副溶血性弧菌检验
副溶血性弧菌检验
01
02
03
采用适当的生物安全防护措 施，如穿戴防护服、戴手套
、口罩等。
对实验废弃物进行妥善处理 ，防止交叉污染和环境污染
。
04
05
定期对实验室进行生物安全 检查，及时发现并消除安全
隐患。
废弃物处理与环保要求
建立废弃物处理制度，对实 验废弃物进行分类收集和处 理。
04
遵守环保法规和相关标准， 确保实验室废弃物处理符合 环保要求。
副溶血性弧菌检验
汇报人：XX
• 引言 • 病原学特性 • 检验方法与步骤 • 临床意义与解读 • 实验室质量控制与安全管理 • 研究进展与展望
01
引言
目的和背景
了解副溶血性弧菌的 生物学特性及致病机 制
提高对副溶血性弧菌 感染的防控意识和能 力
掌握副溶血性弧菌的 检验方法和诊断标准
副溶血性弧菌概述
对实验人员进行定期培训 ，提高其专业技能和质量 控制意识。
对实验仪器进行定期维护 和校准，确保其处于良好 状态。
对实验数据进行统计分析 ，及时发现并解决问题。
采用标准化的实验方法和 操作程序，减少实验误差 。
生物安全管理与防护
对实验人员进行生物安全培 训，提高其生物安全防护意
识。
建立生物安全管理制度，明 确实验室人员的食品卫生管理，防止海产品污染；避 免食用未经煮熟的海产品；加强个人卫生 习惯，饭前便后洗手；对于食品加工人员 ，应定期进行健康检查，防止带菌者污染 食品。
05
实验室质量控制与安全管理
实验室质量控制措施
建立完善的实验室质量管 理体系，包括质量手册、 程序文件、作业指导书和 记录等。
抵抗力与传播途径
抵抗力
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
副溶血弧菌检验标准方法免疫荧光法
`B66食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法连云港市产品质量监督检验所 发布DB32/TDB32/T -2010前言本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的免疫荧光镜检快速筛查法。
本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。
本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。
本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。
本标准主要起草人：周翔本标准于2010年8月首次发布。
食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法1 范围本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫荧光快速筛查检验方法。
本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。
本标准检出限为 10 CFU/g2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 20001.4-2001 标准编写规定实验原理荧光抗体染色是荧光显微镜标本上的抗原—抗体反应和荧光结合第二抗体反应。
必须制成镜检标本。
作为检测抗原目的标本片，细菌检样作成单层。
夹心法，即用未标记的特异性抗原加在玻片上先与菌体中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而在荧光激发下间接地显示出菌体中抗体的存在。
3 设备3.1 拍打式均质器。
3.2 电动试管振荡器。
3.3 低温高速冷冻离心机（25000r/min）3.4 全自动加液器（10~1000μl）3.5 天平（0.1g）3.6 直落式荧光显微镜3.7 水套式培养箱3.8 冰箱（0~8℃）3.9 湿盒3.10 20ml一次性注射器3.11 无荧光盖玻片3.12 无荧光载玻片3.13 洗片缸3.14 标本缸（存放实验片待灭菌）3.15 高压灭菌器4 试剂4.1 副溶血型弧菌羊抗血清4.2 兔抗羊荧光抗血清4.3 甲醇4.4 无荧光丙三醇（甘油）4.5 PBS缓冲液4.6 无菌高纯蒸馏水（无荧光）4.7 次氯酸钠消毒液4.8 封片甘油：无荧光甘油9份，pH7.2 PBS 1份5 样品制备5.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。
副溶血性弧菌检测
副溶血性弧菌的分布与传播
分布
副溶血性弧菌主要分布在近海岸的海 水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中 ，尤其在温带和亚热带地区的沿海水 域更为常见。
