释2.1 CDNA基因文库的定义CDNA基因文库，即亦称为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）文库，是一种由转录反应合成的DNA序列集合，其中包含了从细胞中提取的mRNA分子逆转录合成的互补DNA。
基因组文库和cDNA文库的比较
基因组文库和cDNA文库的比较首先，让我们了解一下基因组文库和cDNA文库的定义和构建方法。
1.基因组文库：基因组文库是整个基因组的DNA序列的集合，包含了一个生物体的全部遗传信息。
构建基因组文库的过程中，需要将整个基因组的DNA分解成小片段，并将其插入一个合适的DNA载体（如噬菌体、质粒或染色体）。
随后，DNA片段和载体将被放入宿主细胞（如大肠杆菌），产生许多基因组文库的克隆。
这些克隆可用于后续的DNA测序、定位和功能研究等。
-包含了一个生物体的全基因组DNA序列，不仅包括编码蛋白质的外显子，也包含调控序列、非编码RNA等。
-克隆数目较大，能覆盖整个基因组的序列。
-信息量大，能提供全面的基因组遗传信息。
-由于涵盖了大量非编码序列，分析起来比较复杂。
2.cDNA文库：cDNA文库是由转录mRNA后得到的互补DNA（cDNA）构建而成的。
转录是由DNA模板合成RNA的过程，其中mRNA是转录出的可翻译成蛋白质的分子。
cDNA文库的构建过程中，需要在转录过程中加入反转录酶，用于合成cDNA。
此后，cDNA片段会被插入到DNA载体中，并转化到宿主细胞中。
cDNA文库可用于研究特定时期或类型细胞的基因表达情况，并逆推分析源自该时期或类型细胞的mRNA信息。
同样，cDNA文库可用于DNA 测序、蛋白质表达等研究。
cDNA文库的主要特点：-反映了特定时期或类型细胞的基因表达情况。
-由于只含有编码蛋白质的序列，分析起来相对简单。
-cDNA文库总体克隆数较少，故无法覆盖全基因组的信息。
-最初的RNA模板需经过反转录，过程中可能有一定的误差和损失。
接下来我们对比基因组文库和cDNA文库的优缺点和应用：1.优点：-信息量大，提供更全面的基因组遗传信息。
-适用于定位基因和研究调控序列、非编码RNA等。
cDNA文库：-分析相对简单，只包含编码蛋白质的序列。
-反映特定细胞或时期的基因表达情况。
2.缺点：-复杂性高，涵盖了大量的非编码序列。
cDNA文库构建技术手册
目录1 材料与方法 (1)1.1 植物材料以及菌株的保存与培养 (1)1.2 Trizol法提取Total RNA (1)1.3 Oligo（dT）磁珠纯化mRNA (1)1.4 三框cDNA的合成 (2)1.5 cDNA均一化与小片段去除 (4)1.6 双链cDNA与pGADT7（lineared）同源重组 (6)1.7 质粒转化大肠杆菌 (7)1.8 文库鉴定 (7)1.9 文库质粒大抽 (8)2 结果与分析 (9)2.1 RNA质量较好无降解 (9)2.2 ds cDNA合成 (10)2.3 ds cDNA均一化与去除小片段 (11)2.4 克隆计数 (11)2.5 文库质量鉴定 (12)附录 (14)1．材料与方法1.1 植物材料以及菌株的保存与培养1.1.1 植物材料的保存盐穗木由客户提供，存放于-80℃超低温冰箱。
1.1.2 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
1.2 Trizol法提取Total RNA1）研钵研棒药勺用液氮预冷，样品在液氮中研磨成粉末状，转移到离心管中；2）按50-100 mg/ml trizol加入trizol，充分振荡混匀。
室温静置5 min，使其充分裂解；3）按200 μl/ml trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置10 min；4）4℃ 12000 rpm离心15 min，吸取上层水相至一新的离心管中，按500 μl/ml trizol加入异丙醇混匀，-20℃放置10 min；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，此时RNA沉淀于管底；6）按1 ml/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
4℃ 8000 g 离心5 min，尽量弃去上清；7）重复步骤6一次；8）室温晾干或真空干燥5-10 min，用29 μl RNase-free ddH2O和1 μl的RNase inhibitor 溶解RNA样品；9）分别吸取2 μl进行电泳检测与浓度测定。
基因组文库与cdna二课的区别
基因组文库与cdna二课的区别基因组文库与cDNA文库是两种常用的DNA文库构建方法，在基因组学和转录组学研究中扮演着重要的角色。
本文将从构建方法、应用领域和优缺点三个方面对两者进行比较。
一、构建方法1. 基因组文库构建方法：基因组文库是由整个基因组DNA片段组成的文库。
构建基因组文库的关键步骤包括DNA提取、DNA片段切割、连接到载体、转化到宿主细胞等。
其中，DNA片段切割通常使用限制性内切酶，将基因组DNA切割成特定大小的片段，然后将片段连接到载体上，最后转化到宿主细胞中。
2. cDNA文库构建方法：cDNA文库是由转录本（mRNA）反转录合成的互补DNA（cDNA）片段组成的文库。
构建cDNA文库的关键步骤包括RNA提取、反转录、合成第一链、合成第二链、连接到载体、转化到宿主细胞等。
其中，反转录是将mRNA作为模板，使用逆转录酶合成cDNA的过程，合成的cDNA片段具有转录本的特异性。
二、应用领域1. 基因组文库的应用领域：基因组文库广泛应用于基因组测序、基因定位、基因组结构和功能研究等。
