胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mgml)
胰蛋白酶-EDTA溶液
胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)产品简介：胰蛋白酶（Trypsin）是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。
胰蛋白酶的特点还在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。
胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。
Leagene的 Trypsin-EDTA solution，含0.25%胰酶、0.02%EDTA。
该溶液经过过滤除菌，可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化。
该产品通常室温消化1min 左右就可以消化下大多数贴壁细胞。
主要成分：主要由0.25%胰酶、0.02%EDTA等组成，不含酚红，过滤除菌。
自备材料：1、微量移液器2、PBS、Hanks液或无血清培养液3、显微镜4、离心机操作步骤(仅供参考)：1、贴壁细胞的消化①吸除培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。
②加入少量Trypsin-EDTA solution，略盖过细胞即可，室温放置0.5～2min，不同的细胞消化时间有所不同。
③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。
此时吸除胰酶细胞消化液。
加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。
④如果发现消化不足，则加入Trypsin-EDTA solution重新消化。
⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。
1000～2000g离心1min，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。
注意事项：1、尽量减少反复冻融的次数，以免失效。
免疫共沉淀技术路线.
免疫共沉淀技术免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation ）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE 及Western blotting 分析。
但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
免疫沉淀反应（Immunoprecipitation ）主要用于抗原或者抗体的定性检测。
其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。
据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。
凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。
Immunoprecipitationbinding wash elutionY免疫共沉淀技术路线准备工作：预冷PBS ，RIPA Buffer ，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS ；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm 培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm 培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP 管中，4℃，缓慢晃动15min （EP 管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g 离心15min ，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose ，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS 配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml 总蛋白中加入100μl Protein A 琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min （EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g 离心15min ，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子Co-immunoprecipitationbinding wash elutionY8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer 洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
溶液各种配制
附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-BicarbonateBuffer)由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH>9的缓冲液配制（附表1）。
附表1. 0.2mol/L碳酸盐缓冲液（～）磷酸缓冲液(PhosphateBuffers，PB)磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽。
NaH2PO4：pKa1＝，pKa2＝；Na2HPO4：pKa1＝，pKa2＝。
另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。
磷酸缓冲液的优点为：①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH值变化较小；④离子强度对缓冲液pH影响较小，如L缓冲液稀释10倍其pH变化小于。
磷酸缓冲液的缺点是：①磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。
NaH2PO4的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。
Na2HPO4的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。
而pH＝6～8的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表2）。
附表2. 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（～）磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-bufferedsaline,PBS)磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。
NaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g在800ml蒸馏水中溶解，用HCl调节溶液的pH值至～加水定容至1L，15psi （1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保存备用。
IP实验原理
IP实验原理免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min，12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl proteinA/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
lysis buffer 组织裂解方法
lysis buffer 组织裂解方法1. 介绍组织裂解是生物学研究中常用的一项技术，用于破坏细胞膜和细胞壁，释放细胞内的生物大分子，如蛋白质、核酸等。
