纤维素酶研究进展及固定化技术

纤维素酶研究进展及固定化技术

摘要: 纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。传统上将其分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶属于糖苷水解酶类，近年来，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素酶结构的相似性，将其分成不同的家族。本文介绍了纤维素酶的研究进展，主要包括纤维素酶的性质及作用机理，应用与发展趋势，来源及生产技术，分离纯化方法，最后介绍几种常用的纤维素酶固定化方法。

关键词: 纤维素酶；研究进展；固定化

引言：

纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，随着在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业、能源工业上的应用，纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能，以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。到目前为止，登记在Swiss-Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条，基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代，迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达、纤维素酶的固定化，以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展。

1 纤维素酶的性质及作用机理

纤维素酶分子的大小因来源不同而不尽相同，三大类酶分子量一般在23Kda～146Kda之间。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解，而纤维素酶正是由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异，导致酶的多形式和分子量的差别。通过比较分析，人们发现许多不同纤维素酶间表现出一定的同源性，且纤维素酶分子普遍具有类似的结构。由球状的催化结构域(CD)、连接桥和纤维素结合结构域(CBD)三部分组成。(1)连接桥，可能是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体；(2)纤维素结合结构域，它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用，其结合纤维素的作用机理目前尚不十分清楚；(3)催化结构域，它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。尽管不同来源纤维素酶的分子量大小差别很大，但它们催化区的大小却基本一致。

研究表明，EG和CBH能引起纤维素的分散和脱纤化。纤维素酶通过打乱纤维素的结晶结构，使其变形，深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微型隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的微结晶，利于进一步被降解。（1），对纤维素分子的吸附作用：纤维素酶对纤维素的降解，一般首先吸附到纤维素上，但并不是吸附的越好催化效果约好。纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关，也与底物的特性密切相关。其吸附能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。此外，纤维素酶的吸附机理并未弄清，仍需做进一步研究。（2），单一纤维素酶的作用机制：纤维素酶的断键机理

遵循双置换机制。即作用部分的两个色氨酸参与基质结合，而处在将被裂解的键及相邻一个非离子化的甘氨酸和一个离子化的谷氨酸残基参与催化作用。这些残基被非极性化的侧链围绕，以促进质子转移，打断N一乙酰粘质酸一N一乙酰氨基葡萄糖酸。谷氨酸位于细菌和真菌CBH、EG和葡萄糖苷酶的催化位点已被人们证实，也有的纤维素酶中天门冬氨酸、组氨酸和精氨酸位于催化位点参与催化反应。（3），纤维素酶的协同降解机制三大类纤维素酶的作用存在协同作用。通常情况下，外切酶作用于不溶性纤维表面，使形成结晶结构的纤维素长分子链开裂，长链分子末端部分发生游离，从而使纤维素易于水化；内切酶则作用于经外切酶活化的纤维素的13—1、4糖苷键，产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖，13一葡聚糖苷酶再将纤维二糖、三糖等分解成葡萄糖。必须指出，该协同降解机制中各酶的作用不是绝对的，而且功能也不是简单固定的。

2 纤维素酶的应用与发展趋势

纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。自20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球脱毛以及增柔等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。

纤维素酶用于造纸工业，是利用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，提高纸张的光洁度。碱性纤维素酶用于洗涤剂工业，可以提高棉织物的洗净度，起主要作用的是内切酶(CMC酶)，是近些年来洗涤剂工业竞相开发的新酶种之一。这两种工业应用涉及的纤维素酶只需要纤维素酶系中的单一组分，基因工程技术可以在其中得到广泛的应用。

纤维素酶将来最大的用途，或者可以使其产量得到巨大增长的工业需求将是纤维素乙醇的开发。自上世纪70年代石油危机以来，世界各国都致力于开发新的可再生能源，而生物乙醇是被普遍看好的新型燃料。进入21世纪，利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗，引起了各国政府和研究机构的重视，这其中的关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低，因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶类，比活力至少要低1～2个数量级，如滤纸酶的比活力为1 IU／mg左右，CMC的比活力约为10 IU／mg ，从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题，也是纤维素酶研究的热点与难点。目前通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量，从而提高酶的发酵水平，如诺维信公司与美国能源部合作，将制造纤维素乙醇中的酶制剂成本由2001年的每加仑5美元降低到2004年的30美分，2005年又降低到每加仑18美分。还可以通过改善发酵条件和工艺，如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式，进而对其进行有效改造；或者通过筛选新的产酶菌种，发现具有开发潜力的新酶源。

