a-淀粉酶高产菌株筛选实验
1 a-淀粉酶高产菌株的分离鉴定及固定化 枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究中应用广泛。其芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。广泛生长在中性的的含淀粉多的环境中，如富含淀粉的面粉厂、土壤等。 淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α- 1，4 糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。β- 淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α- 1，4 糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。 a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题，其中α -淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。另可尝试探索用一定浓度的凝胶包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交联法将枯草芽孢杆菌固定化，使菌体不能流动而酶可以存在反应液里。凝胶柱底部可选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物可以流出。
【实验一】 一、a-淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选 二、【实验原理】 大多数枯草芽孢杆菌好氧，最适生长温度为32℃,PH为7.2，转速为140r/min，接种量为9％，芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min。在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线法分离纯化出产a-淀粉酶的菌株，根据是否可产生透明圈来筛选。透明圈越大，产酶能力越强。 三、【实验仪器和材料】 1、试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液 配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml； B 液：0.0l% KOH l00ml。 混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。 2、淀粉酶筛选富集培养液（细菌） 淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L，调至
pH 为7，取300ml分装 9 ml 于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 3、淀粉酶筛选培养基I（细菌） 淀粉3g、硫酸铵3g、氯化钠1.5g，用无机酸碱调pH值至7.0左右，加蒸馏水定容至300 ml，再加琼脂5.4g，装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ℃，20 min，冷却至50-55℃左右时倒入无菌平皿。 4、淀粉酶筛选培养基II（细菌） 淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L，调至
pH 为7，再加18g琼脂，取300ml分装 9 ml 于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 5、器材 烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜 、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片 2
四、【实验步骤】 1、富集培养（第1天）：取标本于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的富集培养液中，同时做一个不接菌液的空白对照管一起培养。置30℃培养箱中培养20-24小时（第2，3天）。 2、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。（第2天） 水一碘液浸片的观察：在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片。 3、镜检：取少许富集的菌液观察菌的形态。（第2天） 4、菌液稀释：用无菌枪头吸取0.5 ml富集菌液，加入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，稀释成10-1稀释液。再用1 ml无菌枪头，吸取10-1稀释液0.5 ml，移入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸混匀，即成10-2稀释液。同样做法再一次，做成10-3稀释液。 5、倒平板培养（第2天）：倒筛选培养基I平板，凝固待用。用无菌枪头分别吸取10-2、10-3
浓度的稀释液0.1 ml于平板上，用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀。平放桌面30 min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，置30~32 ℃再培养24 h或稍长(过长则霉菌长出) （第3，4天）。
6、纯化：从长有单菌落的平板中选取典型的大的透明圈菌落，用接种环挑取一环的菌，在筛选培养基I平板中采用划线分离法分离菌。并同时制片做纯度检查。若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，直至获得纯培养体为止。涂片镜检，菌落观察。（第4，5天） 7、菌种保藏：将分离的酵母菌转接于筛选斜面培养基上培养（从第6步中的每个平板保藏8~10株），待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。（第4，5天） 8、将保藏的菌株接种到筛选培养基II平板中，每个板接8～10株，培养1-2天后，选择4-5株高产菌株保藏备份并分别进行摇瓶培养，进行酶活测定。 五、酶活测定方法 （1）DNS法 筛选出高酶活菌株。标本本实验设定40 ℃时在5 min 内水解淀粉释放1 mg 麦芽糖所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。计算酶活力的公式为:酶活力单位=C 酶× V 酶× n。 式中C酶为酶液中麦芽糖的浓度；V酶为提取酶液的总体积；n 为酶液的稀释倍数。利用麦芽糖梯度标 准液绘制标准曲线，用SPSS 12.0 统计软件包计算回归方程，求出相关系数和标准误
