枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化
饲用枯草芽孢杆菌研究进展
饲用枯草芽孢杆菌研究进展崔东良（北京昕大洋科技发展有限公司）1.枯草芽孢杆菌介绍枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
好氧菌, 可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故而得名。
2.枯草芽孢杆菌的益生作用枯草芽孢杆菌的芽孢经食道进入胃后，能顺利通过胃酸环境到达肠道，在肠道中孢子萌发形成营养细胞，并开始大量繁殖。
枯草芽孢杆菌为好氧菌，进入肠道后会消耗游离氧，有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长，从而调节肠道内微生态的菌群平衡，提高机体免疫和抗病能力，减少肠道疾病的发生；枯草芽孢杆菌在肠道内繁殖会分泌淀粉酶和蛋白酶，和消化道内的消化酶一起发挥作用，帮助对营养物质的消化和吸收；其产生的维生素、氨基酸、短链脂肪酸等物质能增加小肠蠕动速度，改善肠道消化功能[2]。
3.枯草芽孢杆菌的发酵研究饲用枯草芽孢杆菌的发酵研究的目的是为了获得大量活菌体和抗逆性强的芽孢，发酵研究的重点主要集中在如何用廉价易得的原料通过优化组合得到得高浓度的菌体，没有复杂的代谢调控和次级代谢的研究。
目前关于枯草芽孢杆菌的发酵只要有液体发酵和固体发酵两种工艺。
3.1液体深层发酵深层液体培养目前发酵工业上常用的一种发酵方法。
该方法在发酵罐内完成，设备利用率高、产品质量稳定，便于自动控制，已广泛用于食品、化工、环境行业。
液态深层培养是当前饲用枯草芽孢杆菌发酵研究的主要方向。
周映华[3]等对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化，通过单因素试验及正交试验方法，确定了该枯草芽孢杆菌的优化培养基和最适发酵条件，通过发酵罐放大培养获得的菌体数量约为1.58×109 cfu/mL。
枯草芽孢杆菌及其分离培养方法
1. 枯草芽孢杆菌及其分离培养方法1.1 枯草芽孢杆菌简介枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌。
它是一种常见的土壤菌，同时也存在于水体、空气和植物表面等生物体的附属物中。
枯草芽孢杆菌具有良好的产生芽孢和分泌代谢产物的能力，因此在农业、医药和食品工业等领域有着广泛的应用前景。
1.2 枯草芽孢杆菌的分离培养方法枯草芽孢杆菌的分离培养是研究其生理特性和应用价值的基础工作之一。
下面将介绍常用的枯草芽孢杆菌分离培养方法。
1.2.1 选择性培养基为了选择枯草芽孢杆菌并抑制其他微生物的生长，常采用含有适当抑菌剂的选择性培养基。
例如，常用的选择性培养基有Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin（MYP）和Bacillus Cereus Agar（BCA）等。
1.2.2 样品采集从土壤、水体或其他可能存在枯草芽孢杆菌的环境中采集样品。
样品的选择要考虑到可能存在的生物体和环境因素对细菌分布的影响。
1.2.3 样品处理将采集到的样品进行处理，常见的处理方法包括稀释、过滤、震荡等。
通过处理可以去除一部分不相关的微生物，并将枯草芽孢杆菌分散在培养基中。
1.2.4 培养基接种将处理后的样品接种在选择性培养基上，用无菌的铁环或吸管进行操作。
将接种好的培养基置于适宜的温度和湿度条件下进行培养。
1.2.5 培养条件调控根据枯草芽孢杆菌的生长特性，可以调控培养条件来促进其生长和芽孢形成。
例如，增加培养基中的营养物质浓度、调节培养温度和pH值等。
1.2.6 分离纯培养经过一段时间的培养后，可以观察到菌落的形成。
根据形态学特征，选择单个菌落划线分离，并进行纯培养。
通过多次传代培养，可以得到纯种的枯草芽孢杆菌菌株。
2. 枯草芽孢杆菌的应用价值2.1 农业领域枯草芽孢杆菌具有多种促进植物生长的特性，可以增强植物的抗逆性和抗病能力，提高作物产量和品质。
此外，枯草芽孢杆菌还可以降解农药和有机污染物，对环境具有修复作用。
枯草芽孢杆菌在家禽生产中应用
枯草芽孢杆菌在家禽生产中应用郭发祥;肖金松【摘要】随着品种选育、遗传潜力提高以及饲养方式的改进，家禽生产力得到了极大地提高，使家禽养殖业成为畜牧业中发展最快的产业。
然而，家禽生长速度提高和饲养密度的增加也加剧了疫病发生频率，使得家禽对各种病原尤其是肠道病原微生物如大肠杆菌、沙门氏菌和空肠弯杆菌等更加敏感。
对病原敏感度的增加也促使生产者使用抗生素、生长促进剂来加强肠道健康和控制亚临床征状的发生。
虽然抗生素在治疗家禽疾病，促进动物生长等方面表现出强大的优势，但由于药残、耐药性以及其它的一些不利之处使得其在世界范围内逐步受到限制。
【期刊名称】《广东饲料》【年(卷),期】2011(000)007【总页数】3页(P32-34)【关键词】家禽生产;枯草芽孢杆菌;病原微生物;应用;肠道健康;家禽养殖业;空肠弯杆菌;生长促进剂【作者】郭发祥;肖金松【作者单位】河源市动物疫病预防控制中心,广东河源517000;广东温氏食品集团有限公司福建分公司,福建南靖363900【正文语种】中文【中图分类】S816.7随着品种选育、遗传潜力提高以及饲养方式的改进，家禽生产力得到了极大地提高，使家禽养殖业成为畜牧业中发展最快的产业。
