副溶血性弧菌血清型致病力及分子分型研究

副溶血性弧菌血清型致病力及分子分型研究[摘要] 目的了解四川地区2009年副溶血弧菌食物中毒疫情分离株和监测食品样品分离菌株菌型分布、致病力及分子分型特征，为四川地区副溶血性弧菌疾病防治提供科学依据。

方法采用血清玻片凝集试验对2009年从食物中毒疫情和常规监测食品中分离的副溶血孤菌菌株进行血清分型、应用PCR方法进行耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接溶血素相关基因(trh)的检测、小鼠腹腔注射进行致病力实验和进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析等。

结果40株菌分属于5个血清群，疫情分离株分属于O3和O4群，监测分离株主要为O1群占43.75%（7/16），其中2起疫情分离到多个血清型的菌株；所有菌株trh基因均为阴性，其中20株携带tdh毒力基因，携带tdh毒力基因和不携带tdh、tlh毒力基因的菌株均有致病力。

40株菌通过PFGE分型，共得到29个带型，同一疫情分离株具有多个PFGE型别。

. 结论四川省食品分离株和暴发疫情无太多联系，食品分离株血清型和PFGE型别呈多样性。

对于从同一起暴发疫情中检出的不同血清型和不同PFGE型别的副溶血性弧菌需要确认各菌株与暴发的关系。

副溶血性弧菌作为一种常见食源性致病菌，其引起的食物中毒事件在全世界均有报道，但主要集中在东南亚各国和美国，而欧洲少有报道［1］。

主要是由于这些国家和地区临海，海产品摄入量多，导致副溶血性弧菌感染高发。

据报道,自1998年以来,我国微生物性食物中毒的病原分布发生了显著的变化，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位，主要发生在中国沿海区域。

然而，随着人民群众生活水平的不断提高，食品流动频繁，内陆地区也经常见副溶血性弧菌引起的食物中毒疫情报道［2、3］。

四川省近年来也陆续发生副溶血性弧菌引起的食物中毒疫情，本研究对四川省2009年发生的3起由副溶血性弧菌引起疫情的23株分离株和从省内各超市、农贸市场水产品样本中分离的17株副溶血性弧菌进行了血清学分型实验、毒力基因检测、脉冲场凝胶电泳分子分型，挑取部分临床来源和食品来源的菌株进行致病力实验、以了解四川地区副溶血性弧菌特征，为预防和控制由副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供科学依据。

1 材料与方法1.1菌株来源23株食物中毒副溶血弧菌由四川省攀枝花市疾病预防控制中心及四川省达州市疾病预防控制中心于2009年5—11月从3起食物中毒中分离获得；17株食品样本中副溶血弧菌从全省各地市售的水产食品中分离获得(表1)。

1.2 菌株血清分型副溶血弧菌11种0分型血清、9种K多价及65种K单价分型血清为日本Denka Seiken公司。

1.3 细菌基因组DNA的提取挑取菌株过夜培养物于100ul重蒸水中，100℃水浴10min，10000转离心10min，取上清夜作为DNA模板。

1.4．tdh和trh的检测tdh、trh引物参考文献[4]。

tdh上游引物：5 一CCA CTA CCA CTC TCATAT GC一3 ；下游引物：5 GGT ACT AAA TGGCTG ACA TC 3 。

trh 上游引物：5 一GGC TCAAAA TGG TTA AGC G一3 ；下游引物：5 一CAT TTCCGC TCT CAT ATG C．3 ，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应条件为：94℃5 rain；94℃30 S，58℃30 S，72℃60 s，35个循环；72℃4 rain。

tdh、trh扩增产物预期长度分别为251 bp、250 bp。

1.5、致病力实验：将副溶血弧菌接种到普通营养肉汤，培养18—24 h，每株菌液接种4只健康小白鼠，雌雄各2只，每只小自鼠腹腔注射0.3 ml，对照组接种无菌3%NaCl碱胨水，72h内观察小鼠死亡情况，试验小鼠体重为18-22g。