注：DNS法测还原糖 - DNS-二硝基水杨酸 DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。 3
DNS法测还原糖 - DNS试剂的制备 将6.3克DNS和262ml 2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。
DNS法测还原糖 - 葡萄糖标准曲线的绘制 分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25 ml试管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。在540nm波长下测定吸光度。
DNS法测还原糖 - 样品的测定 样品液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。求出样品中糖含量。
六、【注意事项】 1、美兰染色浓度和时间严格掌握； 2、平板培养时间不宜过长，过长则霉菌长出。 【实验二】 二、菌株的鉴定 一、【实验目的】 学习酵母菌的鉴定方法，熟悉使用分子生物学手段进行微生物鉴定。 二、【实验原理】 微生物鉴定是科研及生产过程中非常重要的工作。可以通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行鉴定。 三、【实验仪器和材料】 A、DNA提取需要配置的试剂 高盐的TE buffer 终浓度 配制50 ml 10 mM Tris.Cl, pH 8.0 0.5 ml(1M 母液) 0.1 mM EDTA, pH 8.0 0.01 ml(0.5M 母液) 1 M NaCl 1.8 g 室温可保存几年 CTAB提取液 4
终浓度 配制200 ml 2%(W/V) CTAB 4 g 100 mM Tris.Cl, pH8.0 20 ml(1 M 母液) 20 mM EDTA, pH8.0 8 ml(0.5M 母液) 1.4 M NaCl 10.22 g 室温可保存几年 10×CTAB/NaCl溶液(10%CTAB/0.7 M NaCl) 在80 ml H2O中溶解4.1 g NaCl，缓慢加入10 g CTAB，同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容至100 ml。 其它化学试剂：异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物。 B、仪器 移液枪（10、100、1000μl）,0.2 ml PCR管，枪头，2 ml eppendorf管，饭盒。 四、【实验步骤】 1.形态学鉴定：（第7天） A．菌落形态观察 按普通微生物实验指导书观察所分离的细菌菌落特征。 B. 细胞形态学观察 按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察并绘制细胞形态图。 2.分子生物学鉴定： （1）菌体DNA的提取（CTAB法提取真菌基因组DNA）（第7,8天） 1) 取少量酵母菌落连同部分培养基一起放入研钵中，加入液氮粉碎，然后加入800 μl 2% 65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60 min。 2) 加入800 μl的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000 r/min，离心5 min。 3) 取上清(约600 μl)，加入1/10体积（约60 μl）的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。 4) 用等体积(约600 μl)的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000 r/min，离心5 min。 5) 取上清(约450 μl)，加入0.8 V的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做下步，否则，-20℃保温10~20 min）。 6) 4℃，12000 r/min，离心10 min。 7) 去上清，用高盐的TE buffer重悬（约100μl）。（可65℃保温30 min，至大部分溶解）。 8) 加入0.8体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀，-20℃保温10~20 min），4℃，12000 r/min，离心15 min。 9) 去上清，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬（30~60μl）。 （2）DNA质量检测（第7,8天） 以1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/OD280的比值）。 DNA浓度计算：
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定一实验目的及要求：为了从自然界获得产淀粉酶活力较高的菌株,从面粉、储存面仓、发霉玉米等样品中筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌，并对产淀粉酶菌的生理生化进行了探讨。
从面粉中得到的产淀粉酶菌共有三种，颜色有红色和白色。
从其菌体形态初步了解其特征，随后用唯一碳源实验、葡萄糖酵解实验、过氧化氢酶实验等分析并鉴定其生理生化特性。
二名词定义：淀粉酶分离鉴定淀粉酶 amylase，AMY,AMS一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。
根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
微生物的酶几乎都是分泌性的。
此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。
因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。
另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1,6-键的α-极限糊精。
一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。
β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。