然而，家禽生长速度提高和饲养密度的增加也加剧了疫病发生频率，使得家禽对各种病原尤其是肠道病原微生物如大肠杆菌、沙门氏菌和空肠弯杆菌等更加敏感。
对病原敏感度的增加也促使生产者使用抗生素、生长促进剂来加强肠道健康和控制亚临床征状的发生。
虽然抗生素在治疗家禽疾病，促进动物生长等方面表现出强大的优势，但由于药残、耐药性以及其它的一些不利之处使得其在世界范围内逐步受到限制。
益生素由于可通过加强肠道微生物区系的屏障功能或通过非特异性免疫功能增强动物抗病力和体质，防止病菌感染，同时还可提高饲料利用率等特点而引起大家的重视。
其中，枯草芽孢杆菌作为益生素中的一种，因具有无毒副作用、无残留污染、不产生耐药性且可部分替代抗生素等优点而引起人们广泛关注。
枯草芽孢杆菌发酵工艺流程
枯草芽孢杆菌发酵工艺流程英文回答：The fermentation process of Bacillus subtilis involves several steps to ensure optimal growth and production of desired metabolites. Here is a general outline of the fermentation process:1. Inoculum preparation: Bacillus subtilis spores are first grown in a suitable medium to form an inoculum. This can be done in shake flasks or bioreactors using anutrient-rich medium. The inoculum is typically grown for a specific period of time to reach the desired cell density.2. Seed culture: The inoculum is then transferred to a seed culture medium to further increase the cell density. This step allows for the adaptation of the cells to the fermentation conditions and ensures a high biomass concentration in the subsequent fermentation step.3. Fermentation medium preparation: A fermentation medium containing all the necessary nutrients for Bacillus subtilis growth and metabolite production is prepared. The composition of the medium may vary depending on thespecific requirements of the strain and the desired metabolite.4. Fermentation process: The seed culture is inoculated into the fermentation medium, typically in a bioreactor.The fermentation conditions, such as temperature, pH, agitation, and aeration, are carefully controlled to optimize cell growth and metabolite production. The fermentation process can be carried out in batch, fed-batch, or continuous mode, depending on the specific requirements.5. Harvesting: Once the fermentation process is complete, the culture broth is harvested to recover the desired metabolite. This can be done by centrifugation, filtration, or other separation techniques to separate the cells from the fermentation broth.6. Downstream processing: The harvested cells orfermentation broth may undergo further processing steps to purify and concentrate the desired metabolite. This can involve techniques such as chromatography, filtration, and precipitation.7. Product formulation: The purified metabolite is then formulated into a final product, which can be in the formof a liquid, powder, or solid, depending on the application.中文回答：枯草芽孢杆菌的发酵工艺包括几个步骤，以确保最佳的生长和所需代谢物的产生。