传播
副溶血性弧菌主要通过食用被污染的 海产品，尤其是生的或未煮熟透的鱼 、贝类等传播给人类。此外，也可通 过直接接触带菌的水或食物传播。
副溶血性弧菌的致病性
结果报告
根据检测结果，撰写并提交检测报告。
04 副溶血性弧菌检测的应用 与意义
在食品安全领域的应用
食品生产过程监控
副溶血性弧菌检测是食品安全监 控的重要环节，用于确保食品在 生产、加工和储存过程中的卫生
安全。
食品质量评估
通过检测食品中副溶血性弧菌的数 量和种类，评估食品的质量和安全 性，确保消费者健康。
提供科学决策依据
副溶血性弧菌检测数据可为政府和相关部门提供科学决策依据，促进 食品安全、环境保护和公共卫生领域的政策制定和实施。
05 副溶血性弧菌检测的挑战 与展望
当前面临的挑战
检测方法的局限性
目前常用的副溶血性弧菌检测方法，如培养法、免疫学方法和分子生物学方法，存在灵敏 度不高、特异性不强、操作繁琐等问题，难以满足快速、准确检测的需求。
分离培养法具有较高的特异性，但检测时间较长，且对操作人员的技术要求较高。
免疫学检测方法
免疫学检测方法利用抗体与抗原的特 异性结合来检测副溶血性弧菌，包括 间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验 等。
免疫学检测方法具有快速、简便的优 点，但可能出现假阳性或假阴性的结 果。
分子生物学检测方法
分子生物学检测方法利用DNA或RNA的特异性序列来检测副溶血性弧菌，如聚合酶 链式反应（PCR）、基因芯片等。
检测规范
副溶血性弧菌检验技术
2.6 无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm
2.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头
2.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL 1000mL 2.9 无菌培养皿：直径90mm
2.10 全自动微生物生化鉴定系统
2.11 无菌手术剪、镊子
225ml 3%氯化钠碱性蛋白陈水
液体
25mL
摇匀 36±1℃ 均质
25g
样品
8~18h
固体 样品
划线分离
氧化酶 试验
革兰氏 染色
•典型的副溶血性弧菌在 TCBS上呈圆形、半透明、 表面光滑的绿色菌落，用接 种环轻触，有类似口香糖的 质感，直径2mm~3mm。
TCBS琼脂 科玛嘉显色琼脂
3％氯 化钠TSI
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.1.3 以无菌操作样品25g（mL）加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均 质1min,或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自 225mL3%氯化钠碱性蛋白水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量 稀释液冲洗乳钵中的残留样品1~2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制 备1：10的样品匀液。
食品中副溶血性弧菌检验
一、副溶血性弧菌概况
副溶血性弧菌属弧菌科，是一种生活在近海的海洋微生物，深海一般未发现，大多 在温暖的季节水体中分离到该菌。从多种海产品中均能分离到该菌。
副溶血性弧菌引发的胃肠炎一般表现为骤发性剧烈腹痛。所有的副溶血性弧菌胃肠炎 起因均是由于进食了海产品或海产品相关的一些食物。在日本，有副溶血型弧菌引发 的胃肠炎相当普遍，约占全部胃肠炎爆发事件的50%，原因是日本人爱生吃鱼。
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
副溶血性弧菌检验PPT幻灯片课件
含量。
10
• 神奈川现象(Kanagawa phenomenon，
KP) --在特定条件下，某些菌株在含 高盐(7％)的人O型血球或兔血球及以D 甘露醇作为碳源的我妻琼脂平板上产 生β溶血的现象 • 神奈川现象与本菌的 致病性密切相关
11
血清分型
• O抗原（耐热的菌体抗原） O1- O13 共13种
• K抗原型（荚膜抗原） K1- K71 共65种
• H抗原（鞭毛抗原），无特异性
12
三、检测程序
食品安全国家标准 副溶血性弧菌检验 GB 4789.7 -2013
13
GB 4789.7-2013
14
1、样品制备