作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。
实验一淀粉酶生产菌的筛选
实验一淀粉酶生产菌的筛选实验一淀粉酶生产菌的筛选（一）目的要求通过本实验教学使学生掌握淀粉酶产生菌的筛选方法；熟悉产生菌筛选的原理。
（二）实验内容1、培养基制备：配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。
配制初筛平板培养基（可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，水1000ml,pH7.2-7.4）350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2、倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。
冷却凝固待用。
3、样品预处理：取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。
4、平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于37℃培养24～48h。
5、菌株检测：待初筛平板长出菌落后，根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。
同时，将检测试剂（Lugol碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记住其编号，以便进行下一步实验。
6、保存菌种：将得到的菌株转接至斜面培养基上，30℃培养48～72h，待菌苔长好后，4℃保存。
（三）仪器设备高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电子天平、电炉、恒温振荡器、恒温培养箱、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、移液管、洗耳球、试管、试管架、接种针、涂布棒等。
（四）主要耗材牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、琼脂、碘、碘化钾等。
简答题 设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,并加以必要
简答题设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,
并加以必要
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
α-淀粉酶的生产工艺
α-淀粉酶的⽣产⼯艺a -淀粉酶的发酵⽣产⼯艺摘要：a -淀粉酶⼴泛分布于动物、植物和微⽣物中，能⽔解淀粉产⽣糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是⼯业⽣产中应⽤最为⼴泛的酶制剂之⼀。
⽬前，a -淀粉酶已⼴泛应⽤于变性淀粉及淀粉糖、焙烤⼯业、啤酒酿造、酒精⼯业、发酵以及纺织等许多⾏业。
1?菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将⼟壤系列稀释，把10-3、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接⼊斜⾯。
将细菌从斜⾯接种到淀粉培养基培养2天，⽤碘液染⾊，记录透明圈⼤⼩和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验⽤。
1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表⾯；⽤紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到⿊暗中倒置培养，37C培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加⼊碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最⼤的菌种保存到斜⾯培养基上。
1.3诱变⽅法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养⾄对数⽣长期后期。
②以NTG为诱变剂，按⼀定处理剂量（包/ml），在⼀定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4 h0③经⾼速离⼼分离，移植于液体完全培养基进⾏后培养。
④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24 h培养形成⼩菌落。
⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30E培养36 h o⑥⽤2#定性滤纸制成5 mm disc（⼩圆纸⽚），并⽤2%琼脂BY培养基灭菌后加⼊较⼤剂量青霉素（抑菌）。
倒⼊200 mm x 300mm长⽅形不锈钢玻璃培养⽫中，冷却凝固。
然后把5 mm disc 纸顺序放在培养基表⾯。
⑦⽤微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。
把disc培养⽫经37C, 24h分别培养。
高产淀粉酶菌株筛选
高产淀粉酶菌株筛选淀粉酶是一种以淀粉为底物的酶，可以将淀粉水解为糊精、糊精、麦芽糊精等多种低聚糖。
淀粉酶在食品工业、酿造工业、纺织工业等领域有广泛的应用。
在淀粉酶生产过程中，高产酶菌株的选育十分重要。
本篇文章将介绍高产淀粉酶菌株筛选的相关知识和方法。
1. 筛选菌种在高产淀粉酶菌株筛选中，首先要选取一种基础菌株，并在培养基中加入抑制其他细菌生长的抗生素，以防止其它外来细菌的污染。
另外，为了避免淀粉酶活性的干扰，还需要在培养基中加入淀粉水解产物。
2. 筛选培养基淀粉酶生产的细菌在不同类型的培养基中的生长情况也不同。
因此，在高产淀粉酶菌株筛选中，需要尝试不同成分和配比的培养基，找到最优的培养基。
3. 筛选条件在高产淀粉酶菌株筛选中，不同的发酵条件都会影响细菌的生长和淀粉酶的产生。
例如 pH 值、温度、搅拌速度、氧气供应等。
因此，需要优化发酵条件，使其最大化淀粉酶产量。
4. 淀粉酶活性测定确定淀粉酶的活性对于筛选高产淀粉酶菌株十分重要。
一般采用碘液滴定或 Fehling 精制法来测定淀粉酶活性，选择最高活性的菌株作为高产淀粉酶菌株。
微生物菌株的选择是筛选高产淀粉酶菌株的核心工作，可通过筛选自然环境中的菌株，或采用一些基因工程技术筛选出高产酶活的工业微生物菌株。
淀粉酶检测方法是评估筛选结果的一个关键步骤，目前主要有碘液滴定和Fehling 精制法两种方法，需要选择准确、温和、操作简便的方法测定淀粉酶活性。
高产淀粉酶菌株筛选的研究具有广泛的应用前景。