枯草芽孢杆菌HAB-1产生抗菌物质的最优发酵条件
枯草芽孢杆菌HAB-1产生抗菌物质的最优发酵条件孙亮;刘文波;杨廷雅;和虹宇;邬国良;张宇;缪卫国;郑服丛【期刊名称】《热带生物学报》【年(卷),期】2013(004)003【摘要】为筛选适合Bacillus subtilis HAB-1生长和抑菌物质产生的最佳培养基和最佳培养条件,采用摇瓶培养法和平板对峙法,通过单因子试验筛选适合菌株HAB-1生长的碳源、氮源、金属离子及最佳培养条件.结果表明,经摇瓶发酵培养筛选到适合菌株HAB-1生长及其拮抗物质产生的最佳碳源为蔗糖和玉米粉,最佳氮源为酵母粉和麸皮,最佳金属离子是K+.用正交试验法确定了使HAB-1具有较强抗菌活性的最优培养基为ZY,其各组分的质量浓度为:蔗糖10g·L-1,玉米粉30 g·L-1,酵母粉30 g·L-1,麸皮40 g·L-1,KH2PO41 g·L-1；在确定适合该菌株的培养基组分基础上,对其培养条件进行优化试验,结果表明,初始pH为6.0,培养温度为37℃,250 mL摇瓶装液量为60mL,接种量的体积分数为2％,培养时间为24h,转速为190r·min-1时为该菌株的最佳培养条件,获得菌株HAB-1活菌数最多且对橡胶树炭疽菌的抑菌活性最强,活菌数和抑菌直径分别为2.6×1010·mL-1和34.0 mm,较NB培养的HAB-1提高了123.81倍和1.10倍.【总页数】8页(P225-231,235)【作者】孙亮;刘文波;杨廷雅;和虹宇;邬国良;张宇;缪卫国;郑服丛【作者单位】海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228;海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228;海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228;海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228;海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228;海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228;海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228;海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/海南大学环境与植物保护学院,海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】Q936【相关文献】1.枯草芽孢杆菌生防菌株Bp产生抗菌物质的条件 [J], 彭广茜;张学君2.枯草芽孢杆菌B-903抗菌物质产生条件及部分特性的研究 [J], 王文夕;孔建;赵白鸽;程红梅;申效诚;张桂芬3.枯草芽孢杆菌C3产抗菌物质发酵条件优化 [J], 杨永青;谢远红;张红星;熊利霞;马晓丹;刘慧;孔保华4.枯草芽孢杆菌B02产生拮抗物质培养基及发酵条件优化 [J], 丁翠珍;裘季燕;刘伟成;吴云锋;赵达5.枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质条件的优化 [J], 代玉立;潘月敏;樊淼;甘林;高智谋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌液态发酵的研究
枯草芽孢杆菌液态发酵的研究李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【摘要】该研究选取了一株从无花果中分离出的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为试验菌株,它可以产生抗逆性强的芽孢,非常适合应用于益生菌饲料加工生产.在单因素试验基础上,进行L9(33)正交试验,获得芽孢产量高、原料成本低廉的液态发酵培养基最佳配方为碎米水解液6％、酵母粉0.7％、KH2PO40.5％;对该菌的摇瓶发酵条件进行了初步研究,确定了液态发酵的最佳条件为pH值为5,温度37℃,接种量6％,转速200 r/mm,培养时间19h.在此最佳培养基配方及发酵条件下,发酵液OD600mm值可达7.38.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)002【总页数】5页(P43-47)【关键词】枯草芽孢杆菌;液态发酵;培养基配方;培养条件;优化【作者】李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【作者单位】江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;赣州农业学校食品教研组,江西赣州341100;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6益生菌的生理功能有很多，最重要的是可以促进肠道有益微生物的繁殖，降低病原菌数量，提高机体免疫的功能［1］。