其中，裂解缓冲液（lysis buffer）是组织裂解的重要组成部分，它能够提供适宜的环境条件，使细胞内的生物大分子得以稳定地存在并保持其生物活性。
本文将介绍裂解缓冲液的组成和作用，以及常用的组织裂解方法，帮助读者了解并掌握该技术。
2. 裂解缓冲液的组成和作用裂解缓冲液的组成可以根据研究对象的不同而有所差异，但通常包含以下几个关键组分：2.1 裂解剂裂解剂是裂解缓冲液中的主要成分之一，它能够破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物释放出来。
常用的裂解剂包括：•阳离子性表面活性剂（如十二烷基硫酸钠，SDS）：通过破坏细胞膜的疏水屏障，使细胞内容物释放出来。
•非离子性表面活性剂（如Triton X-100）：通过破坏细胞膜的疏水屏障，使细胞内容物释放出来。
•蛋白酶（如蛋白酶K）：通过降解细胞壁的蛋白质组分，使细胞内容物释放出来。
2.2 维持稳定的pH值和离子浓度裂解缓冲液中的缓冲剂可以帮助维持溶液的稳定pH值，确保裂解过程在适宜的pH 条件下进行。
常用的缓冲剂包括：•磷酸盐缓冲液（如PBS）：适用于细胞和组织的裂解，能够维持溶液的稳定pH值。
•Tris缓冲液：适用于细胞和组织的裂解，能够维持溶液的稳定pH值。
此外，裂解过程中还需要适当的离子浓度来维持细胞内外的渗透平衡。
常用的离子包括：•氯化钠（NaCl）：用于维持细胞内外的渗透平衡。
2.3 辅助成分裂解缓冲液中还可以添加一些辅助成分，以提高裂解效果或保护目标分子的活性。
常用的辅助成分包括：•蛋白酶抑制剂（如PMSF）：用于保护目标蛋白质免受蛋白酶的降解。
•胰蛋白酶抑制剂（如aprotinin）：用于保护目标蛋白质免受胰蛋白酶的降解。
•DNase/RNase抑制剂：用于保护DNA/RNA免受核酸酶的降解。
3. 常用的组织裂解方法3.1 化学法化学法是常用的组织裂解方法之一，通过使用裂解缓冲液中的化学物质来破坏细胞膜和细胞壁。
WB操作方法
5.4.1总蛋白的提取（1）将培养板内的培养液弃掉，用4℃预冷的0.01M PBS(PH7.2~7.4)洗涤细胞2次。
先配置的裂解液（内含RIPA缓冲液5mL、5ug/mL Aprotinin 、5ug/mL Leupeptin和100μg/m L的PMSF蛋白酶抑制剂）100μL/孔，浴中静置30min。
（2）细胞刮刀将细胞从板壁上刮去下来转移至离心管中，4℃下以12000rpm 离心30min，小心收集离心后的上清液，重新转移至新的离心管中，分装保存于-80℃待用。
5.4.2制作标准曲线Bradford法测定蛋白浓度（1）配制10 mg/mL BSA的母液，临用前稀释至1mg/mL使用。
（2）取18只10mL EP 管，3个一组，分别标记为0μg，20μg，40μg，60μg，80μg，100μg。
按照下表中加入各种试剂：1mg/mL BSA –20μl40μl60μl80μl100μl去离子水100μl80μl60μl40μl20μl–考马斯亮蓝G-250 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml （3）混匀后，室温放置5min，在波长595nm 处测定吸光值(A595)，并绘制标准曲线。
5.4.3检测样品蛋白含量（1）取足量的10mL EP管，各管均加入考马斯亮蓝溶液5mL。
（2）取其中一管加入去离子水100ul，混匀放置5min后作为空白对照。
（3）其余各管加入去离子水85uL和待测蛋白样品15ul，混匀后静置5min，于波长595nm处测定吸光值，代入标准曲线中确定待测样品浓度。
5.4.4变性不连续SDS-PAGE（变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）（1）根据厂家说明书正确安装电泳槽，注意两块玻璃板中位置较低的一块应朝向电泳槽的阴极侧，并试插Teflon梳子以确定螺丝的松紧。
（2）参照前面液体配制的方法，先灌制下层10%分离胶10 mL，迅速将分离胶灌入电泳槽两块玻璃板的间隙中直至分离胶顶部距阴极侧玻璃板顶端2.2cm 处，即梳子的齿长+1cm 积层胶+凝胶收缩的长度=2.2cm。
蛋白酶K溶液说明书
北京索莱宝科技有限公司
蛋白酶K溶液（10mg/ml）说明书
货号：P1120
规格：1ml/5ml
保存：-20℃储存，有效期至少12个月。
产品说明：
Proteinase K，中文名为蛋白酶K。
进口产品配置，不含DNase，不含RNase，可直接使用。
可以用于消化各种蛋白。
用于各种常见的分子生物学、细胞生物学等相关实验，例如基因组DNA抽提、酶的消化去除等。
酶活力>30U/mg。
在37ºC、pH7.5条件下，每分钟可水解底物酪蛋白生成1µmol酪氨酸所需蛋白酶K的量，定义为一个单位（U）蛋白酶K酶活力。
在很宽的pH范围内有效，有效的pH范围为pH4.0-12.5，最佳pH范围为pH7.5-8.0。
蛋白酶K的最佳反应温度为65℃，但在65℃或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。
很多时候反应温度选择50-55℃。
在0.2-1%SDS或约10mM尿素存在的情况下，蛋白酶K显示更高的酶活性。
蛋白酶K的常用工作浓度为0.05-1mg/ml，根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。
常用浓度的EDTA、Triton X-100、Tween20、Sarkosyl、盐酸胍对蛋白酶K的活力影响不大。
注意事项：
如果每次的使用量很小，可以适当分装后再使用。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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蛋白酶及其抑制剂
蛋白酶及其抑制剂
一、蛋白酶－抑制剂对照表
二、蛋白酶抑制剂混合物选择表
三、抑制剂－蛋白酶对照表
想要寻找适合您的蛋白酶抑制剂？请参看以下蛋白酶－抑制剂对照表！
为了您实验方便，我们向您提供以下蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物表一、蛋白酶抑制剂混合物
表二、蛋白酶抑制剂（按蛋白酶抑制剂名称英文字母排序）：
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Storage
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml) 使用说明书
10ml -20℃ 避光 1份
操作步骤(仅供参考)：
1、 开盖前请低速离心一下，以便将黏附于管壁的液体甩至管底。 2、 使用时，根据裂解液的用量加入胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)，使其工作
浓度在 1-10μg/ml，多用在 3-5μg/ml。
Leagene 胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)主要由胰蛋白酶抑制剂 Aprotinin 等组成，不含 EDTA。适用于从哺乳动物组织、细胞中提取蛋白质，能够更有效的获得目的 蛋白质。提取出来的蛋白可以用于 Western Blot、免疫共沉淀等试验。
组成：
名称
编号 PI0032
注意事项：
1、 胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)有轻微刺激性，小心操作，同时应避免反复 冻融。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12 个月有效。
相：
编号 DC0032 TC0699
名称 Masson 三色染色液 葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)
北京雷根生物技术有限公司
胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)
简介：
蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor)是指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使 蛋白酶活力下降甚至消失但不使蛋白变性的物质。蛋白酶抑制剂有很多种，包括 EDTA、 E-64、NaVO3、Bestatin、Leupetin、Pepstatin A、Aprotinin 等均可有效抑制蛋白的降 解，并维持原有的蛋白间相互作用。