小鼠死亡后，解剖小鼠，取其脾脏横切面涂抹TCBS平板接种培养。

1.6 PFGE分子分型实验取新鲜琼脂培养物集菌均匀悬浊于1ml细胞悬液(100mMTris-HCL[pH值8.0]，100 mM EDTA [pH值8.0])中，调节浓度，使其OD值为4.0～4.2。

取400µl 菌悬液37℃孵育5 min,分别加入蛋白酶Ｋ20µl（储存液浓度为20mg/ml）至终浓度0.5mg/ml,再与等体积1% Seakem Gold琼脂混合,加入模具。

在室温下凝固后取出胶块加5ml细胞裂解液(50mM Tris[pH值8.0]，50 mM EDTA[pH值8.0]，加1%十二烷基肌氨酸钠)和25µl蛋白酶Ｋ(终浓度0.1mg/ml)，混匀，54℃水浴轻摇2h，转速约170rmp。

预热DDH2O 50℃水浴15min 洗胶块2次，预热TE 50℃水浴15min洗胶块4次。

切2mm胶块加入195µl酶切缓冲液中，再加入5µl NotⅠ，37℃酶切3h。

酶切好的胶块粘在梳子上制胶、电泳，电泳时泵设为70，电泳温度14℃，电压梯度6V/cm，脉冲时间12.55s～30.82s，电泳时间19h。

0.1µg/ml EB 染色30min，纯水中脱色30min，凝胶成像仪上读取图像[5]。

1.7 聚类分析方法使用BioNumerics（Version 5.10）数据库软件（Applied Maths BVBA，Belium）进行聚类分析，方法采用UPGMA（Unweighted Pair group Method using Arithmetic averages），聚类相似性系数(距离)采用的是基于条带比较的Dice。

Dice=2×N(N+M)，式中N 表示能匹配的条带的个数，M表示所有条带的个数(2个菌带型上的条带个数总和，再减去匹配的条带个数)。

根据聚类结果，按不同菌株的相似性系数进行分型，小于90%的定为不同的型，大于90%而小于100%的为不同的亚型，相似系数等于100%的不同菌株为同一亚型。

2 结果2.1 副溶血性弧菌血清分型所有40株菌分属于O1、O2、O3、O4和O10共5个血清群，暴发疫情分离株分属于O3 、O4群和O10群，食品监测分离株主要为O1群占43.75%（7/16），其次为O10、02和O3，共检出14个血清型，有4株菌无法定型。

暴发1和暴发3两起疫情均分离到不同血清型的菌株，仅暴发2分离菌株为单一血清型O4:K63。

17株食品监测分离株有9个血清型，其中有一株自凝菌，2株无法定型菌株，无优势血清型，呈现血清型多样性(表1)。

2.2 副溶血性弧菌毒力基因检测对从暴发疫情和食品监测中分离的40株副溶血性弧菌进行tdh 和trh基因扩增。

结果显示共21株菌携带tdh毒力基因，23株暴发疫情分离株中有17株携带tdh 毒力基因，占73.91%，有4株疫情可疑食物和2株患者分离株未检出tdh毒力基因，17株食品监测分离株中有4株携带tdh毒力基因，占23.53%；所有菌株均未检出t rh 毒力基因。

(表1)。

2.3 副溶血性弧菌致病力实验结果从疫情患者、疫情可疑食物和食品监测分离株中分别随机取未携带tdh毒力基因和携带毒力基因的菌株共8株进行小鼠腹腔注射，结果显示对照组4只小鼠均未死亡，从患者、可疑食物、监测食品中分离的携带tdh毒力基因和未携带毒力基因的所有菌株均能对小鼠致死（表1）。