总之，纤维素酶是目前糖苷酶类中惟一尚有大量亟待解决问题的酶，也是有着巨大工业和市场潜力的酶。进一步阐明纤维素酶的结构与功能，研究纤维素酶的基因表达与调控的关系；

针对不同工业需要研制不同组分比例的纤维素酶；提高纤维素酶水解天然纤维素的比活力；开发适应不同温度(低温或高温纤维素酶)的纤维素酶是当前纤维素酶的主要研究趋势。

3 纤维素酶的来源及生产技术

工业生产的纤维素酶主要由真菌产生，如木霉、青霉、曲霉以及腐质霉等。其中最著名的是T.reesei，它产生的纤维素酶具有酶谱全、活力高的特点。自20世纪60年代以来，从野生菌株T.reesei QM6a出发进行了大量的筛选育种工作，其中QM9414、RutC30和MCG77能够产生较高的内切型和外切型葡聚糖酶活力，是目前国内外生产酸性纤维素酶的主要菌种。腐质霉是中性纤维素酶的重要生产菌种；黑曲霉产生的纤维素酶可以用于食品工业；青霉除了产生大量的纤维素酶外还可产生较高的葡萄糖苷酶，可以弥补木霉产葡萄糖苷酶不足的缺点。细菌和放线菌等也能够产生纤维素酶，它们产生的纤维素酶往往具有耐碱耐热的特点，如洗涤剂工业用的碱性纤维素酶就是由嗜碱芽胞杆菌产生。细菌产生的纤维素酶除了传统的内切、外切纤维素酶外，还会分泌一种纤维小体(cellu-1osome)到胞外，纤维小体由多种纤维素酶和半纤维素酶组成，具有较高的水解纤维素的能力，在纤维废弃物的处理上具有很大的应用潜力。

纤维素酶的生产主要有液体和固体发酵两种形式。液体深层发酵(Liquid Submerged Fermen-tation，LSF)适于大规模工业生产，是目前国际上的主要生产方式，但发酵成本较高。固体发酵(Solid-State Fermentation，SSF)以农作物秸秆等纤维废弃物为主要原料，工艺简单，成本低廉，节约水源，目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采用固体发酵生产纤维素酶。然而固体发酵法也存在容易杂菌、产品质量不稳定等弊端。通过菌种改造以及发酵工艺的改进，T.reesei生产纤维素酶的能力得到了很大的提高。选择优良的菌种是提高纤维素酶活力的关键，但还需要有适当的生产方法和培养条件才能充分发挥优良菌种的性能，得到较高的酶产量。纤维素酶的生产历史比较短、规模比较小、酶活力也比较低，生产工艺需要进一步研究和完善。

3.1 纤维素酶固态发酵

固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。固态发酵具有许多独特的优势：（1），可使微生物保持自然界中的生长存在状态，模拟自然的生长环境，这是许多丝状真菌适宜采用固态发酵的主要原因之一。（2），产品的后处理过程简单，许多产品可以直接烘干而无需提取，产品宜于贮藏、运输，而且稳定性好。（3），固态发酵过程中，由于没有废水的产生，因此，没有环境污染问题。（4），在需要大量供氧的固态培养时，空气通过固体层的阻力较小，能量消耗小。传统的的固体培养方法包括薄层的曲盘培养、帘子培养和厚层的通风培养等。生产上常用的是厚层通风培养，亦称厚层通风曲或箱曲，设备比较简单，易于推广，但容易污染杂菌，温度和湿度不易控制，大规模生产难于稳定。现代固态发酵是在密闭容器的固态发酵反应器中进行，采用单一菌株纯种或限定菌株混合发酵，扩大了固态发酵的应用范围，适宜于分离纯化高附加值产品，但同时增加了操作能耗，设备投资较大，需要无菌处理发酵原料。根据固态发酵反应器形态可分为9种类型的固态发酵反应器：转鼓式；木盒式；加盖盘式；垂直培养盒式；倾斜接种盒式；浅盘式；传送带式；圆柱式；混合型式。而以基质的运动情况则可以分为两类：静态固态发酵反应器，包括浅盘式和塔柱式反应器；动态固态发酵反应器，包括机械搅拌的简、柱式、转鼓式反应器等。