通过对基因组文库进行测序，可以获取到整个基因组的序列信息，进而进行基因组注释、基因定位、重测序等研究。
此外，基因组文库还可用于构建比较基因组文库，用于不同物种之间的基因演化和功能保守性研究。
2. cDNA文库的应用领域：cDNA文库主要应用于转录组学研究，可以用于测定不同组织、不同生长阶段或不同环境条件下基因的表达情况。
通过对cDNA文库进行测序，可以获取到转录组的信息，进而进行基因表达差异分析、功能注释、代谢途径分析等研究。
此外，cDNA文库还可用于筛选和克隆特定基因。
三、优缺点比较1. 基因组文库的优缺点：优点：基因组文库包含了整个基因组的信息，可以全面了解基因组的结构和功能；适用于基因组水平的研究，如基因组测序和基因定位等。
缺点：基因组文库的构建比较复杂，需要大量的DNA样品；基因组文库中包含大量的非编码区域，测序成本相对较高。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪 切可以非常随机地进一步将长片段切割成 小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解—位点非随机分布。常用的酶 是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与 BamHI酶解载体产生的末端相同
基因组DNA片段的限制性内切酶酶解
• 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非 随机片段，为了获得15－25kb的或更大的基 因组DNA片段（适用于λ噬菌体或黏粒载体 的片段），需要进行部分酶解，即通过合理 使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶 切片段的大小
• 也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合 成第二链。
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组 体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
cDNA文库
真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电 泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要 困难。
麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎，分离出麦胚，然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨。g 离心所得的上清夜称为S23；将S23分装，保存于-20°C冰箱中。
利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时，需加的物质与织红细胞系统相似。由于该体系无mRNA，所以必须 加入mRNA。
1．高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%，该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特 定mRNA。 2．低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。
随机引物引导的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis）：
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3'-末端的oligo （dT）引物一处开始。
目的基因的分离
外源基因： 插入到载体内的那个特定的片段基因。 目的基因： 那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。
载体制备
1．pBlueScriptII的提取
1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上， 37℃培养过夜。
典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子，某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至n（1-1/n） N：所需克隆数；P：要求的概率；n：一种mRNA在总mRNA中的相对比例 （1）按大小对mRNA进行分级分离 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低。 蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量 的mRNA。 （2）cDNA的分级分离
cdna文库 名词解释(一)
cdna文库名词解释(一)CDNA文库CDNA文库（Complementary DNA Library）是一种用于存储和研究基因信息的重要工具。
它通过将RNA转录成互补DNA，进而合成成双链DNA，并将其插入基因载体中，构建成具有完整基因组的文库。
CDNA 文库广泛应用于基因克隆、基因表达调控和基因功能研究等领域。
以下是与CDNA文库相关的名词及其解释：1. RNA（Ribonucleic Acid）RNA是一种核酸分子，由核苷酸组成，与DNA一样，是生物体内的遗传物质之一。
在细胞中，RNA参与基因表达、蛋白质合成等生物过程。
例子：转录过程中，DNA的信息被转录成RNA分子，即前体mRNA （pre-mRNA），这是制备CDNA文库的第一步。