2.4 副溶血性弧菌PFGE分子分型结果40株菌PFGE 酶切条带分子量约在25kb ～1200kb之间，酶切条带主要集中30kb ～700kb。

经XbaⅠ酶切，脉冲场凝胶电泳后，均能分出可分析的条带，条带数为12 ～19，将图像的数据导入BioNumerics5.0，40株菌共分为29个PFGE型别，见表1、图1、图2和图3。

暴发疫情和食品分离菌株之间无相同PFGE 型别。

食品分离株之间也无相同PFGE型别。

暴发疫情 1 从患者分离的相同血清型菌株2009ZD001至2009ZD004 属于同一PFGE型别。

暴发疫情2 从患者和从食物中分离的8株相同血清型的菌株分属4个PFGE型别，从患者分离的2009ZD006至2009ZD010共5株菌属于同一PFGE型别，而从3个可疑食品样本中分离的菌株2009ZD011、2009ZD012和2009ZD013分属于3个PFGE型别。

暴发疫情3 分离的3株O4：K8菌株分属2个PFGE型别，3株O4：K9菌株也分属于2个PFGE型别，3株O10：K？血清型菌株属于同一PFGE型别。

3 讨论副溶血性弧菌至从首次分离至今已发现有13 种O 血清群和65 种K 血清型，其中已知与人胃肠炎有关的O 与K 的组合已超过84 种[6]。

2009年四川副溶血性弧菌食物中毒株的主要血清型为O3∶K6、O4：K8和O4：K9，而水产食品株无优势血清型，占较高比例的是O1群。

表明食物中毒株与水产食品株血清型不一致。

此结果与文献[7～10 ] 报道的一致。

2009年四川3起暴发疫情中除了暴发2分离到相同血清型菌株，暴发1和暴发3均分别分离到不同血清型的细菌，尽管这些血清型都是已经被证明能引起人类胃肠炎的副溶血性弧菌，但是具体到某一起暴发疫情，并不能说分离到副溶血性弧菌都是引起同次暴发的病原体，某些血清型菌株的分离在某次暴发中可能只是一次独立于暴发的感染事件，其感染源与暴发感染源可能并不相同。

而且，血清分型实验简易快速，在进行流行病学调查的时候，血清学分型能首先将分离到的菌株进行表型区分，因而在暴发调查中病原体的血清学分型是必要的。

如2009年四川的暴发疫情1和暴发疫情3均分离到不同血清型的菌株，暴发疫情1 患者的血清型一致，而可疑食品分离株血清型和患者不一致，说明此可疑食物不是引起此次疫情的原因食物，因此仅从血清型便能确诊感染源和暴发源不同。

但是，如果要进一步确证菌株与暴发疫情的关系，仅有表型区分是不够的。

需要一种灵敏度高、分型力和重复性都很好的分型方法来用于进行确诊，PFGE方法由于其自身的优势而被广泛应用于暴发追踪溯源。

PFGE 是基于菌株的DNA指纹原理来确诊暴发菌株之间的关联、传染源及传播途径, 目前已广泛应用于分析不同来源菌株是相关的暴发还是无关联的散发[11]。

如2009年四川暴发疫情2 从患者和从食物中分离的8株副溶血性弧菌都是属于同一血清型，却分属4个PFGE型别，5名患者分离株PFGE型别一致，说明为单一污染物，但是5名患者分离株PFGE型别和3株从3份可疑食品分离株PFGE型别不同，说明3份可疑食品中分离的菌株和暴发均无关，需要进一步全面采集可疑食物确认暴发源。

2009年四川40株副溶血性弧菌共有23株菌携带tdh基因，所有菌株均不携带trh基因。

一些研究表面携带tdh 和trh 基因或者两者之一的菌株被认为是产毒株[12]，进而根据菌株是否具有tdh或trh毒力基因来判断菌株是否具有致病性，然而，现有研究得出副溶血性弧菌致病性源于侵袭性、溶血素和脲酶[13]等。