益生菌制剂以无毒、无残留、无副作用、不污染环境等优点，使其成为了有效的抗生素替代物，在防治动植物疾病，促进机体发育，延缓人类衰老等方面被人们广泛使用［2］，并成为生态循环农业中的一个重要纽带。
由于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可形成抗逆性极强的芽孢，在稳定性方面具有先天优势，且枯草芽孢杆菌是我国农业部和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）允许作为饲料添加剂的菌种［3-4］，其可以产生抑菌活性物质［5-6］，也可以作为一种理想的抗生素替代物。
一株饲用枯草芽孢杆菌CCAM 080032固态发酵工艺的研究
ｒ／ｍｉｎ控温摇床下培
养１７
ｈ。
１．４固态培养
根据试验配方称取固体发酵培养基原料，装料量
为４０ ｇ，加入适当蒸馏水，１２１。Ｃ高压灭菌３０ ｒａｉｎ，冷 却至室温后，以接种量为５％接人种子液，在３７℃培
万方数据
－ｌ＿＿豳
养４８ ｈ，然后６０℃烘干、粉碎、计芽孢数。 １．５芽孢计数方法
笪：！：堑釜！二盗塑旦丝芏茎塾堑董ｇ垦垒丛Ｑ！塑！兰堕查垒壁三堇丝堑窒 将枯草芽孢杆菌ＣＣＡＭ ０８００３２在３７℃下进行 固态培养，每１２ ｈ取样测定芽孢产量，以确定最适的 发酵时间。 １．７．２发酵温度的选择 分别在３０、３４、３７、加、４５℃的温度下，发酵４８ 后测定芽孢产量，确定最适的发酵温度。 １．７．３料水比的确定 通过控制添加的蒸馏水的量，使培养基料水比分 别为ｌ：１、１：１．２５、１：１．５、１：１．７５，其他条件保持一 致，３７℃发酵４８ ｈ后测定芽孢产量，以确定最佳的初 始料水比。 ２结果与分析 ２．１培养基优化 ２．１．１培养基固体基质的选择
７
ｏ
铵、硫酸铵、尿素、胰蛋白胨、酵母抽提物到含５０以ｇ
葡萄糖的基础培养基中。其他条件保持一致，３７℃发 酵４８ ｈ后测定芽孢产量，确定最适外加氮源的种类。
表ｌ外加氮源对芽孢产量的影响 堡旦
ＮａＮ０３
０
６０ ５ Ｏ ４Ｏ ３ Ｏ Ｏ
鋈垫量亟丝由
３０．３６ １４．２９ １９．“ ２３．５７ １０．７２ ３９．３７ ５０ １５０．１５
ｇ，３７℃培养４８ ｈ，芽孢产量达到７．９０ｘ１０ｍ
ＣＦＵ／ｇ。
关键词：枯草芽孢杆茵；固态发酵；芽孢产量 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—９９１Ｘ（２０１０）２２－００４３—０４
枯草杆菌 生物兴趣小组(共35张PPT)
9、 复染：滴加蕃红复染3-5min， 水洗。
至此，革兰氏染色结束。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
观察荚膜和鞭毛标本片
周生
一端生一束
荚膜
革兰氏染色法是一种鉴别性的染色方法。 美国用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害，用于防 治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。 [1]刘惠知，孔利华，周映华，黄建军. 确定N源后，在保持C含量不变的情况下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作为C源制作发酵培养基，其它组分不变，相同 条件下培养48h，测定活菌数和芽孢率，确定最佳C源。 本品还有婴幼儿生长发育所必须的多种维生素、微量元素及矿物质钙，可补充因消化不良或腹泻所致的缺乏。 利用蛋白质工程技术，能够在生产新酶之前对该酶的性质进行改良和调整，从而改善酶的活性或者赋予酶新的所需性质。 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响 枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病 菌生长 研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。 通用名称：枯草杆菌二联活菌颗粒
这些浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环； 精、番红染 色液、蒸馏水。 8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响
培养方法
先用接种环接种1环试管菌 种到牛肉膏蛋白胨液体培 养基中，200r/min，37℃培 养24h，进行扩大培养和活 化，然后再取1mL液体种接 种到发酵培养基中，37℃培 养48h。
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枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化焉兆萍，宋士良，陆克文(上海邦成生物工程有限公司，上海 201506)中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A文章编号：1001-0769(2019)01-0051-05枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境；能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。
该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。