纤维素酶固态发酵过去主要采用传统酿酒制曲工艺技术。纤维素酶固态发酵影响因素主要有

以下几个：（1）基质：用于纤维素酶生产的固态基质主要是含纤维素的麸皮、麦草、农作物秸秆等，它们当中还存在纤维素酶基因表达的诱导物质。天然植物纤维性物质因含有木质素，直接生物利用相对困难。汽爆处理的纤维质原料，特别是草类原料，木质素已部分被降解，是很好的固态产纤维素酶的基质。（2）培养基：含水量及空气湿度水是发酵的主要媒介，纤维素酶固态发酵基质含水量与水分活度有关，影响到真菌的生长状态水分含量还影响到底物的物理状态营养物质、氧和二氧化碳的扩散等，基质含水量因菌种及原料而异。（3）通气：合成纤维素酶的真菌是好氧菌，菌丝生长过密会增加气体流动阻力，也影响水分的蒸发。在培养料中添加滞留水能力强的基质或增加空气的湿度可避免强制通风引起的水分过分损失。（4）温度：固态基质热传导性差，导致热量对流及传热效率低下，加大通风，加快水分的蒸发可有效地带走发酵产生的热量。（5）固体基质粒度：小颗粒能增加比表面积，空气更容易进入颗粒内部，也增加了容积密度，但颗粒过小使通风变得比较困难。

总体而言，目前固态发酵技术相对落后，但因为投资少、生产成本低、工艺简单等原因在许多发展中国家得到较多的应用。目前固态发酵存在的主要问题是缺乏自动化、成本低的经济高效固态生物反应器，发酵过程操作粗放、劳动强度大、容易染菌。而目前机械化的固态生物反应器往往具有自动化程度不高、结构不够合理、使用不够方便、成本相对较高等缺陷，远未达到经济实用的程度。现代发酵工业的发展方向是高浓度、高黏度发酵液。而高浓度、高黏度的极限就是固态发酵基质。因此，新型固态发酵是今后的发展方向。

3.2 纤维素酶液体深层发酵

液体深层发酵使用液态培养基，一般在强化传质和传热的发酵罐中进行。发酵罐形式主要有通用式搅拌罐和气升式发酵罐。操作方式主要有分批培养、补料分批培养和连续培养等方式。通用式搅拌罐是最常用的罐型，技术成熟，容易控制；但机械搅拌耗能较高，采用过快的搅拌速度还会损伤菌丝，影响酶的产量。气升式发酵罐依靠气体带动液体循环，没有搅拌装置，结构相对简单，设备成本也低一些，但通气量一般大于搅拌罐，并且容易产生泡沫。就操作方式而言，分批培养最简单，不易染菌，是常用的操作方式。缺点是产酶时间较短，辅助时间占较大比例，降低了生产效率。补料分批培养具有分批培养容易控制的优点又延长了产酶时间，是比较理想的操作方式。连续培养生产效率高，生产期长但易染菌，相对难以控制，工业上应用较少。纤维素酶主要在细胞生长的中后期产生，而在连续培养中由于细胞一直处于旺盛生长状态，不利于纤维素酶的生产。因此，连续培养生产纤维素酶主要用于固定化细胞产酶。

产生泡沫是纤维素酶液体深层发酵的问题之一，对于气升式发酵罐而言问题更加严重。泡沫的产生主要有三个原因：（1）泡沫是由培养基中含有的蛋白质引起的；（2）这部分蛋白质与纤维素结合时，产生了稳定的泡沫，很难处理；（3）在发酵过程中产生的大量可溶性蛋白质，主要是纤维素酶，也是引起泡沫的一个原因。泡沫严重时，出现”逃液”现象，使产物流失，并导致染菌，同时大量的泡沫会使酶变性，降低产量。通常的泡沫控制方法是采用间歇式补加消泡剂来抑制泡沫的产生，但加入消泡剂也有负面影响，不利于氧的溶解和酶的分离纯化。因此，采用机械装置进行消泡是另一个选择，但这样会增加设备的复杂性和设备成本。