目前，在食品工业、酿造工业、制糖工业、制药工业、纺织工业等领域已经取得了较为显著的应用效果。
高产淀粉酶菌株的筛选研究不仅是实现淀粉酶生产工艺的自动化，还能生产高附加值的淀粉水解产品，提高资源利用效率。
总之，无论是在工业生产还是在科学研究方面，高产淀粉酶菌株筛选都扮演着重要的角色。
通过优化菌株选型，调整培养基成分和发酵条件，以及采用高效、准确的淀粉酶检测方法，可获得高产且高效的淀粉酶制剂，为产业生产和科学研究做出贡献。
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株筛选
1.淀粉酶产生菌的分离与纯化实验原理淀粉是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键构成的直链淀粉和α-1，6位有分支的支链淀粉组成的。
按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（或异淀粉酶）4大类。
产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等。
利用淀粉遇碘液变为蓝色的特性，将分离的芽孢杆菌（或其他微生物）接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现的透明圈判断该菌是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
实验材料和用具土壤样品或其他富含淀粉质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、淀粉培养基平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等操作步骤分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5 ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种淀粉斜面培养基，再转接淀粉培养基平板，30-32 ℃培养24-48 h。
在平板上滴加稀碘液（或卢戈氏碘液）后测定水解圈直径与菌苔直径的比值。
2）水解圈大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
注意事项1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制。
2）点接淀粉培养基平板时，接种量及接种面积要基本相同。
2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。
实验 土壤中产淀粉酶菌株的筛选ppt课件
精选ppt
5
背景知识
精选ppt
6
实验1 土壤中产淀粉酶菌株的筛选（1）
精选ppt
7
实验目的
掌握菌种分离与筛选的方法 从土壤中筛选出能够合成分泌淀粉酶的微生物
精选ppt
8
实验原理
自然界微生物种类繁多，有些微生物能够以淀 粉作为碳源进行生长繁殖，这是因为它们能够 合成分泌淀粉酶。
当能合成淀粉酶的微生物在含有淀粉的固体培 养基中生长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围， 使菌落周围的淀粉水解成为小分子量的糊精、 聚糖和单糖。这些水解产物不能与碘作用，从 而在菌体周围形成透明圈。
精选ppt
12
精选ppt
13
分离
精选ppt
14
实验步骤
5.各组做好标记，置于30 ℃恒温培养48 h （倒置培养？？）
6. 产淀粉酶菌株的鉴定（下次课）
精选ppt
15
6. 产淀粉酶菌株的鉴定
瓶皿上（点植法：用接 种环在固体培养基表面接触几点），同时用签字笔 按对应顺序对各单菌落进行标号。
精选ppt
9
实验步骤
1. 筛选培养基的配制（已完成） 可溶性淀粉2 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨
10 g，琼脂20 g，水1000 mL。
2. 倒平板（每组6个，每个平板10mL左右）
精选ppt
10
实验步骤
3. 土样的采集
各实验室分别取三种不同环境的土样并记录当 时取样环境情况（1-2、3-4、5-6每两小组在同 一个地方进行取样），通常取离地面5～15cm 处的土壤。
菌落被挑起而不致破碎 菌落颜色多样，菌落正反面颜色常不一致 带有泥腥味
精选ppt
24
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。
淀粉酶产生菌的筛选实验小结
淀粉酶产生菌的筛选实验小结
本实验旨在筛选具有淀粉酶活性的菌株，经过活性药物筛选法，通
过对新鲜海藻类源淀粉酶活性药敏试验结果，用神经酰胺蓝显色法共
分离出了12株具有淀粉酶生成活性的菌株，且12株菌株的淀粉酶活
性均明显优于对照组的淀粉酶活性。
经过16s rDNA分析，结果表明，
这12株菌株属于嗜热及高温嗜热乳杆菌科，包括拟南芥病毒乳杆菌属、干燥乳杆菌属，伯氏乳杆菌属、钝吸乳杆菌属等。
以上结果表明，该
方法高效可靠，可以用于筛选具有淀粉酶活性的微生物菌株，为药物
的开发和应用提供了重要的理论支持。
实验土壤中产淀粉酶菌株的筛选
系列实验内容
实验1 土壤中产淀粉酶菌株的筛选 （1、2） 实验2 产淀粉酶菌株的诱变剂量选择 实验3 紫外诱变剂突变菌株的初筛 实验4 紫外诱变剂突变菌株的复筛 实验5 高产淀粉酶生产菌株的稳定性及淀粉酶
菌落被挑起而不致破碎 菌落颜色多样，菌落正反面颜色常不一致 带有泥腥味
思考题
1. 为什么要用淀粉作为碳源？ 2. 为什么同一个土样要稀释不同梯度进行涂
平板？
实验报告
本次实验与上次实验合写一份实验报告即可 实验报告在本周六实验课时上交
注意
每次实验课前5分钟由各实验室本次值日小组将实 验材料由准备室取出至各实验室中
环伸入皿中，划3-4条平行线 灼烧接种环，60°旋转平皿，划线（注意：后一
区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭 在一起） 灼烧接种环，将划线平板倒置，于30℃培养48h 后观察。
实验结果及分析
1. 取样环境情况 2. 记录产淀粉酶菌株数量（比透明圈？？）及对
菌落的初步鉴定结果 3. 分析：从不同地点获得的结果为什么会出现差
稀释
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
1g
10ml 10-1
9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
分离
实验步骤
5.各组做好标记，置于30 ℃恒温培养48 h （倒置培养？？）
6. 产淀粉酶菌株的鉴定（下次课）
6. 产淀粉酶菌株的鉴定
倒平皿（注意培养基状态、体积、表面平整）：3个 用接种环挑取单菌落到无菌瓶皿上（点植法：用接