2. 互补DNA（Complementary DNA）互补DNA是以RNA为模板合成的DNA分子，与原始RNA分子具有互补序列。
在CDNA文库构建中，通过逆转录酶将RNA逆转录合成互补DNA。
例子：逆转录酶能将mRNA逆转录合成互补DNA链，这是制备CDNA文库的关键步骤。
3. 基因载体（Vector）基因载体是一种能够携带并传递外源基因的DNA分子。
在CDNA文库构建中，互补DNA会被插入基因载体中，形成完整的基因组。
例子：常见的基因载体有质粒（plasmid）和噬菌体（bacteriophage）等，用于携带并繁殖CDNA文库。
4. 文库（Library）文库是指一系列具有特定特征的基因片段的集合。
CDNA文库中包含了细胞中的全部转录本的互补DNA，是基因组的全息镜像。
例子： CDNA文库能够存储细胞中整个基因组的转录本，研究人员可以通过筛选和分析文库中的基因片段来了解基因的结构和功能。
5. 基因克隆（Gene Cloning）基因克隆是将外源基因插入到宿主细胞中，并通过复制与传递使其表达的过程。
CDNA文库中的基因片段可以被基因克隆技术提取出来进行进一步研究。
cDNA和基因组文库DNA的构建
2：cDNA第二链的合成
• 2 . 1：cDNA第二链的合成将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中、
• 10mMol/L mgcl2 70ul • 2mM/L Tris-Hcl(PH7.4) 5ul
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小， <8kb 9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,T-载体,
• 2 . 8.用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到 已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。 [第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg xμg)=cDNA第二链合成量/μg x表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的 70~80% 2 . 9.用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物 进行抽提。
5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法 分离cDNA
•
Sepharose CL-4B柱的制备 5 . 1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用 无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的 棉拭子吹至吸管狭窄端。 5 . 2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有 0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置 的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体。
cdna library名词解释
cdna library名词解释
cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
cDNA文库的构建过程包括以下步骤：
1. 提取某一组织或细胞在特定生理时期或特定生长条件下的总mRNA。
2. 利用逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。
3. 将cDNA与适当的载体（如质粒或噬菌体）连接，形成克隆。
4. 将连接后的克隆导入宿主细胞（如细菌或酵母）中，进行复制和扩增。
5. 通过筛选和鉴定，得到含有目标cDNA的克隆，形成cDNA文库。
cDNA文库的优点在于它代表了特定组织或细胞在特定条件下的基因表达谱，可以用于鉴定新的基因、研究基因表达调控、筛选药物靶点等。
此外，cDNA文库还可以用于基因组测序、基因组注释和比较基因组学研究等。
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cdna文库的构建
首先需要提取出RNA分子的互补DNA（cDNA），然后将其克隆到载体上，形成一个cDNA文库。
具体的步骤如下：
1. RNA提取：从组织或细胞中提取RNA。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转变成cDNA。
逆转录酶可以用几种不同的方法，包括反转录PCR方法和反转录特异性引物的方法。
3. 双链cDNA合成：将一端的oligo dT引物与头部的mRNA 低复杂度区域杂合，随后，通过使用逆转录酶(polymerase)来合成第一条链，然后再合成第二条链，以得到双链cDNA。
4. 手工或机器克隆：将cDNA克隆到载体中。
手工克隆使用限制性内切酶和连接酶来插入cDNA，而机器化克隆则使用高通量自动克隆技术。
5. 图书馆筛选：初步筛选文库，以分离包含所需基因的克隆。
6. 验证和测序：最后，通过验证所得克隆的插入片段的尺寸和序列，并使用测序技术对其进行测序。
总的来说，构建cdna文库需要耗费较多的时间和精力，但它
是研究基因表达的重要手段。
对于生物学、医学、农业等领域的研究都具有非常重要的意义。