相对于固态发酵，液体深层发酵的主要优点是技术成熟，自动化程度高，培养条件容易控制，不易染杂菌和设备通用性强。主要缺点：（1）能耗大，不仅搅拌能耗大而且供氧的空气需要克服很深的液层压力，消耗很大能量；（2）培养基中原料允许浓度低，高的也只有百分之十几，低的为百分之几，甚至更低，致使产物浓度低，产品分离纯化困难，发酵和分离设备体积常庞大；（3）机械搅拌对细胞易造成损伤，培养基非牛顿流体力学特性及过多的固体纤维素引发的氧传质限制直接影响了产酶菌株的生长代谢，对于搅拌式发酵罐而言，通过调整搅拌转速和通气量可以调节溶氧量，但有文献报道，过高的搅拌对纤维素酶产率和酶活有负面

影响；（4）液体发酵产生的废液数量很大，对环境的污染十分严重，目前发酵废液的治理已成为发酵工业的重大问题。针对上述缺点，可以改用气升式反应器以克服通用发酵罐的能耗高、搅拌对细胞的损伤使用补料培养，增加底物浓度和产物浓度，使用发酵和分离过程耦合的装置，简化分离的生产成本，使用庞大的生化污水处理装置以解决发酵废液对环境的污染等方法改善发酵工艺。

4 纤维素酶的分离纯化

纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生产纤维素酶的粗酶制剂常采用酒精沉淀法、丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。但在纤维素酶分析研究上主要采用一系列蛋白质分离纯化技术，如分级沉淀、色谱法、电泳法等。目前，对粗酶的提取大多采用硫酸铵分级沉淀法；对酶活力的测定国际上一般采用Horikoshi方法；对蛋白质的测定按考马斯亮蓝(Bradford)法，还原糖的测定采用3, 5一二硝基水杨酸(DNS)法。以下介绍一些常用的纯化方法：

4.1 盐析法

盐析法就是在溶液中加入中性盐使各种蛋白质依次分别沉淀的方法。其原理是根据蛋白质在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子相互作用，所以能保持溶解状态，当加入盐离子时，蛋白质分子周围所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用，使溶解度增加，此现象称为盐溶。在盐浓度较低时以这种情形为主;但当盐浓度继续增加达到一限量，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀下来，称为盐析。选择一定浓度范围的盐(如0~25%饱和度硫酸铵)使杂质蛋白沉淀而有效成分呈盐溶状态，经离心分离得到上清液后，再选择一定浓度范围的盐溶液使有效成分等物质呈盐析状态而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。此法是蛋白质进行分级沉淀时常用操作步骤，常选用的盐是硫酸铵。

4.2 凝胶过滤

凝胶过滤又叫分子筛层析，是利用分子筛效应分离纯化生物大分子和测定其分子量及样品脱盐的一种色谱方法。凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致的球状颗粒。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子物质，而不能排阻某些小分子化合物。当样品进入色谱柱时，由于被分离物质的分子质量不同，较大的分子不能通过孔道进入凝胶颗粒的微孔内部，与流动相一起先流出色谱柱；分子质量小的物质可通过部分孔道，更小的分子可通过任意孔道进入珠体内部。这样小分子向下流动的速度必然比大分子慢，结果是分子质量大的物质先从柱中流出，分子质量小的则后从柱中流出而达到分离的目的。凝胶过滤具有设备简单、操作方便、重复性好及样品回收率高等特点所以该方法除了常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可以测定蛋白质的分子量、样品浓缩和脱盐等方面。

4.3 亲和层析

亲和层析的原理与抗原-抗体、酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力，在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力。将具有识别能力的载体L以共价键的方式固化到含有活性基团的基质M上，制成亲和吸附剂M-L，又称为固相载体。当把固相载体装入小层析柱后，将欲分离的样品液通过该柱，此时样品中对配体有亲和力的物质S可借静电引力、范德华力等作用吸附到固相载体上，无亲和力的