枯草芽 孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2]；其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。
由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。
本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。
1 材料与方法1.1 供试菌种枯草芽孢杆菌，由上海邦成生物工程有限公司菌种保藏室提供。
1.2 培养基LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。
LB液体种子培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、水 1 000 mL，pH 7.2。
1.3 种子液的制备将菌种接种于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱活化18 h后，挑取单菌落接入装有100 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h。
1.4 液体种子生长曲线的测定将液体种子以1％接种量分别接入盛有100 mL种子液体培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h、26 h和27 h，分别取样测其吸光度(OD600)。
摘 要：本文对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化。
采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯草芽孢杆菌的优化培养基为：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸铵0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸亚 铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L。
最适发酵条件为：初始pH 7.2，接种量5％，发酵温度35 ℃，摇床转速250 r/min。
关键词：枯草芽孢杆菌；发酵培养基；发酵条件1.5 发酵培养基的筛选及优化选择12种不同发酵培养基进行筛选，种子液以2％接种量接入盛有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min 摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳发酵培养基[5-17]。
不同发酵培养基配方组成如下：(1) 麦芽浸粉1 g/L、黄豆粉(过80目筛) 15 g/L、碳酸钙6.68 g/L、硫酸锰0.4 g/L、氯化镁2 g/L，pH 7.2。
(2) 可溶性淀粉10 g/L、酵母膏10 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、硫酸镁0.2 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。
(3) 玉米淀粉15.86 g/L、玉米浆干粉12.68 g/L、氯化铵19.98 g/L，pH 7.2。
(4) 蛋白胨30 g/L、甘油10 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁1.5 g/L，pH 7.2。
(5) 玉米淀粉25.3 g/L、黄豆粉(过80目筛)49.5 g/L、酵母膏13 g/L、磷酸氢二钾1.1 g/L、硫酸镁1.5 g/L、氯化钙0.1 g/L、硫酸锰0.1 g/L，pH 7.2。
(6) 葡萄糖15 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸镁5 g/L，pH 7.2。
(7) 酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、蔗糖12 g/L、氯化钠5 g/L，pH 7.2。
(8) 玉米淀粉15 g/L、玉米浆干粉12 g/L、酵母膏1.5 g/L、氯化铵3 g/L、硫酸镁0.3 g/L、硫酸锰0.15 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。
(9) 蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏粉5 g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L，pH 7.2。
(10) 豆粕20 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉10 g/L，pH 7.0。
(11) 豆粕20 g/L、葡萄糖5 g/L、玉米淀粉5 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、硫酸镁0.5 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸亚铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L、硫酸锰0.2 g/L，pH 7.0。