物质被起始缓冲液洗涤出来，形成了第一个层析峰，然后适当地改变起始缓冲液的pH或增加离子强度等方法，把物质S从固相载体上解离下来，并形成第二个层析峰，可以将有效成分与杂质较好地分离开来。使用亲和层析法，不论加入何种样品液，由于柱体积小、上样量大、洗脱流速快等原因，都只能得到一个层析峰，所以分辨率高。本法广泛应用于分离纯化蛋白质、核酸、激素等物质。

4.4 离子交换层析

离子交换层析是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的方法。离子交换剂以纤维素、葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体，通过醚化或氧化等化学反应，引入阳性或阴性离子的特殊制剂，可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。对于呈两性离子的蛋白质、酶类等物质与离子交换剂的结合力，取决于它们的物理化学性质和特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，被阳离子交换剂吸附；反之被阴离子交换剂吸附。对于呈胶体状态的大分子物质一般使用选择性好的弱酸性离子交换剂。离子交换层析法是常用的层析方法之一，广泛应用于多种生化物质的分析、制备、纯化等。

4.5 高效液相色谱(HPLC)

又称为高速或高压液相色谱，其分离或纯化各种化合物的原理基本上与普通的液相层析相似。但高效液相色谱具有灵敏、快速、分辨率高及重复性好等特点，不仅适用于很多不易挥发、难热分解物质(如蛋白质、氨基酸及其衍生物、核酸、激素、单糖、寡糖等)的定性和定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。特别是近十年来出现了几种与HPLC相近的快速蛋白液相色谱(FPLC)、低压液相色谱(LPLC)和中压液相色谱(MPLC)，其中FPLC能在惰性环境下，以极快的速度通过成百上千次层析把复杂的混合物分开，如果连续进样，短时间内能制备出大量的欲纯化物质。

4.6 电泳

电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。当把一个带净电荷的颗粒放入电场时，就会受到电场力的作用，带电颗粒在电场中向一定方向泳动，速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和豁度成反比。当颗粒是两性电介质性质的蛋白质分子时，它在一定pH溶液中电荷量是独特的。由于不同的蛋白质等电点和分子量是不同的，因此经泳动后就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，可以将混合液中不同的蛋白质区分开，同时也可以对其纯度进行测定。现在电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究的必不可少的常规工具。

5 纤维素酶的固定化

纤维素酶可用于将纤维素转化为可发酵糖，进而生产燃料乙醇。由于天然纤维素酶多为一次性直接使用，使用成本高，阻碍了该转化过程的工业化。采用纤维素酶的固定化，有利于酶的回收和再利用，有望解决该酶生产应用的实际问题。固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在：首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。固定化酶的制备方法分为载体结合法、包埋法、交联法3种。以下介绍一些常用的纤维素酶固定化方法：

5.1 肠溶衣聚合物固定化纤维素酶

该法选用国内固定化酶方面研究较少的EudragitL-100为载体，采用物理吸附法，制备出具有可溶-不可溶性质的固定化纤维素酶。肠溶衣聚合物是一类固定化酶效果很好的S-IS载体，S-IS载体是指随着着溶液某个特定条件如pH值、温度的变化，或加入了某种金属离子，其溶解性质会改变的聚合物。这种载体克服了不溶性和可溶性载体存在的缺点，可以在可溶状态进行水解反应，在不可溶状态下方便回收。Eudragit是一种包括甲基丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸酯共聚物的肠溶衣聚合物，由于其结构中含有羧基，在水中很容易与碱生成盐而溶解。Taniguchi等人曾将其用于固定淀粉酶，蛋白酶等种类的酶。目前，国内利用Eudragit作为固定化酶载体的研究未见报道，国外近几年利用其固定化纤维素酶的报道也比较少。根据纤维素酶水解反应的特点，选择EudragitL-100作为固定化酶的载体，采用物理吸附法固定化纤维素酶，研究固定化酶的溶解度性质及稳定性、最适pH值、最适反应温度、表观米氏常数、离子强度对酶活力的影响等理化性质。

固定化方法：将一定量的酶液加入到5mL EudragitL-100溶液中，混合均匀，恒温放置一段时间后，边搅拌边滴加1 mol／L乙酸，至(pH=4．0左右)树脂基本沉淀下来，溶液呈现一种不溶解状态，静置20min，离心(4000g×10min)，取出上清液，沉淀用0．01 mol／L，pH=4．0醋酸盐缓冲液冲洗，最后溶解在pH 5．8，0．1 mol／L醋酸盐缓冲液中，定容至8mL。由此得到的就是固定化酶溶液。