(12) 玉米淀粉20 g/L、蛋白胨5 g/L、豆粕10 g/L、硫酸铵0.5 g/L、碳酸钙1 g/L，pH 7.0。
1.6 发酵条件的优化1.6.1 最佳培养温度的测定采用筛选出的10号培养基，液体种子以2％接种量接入盛有100 mL发酵培养基的 500 mL三角瓶中，分别在30 ℃、35 ℃、 37 ℃和40 ℃条件下，180 r/min摇床培养 72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳发酵温度。
1.6.2 最佳生长pH的测定采用筛选出的10号培养基，发酵培养基初始pH分别调至6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0，种子液以2％接种量接入盛有100 mL发 酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳初始pH。
1.6.3 接种量的影响采用筛选出的10号培养基，将种子液接种量分别调节为摇瓶装液体积的1％、2％、5％、7％和10％，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适接种量。
1.6.4 装液量对细菌生长的影响采用筛选出的10号培养基，种子液以2％接种量分别接入装有50 mL、75 mL、 100 mL、125 mL、150 mL液体发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适装液量。
1.6.5 摇床转速对细菌生长的影响采用筛选出的10号培养基，液体种子以2％接种量接入盛有100 mL发酵培养基的 500 mL三角瓶中，37 ℃条件下摇床培养72 h，摇床转速分别设定为150 r/min、180 r/min、200 r/min和250 r/min，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适转速。
在确定好发酵培养基碳源与氮源的基础上，采用三因素三水平的正交试验表[L9(33)]进行试验。
种子液以5％接种量接入装有 50 mL初始pH 7.2液体发酵培养基的500 mL 三角瓶中，35 ℃条件下250 r/min摇床培养 72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数。
2 结果与分析2.1 菌株生长曲线的测定从图1可以看出，菌株在LB液体种子培为养基中，37 ℃培养时间为23 h时的OD600最大值，因此选择培养23 h为液体种子生长2.2 发酵培养基的筛选培养基的筛选结果见表1。
从试验结果可以看出，10号培养基摇瓶培养，细菌总数最高值为40.5亿CFU/mL。
因此可选用10号培养基作为发酵培养基。
2.3 发酵条件的优化2.3.1 培养温度对发酵菌数的影响由图2结果可知，35 ℃培养发酵菌数最高，37 ℃次之，30 ℃和40 ℃条件下发酵细菌总数明显较低。
因此，选择35 ℃为最佳发酵温度。
2.3.2 初始pH对发酵菌数的影响摇瓶发酵中pH难以控制，一般控制其初菌数为35亿CFU/mL，初始pH 7.2时发酵菌数可达到39亿CFU/mL，明显高于其他初始pH的发酵菌数，因此选择适宜初始pH为7.2。
2.3.3 接种量对发酵菌数的影响分别采用1％、2％、5％、7％和10％五个接种量梯度进行摇瓶培养，培养检测结果见图4。
由图4结果可以看出，一定范围内，发酵菌数随接种量的增加而增加，5％接种量以上发酵菌数不再增加，因此5％接种量为最适接种量。
2.3.4 装液量对发酵菌数的影响由图5可以看出，装液量越多发酵菌数越低。
枯草芽孢杆菌为需氧菌，在一定培养条件下，装液量越少发酵菌数越高。
因此选择最适摇瓶装液量为50 mL。
2.3.5 摇床转速对发酵菌数的影响由图6可以看出，摇床转速越高发酵菌数越大。
转速小，通气量小，不利于枯草芽孢杆菌的生长。
因此该菌的适宜摇床培养转速为250 r/min。
2.4 发酵培养基的优化碳源与氮源优化的正交试验因素水平 见表2，优化结果见表3。
从表中可以看出，发酵培养基中豆粕、葡萄糖和玉米粉的用量对枯草芽孢杆菌的生长均产生一定影响，从极差R 的大小来看，各因子作用的主次顺序为A ＞C ＞B，即豆粕的用量对菌体增殖的影响最为显著，玉米粉次之，葡萄糖影响最小。
以发酵菌数作为评价指标，最佳表现组合为A2B1C2，即豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L 为碳源、氮源用量的最佳组合。
3 结论由试验结果可知，培养温度、培养基初始pH、接种量、摇床转速等培养条件和发酵培养基的组成对菌株的生长有很大影响。
本文采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯草芽孢杆菌的优化发酵培养基组成为：豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L。
最适发酵条件为：发酵温度35 ℃，初始pH 7.2，接种量5％，摇床转速250 r/min。
采用此种配比发酵培养72 h 后细菌总数可达162亿CFU/mL，本试验结果为大规模工业化发酵生产提供了有益借鉴。
□□参考文献：(17篇，略)扫描关注微信公众号点击公众号下方的“博看微刊”菜单在线无限制阅读本刊文章。