实验结论：固定化酶的溶解度变换条件是：pH≥5．0时，呈可溶性；pH≤4．0时，呈不可溶性。固定化酶的稳定性较好，重复利用4次后，酶活力保留值在65％以上。比较了固定化酶和游离酶的最适反应条件和动力学常数的大小。以2％的滤纸为底物(15FPU／g底物)，固定化酶水解反应的效果比游离酶好。

5.2 利用高分子复合物固定化纤维素酶

高分子复合物具有一些特殊功能，如优良的质量传递性能，对水、电解质的灵敏介电特性，对氧和水的选择透过性以及对生物的相容性等特性，为生物酶的固定化技术提供了一种新型载体。

固定化方法：取2ml0.4molPMAA溶液，滴入2ml纤维素酶，搅拌1小时，再滴入0.4mol 高聚物，搅拌2小时，过滤，抽干，得固定化酶。使用聚丙烯酰胺、聚乙烯胺、聚丙烯酰肼分别和聚甲基丙烯酸复合，这三种高分子复合物固定纤维素酶，制得的三种固定化酶都能使酶获得较大的稳定性，使它们能在较广的pH范围内，较高的温度下发挥较大的作用，并能贮存，反复使用，这为今后固定化酶的工业化生产开辟了广阔的前景。

5.3 基于聚乙烯醇／Fe2O3纳米颗粒的纤维素酶固定化

聚乙烯醇(PV A)是一种富含羟基的水溶性高分子化合物，能与含羟基物质产生物理交联作用。经过反复冻溶后，PV A与富含羟基的纤维素酶(纤维素酶的中间部位含有相对密集的、带有羟基的丝氨酸和苏氨酸以及多糖)可形成柔性连接固定；同时，PV A丰富的羟基对纤维素酶也起着良好的稳定作用。纤维素酶的水解效率常与纤维素酶的吸附和解吸附有关，水溶性载体固定化纤维素酶在催化时常大量地被牢牢吸附在纤维素残基表面，影响了固定化酶的效力和重复作用。Fe2O3纳米颗粒具有高表面能等特性，能较好地固定PV A和纤维素酶等高分子物质。同时，如果水溶性载体中含有Fe2O3，纳米颗粒将有可能使固定化酶具有超顺磁性，从而在磁场的作用下与纤维素残基分离。针对上述固体载体使酶效率低下、水溶性载体又使纤维素酶与纤维素残基难以分离的难题，采用PV A／Fe2O3，磁性纳米颗粒作为固定纤维素酶的载体，通过反复冻融的方法，在形成复合载体的同时利用物理交联作用将纤维素酶固定，并对固定化酶的特点和固定化效果及一些影响因素进行分析，以期提供一种固定化纤维素酶

的新方法。

固定化方法：物理交联固定化纤维素酶取一定量透析平衡的Fe2O3纳米颗粒，加入含质量分数0．5％PV A的25 mg/mL纤维素酶液中，于4℃下搅拌10 h，再于-60℃快速冷冻，冰上解冻，反复冻融2次，加入NaC1(终浓度为0．5 mol／L)沉降，用磁铁吸附分离后，用超纯水多次冲洗，冷冻干燥，于4℃保存。若用于纤维素酶的检测，用0．05 mol／L pH=4．5的柠檬酸钠缓冲液分散溶解。

以聚乙烯醇/ Fe2O3磁性纳米颗粒为纤维素酶固定化载体，通过反复冻融的方法成功地实现了纤维素酶固定化。采用透射电镜、红外光谱仪、振动样品磁强度计对固定化酶复合体进行了表征，结果显示，固定化酶复合体为大小约1 μm的微凝胶团，内含10 nm左右的Fe2O3纳米颗粒。研究影响固定化因素后发现，当pH为6，固定化时间为11 h，纤维素酶／PV A 质量比为4，PV A／Fe质量比为50时，固定化纤维素酶效果最好。通过该方法固定后酶活回收率达42％，酶水解效率显著提高，经过5次反应后的固定化酶相对酶活力保留50％以上。因此，基于聚乙烯醇／Fe2O3。纳米颗粒的纤维素酶固定有利于酶的循环使用并显著提高酶的使用效率，是一种有效固定化纤维素酶的新方法。

5.4 壳聚糖固定化纤维素酶

随着固定化酶技术的发展，越来越多的研究者致力于对纤维素酶固定化的研究，但是应用交联法固定化纤维素酶的报道很少。采用壳聚糖交联法固定化纤维素酶，研究戊二醛浓度和给酶量对固定化酶活性的影响，以及固定化酶的最适温度、pH值、Km。结果表明，交联法得到的固定化纤维素酶与游离酶相比具有很多优点，对运用于工业生产具有重要意义。

固定化方法：称取一定量的40目壳聚糖，加入一定浓度的戊二醛，室温下搅拌3h，4℃冰箱静置过夜，反复水冼并抽滤，然后往交联后壳聚糖中加入一定量的纤维素粗酶液，室温下搅拌2 h，然后放置4℃，冰箱过夜。次日，充分水洗并抽干即得固定化纤维素酶。

利用固态发酵法从瑞氏木霉QM9414发酵液中提取了纤维素粗酶液，将其固定在壳聚糖上，结果表明，游离酶液中的蛋白质含量为33．33 ug／mL，酶活力为120 IU／mL。当0.1g载体与5 mL 6 %的戊二醛固定纤维素酶后酶的活力最好。这是因为当壳聚糖的量一定时，其提供给酶的结合位点是一定的，随着给酶量的增加，其结合位点趋于饱和，因而制得的固定化酶活力随着酶量的增加而增大，当结合位点饱和以后，增加给酶量却不增大酶活力。固定化酶的最适温度为6O℃，而粗酶液为5O℃，粗酶液的最适pH为5，固定化酶的最适pH 为4，这表明固定化纤维素酶的活力受环境因素如pH、温度等的影响，固定化酶的最适pH 向酸性方向移动，而最适反应温度比游离酶高。固定化酶的这种特性有利于工业生产中的酸性环境以及高温环境，有利于提高生产效率和酶的利用率。固定化酶的Km值3．592 01×10-2 ，粗酶液的Km值为4．076 04×10-2，表明纤维素酶经固定化以后，与底物的亲和力有所增加，固定化酶的理化性质相对游离酶来说得到了改善，这对提高反应速度是有利的。

5.5 纤维素酶在甲壳胺上的固定化

甲壳胺(2-氨基-β-1，4-葡聚糖)主要是从蟹、虾等甲壳动物外壳中提取的一种氨基多糖。福建地处沿海，甲壳胺的资源丰富，它的开发利用已引起有关部门重视。甲壳胺具有耐热、化学性质稳定、机械性能良好等优点。特别是其分子中的氨基，既易于与酶共价结合，又可络合金属离子，使酶免受金属离子的抑制，所以它是一种固定化酶的良好载体。据报道，国内外已有人用甲壳胺固定了脲酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶、碱性磷酸酶、胰蛋白酶等。

固定化方法：取一定量湿甲壳胺加入一定浓度的戊二醛，室温搅拌3.5h，静置2h后抽滤。滤物用水洗至中性，以除去残余戊二醛，在交联后的甲壳胺载体中加入一定量纤维素酶溶液，室温下缓慢搅动2h，置于4℃冰箱过夜。次日离心弃击上清液，水洗三次后得固定化纤维素

酶。该固定化酶在近两个月的数十次检测中未见酶活力下降，说明该固定化酶的贮存稳定性和重复操作性均较好，可望为今后工业化酶法分解纤维素为葡萄糖提供有价值的参考资料。

结论：

总之，纤维素酶是目前糖苷酶类中尚有大量亟待解决问题的酶，也是有着巨大工业和市场潜力的酶。进一步阐明纤维素酶的结构与功能，研究纤维素酶的基因表达与调控的关系；针对不同工业需要研制不同组分比例的纤维素酶；提高纤维素酶水解天然纤维素的比活力；开发适应不同温度(低温或高温纤维素酶)的纤维素酶是当前纤维素酶的主要研究趋势。