• 食品样品 鱼类：表面组织、肠、鳃 贝类：全部内容物（贝肉和体液） 甲壳类：动物的中心部分，包括肠、鳃 水产制品
GB 4789.7-2013 副溶血性弧菌检验
1
• 一、概述 • 二、生物学特性 • 三、检测方法
2
一、概 述
• 副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus于 1950年从日本一次暴发性食物中毒中发现。
• 该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、 贝壳等海产品中。在37℃、pH7.7、3～ 4%NaCl环境中生长最好。
18
TCBS平板上典型特征
19
科玛嘉弧菌显色平板--紫色菌落
20
4、纯培养
• 挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯化 钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1 ℃培养 18 h～24h。
5、初步鉴定
• 氧化酶试验 • 涂片镜检 • 3%氯化钠三糖铁 • 嗜盐性试验
副溶血性弧菌检验课件
在37℃下培养24-48小时，观察是否 有细菌生长。
分离培养
分离培养基
在SS（Salmonella Shigella）培养基上进行分离培养，副溶 血性弧菌在此培养基上呈现绿色菌落。
菌落形态
观察菌落的形状、大小、色泽等特征，以初步判断是否为副 溶血性弧菌。
生化鉴定
氧化酶试验
副溶血性弧菌为阳性结果。
基因测序
对PCR扩增产物进行测序，与副溶血性弧菌的基因序列进行比对，以确定是否 为副溶血性弧菌。
快速检测方法
Hale Waihona Puke 免疫胶体金试纸条利用抗原抗体反应的原理，将特异性抗体或抗原固定在试纸条上，当与样品中的 副溶血性弧菌抗原或抗体结合后，会出现显色反应，判断是否为副溶血性弧菌。
生物传感器
利用生物传感器技术，将副溶血性弧菌的特异性抗体或抗原固定在传感器上，当 与样品中的副溶血性弧菌结合后，会产生电信号或光信号，通过信号的强弱判断 副溶血性弧菌的浓度。
消毒处理
对接触过患者的物品和 环境进行消毒处理。
加强监测
加强食品和水质的监测 ，及时发现并控制副溶
血性弧菌的传播。
消毒与灭菌方法
高温消毒
将食品或物品加热至70度以上 ，持续一段时间进行消毒。
紫外线消毒
使用紫外线灯对空气和表面进 行消毒。
化学消毒
使用漂白粉、酒精等化学药剂 进行消毒。
煮沸消毒
将水加热至沸腾状态，持续一 段时间进行消毒。
培养特性
副溶血性弧菌为需氧或兼性厌氧菌， 在普通培养基上生长良好，适宜温度 为37°C，适宜盐浓度为2-4%。
流行病学特点
01
02
03
传染源
副溶血性弧菌主要来自海 产品，如鱼类、贝类、甲 壳类等。
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血清分型
• O抗原（耐热的菌体抗原） O1- O13 共13种 • K抗原型（荚膜抗原） K1- K71 共65种 • H抗原（鞭毛抗原），无特异性
三、检测程序
食品安全国家标准 GB 4789.7 -2013 副溶血性弧菌检验
GB 4789.7-2013
1、样品制备
• 食品样品 鱼类：表面组织、肠、鳃 贝类：全部内容物（贝肉和体液） 甲壳类：动物的中心部分，包括肠、鳃 水产制品 • 如为带壳贝类或甲壳类，应先在自来水中 洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操 作打开外壳，按上述要求取相应部分。
2、增菌-- 3%氯化钠碱性蛋白胨水
定性--取样品 25 g（mL），加入3%氯化钠
碱性蛋白胨水 225 mL。
定量--选择3个适宜的连续稀释度，每个稀
释度接种3支含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白 胨水的试管，每管接种1 mL。置36℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h。
3、分离—TCBS平板、弧菌显色平板
概 述
• 本菌嗜盐畏酸怕冷，在无盐环境不能生长， 3%～6%盐水繁殖迅速，低于0.5%或高于 10%盐水中停止生长。对酸敏感，在2%醋 酸或50%食醋中1 min即死亡。不耐热， 56℃5 min可杀死，90℃1 min灭活。对高 盐浓度抵抗力甚强。5℃以下容易死亡。
• 分类：属弧菌科(Vibrio)，弧菌属。 • 分布：主要存在于近海岸的海水、海底 沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海 产品中。 人多因食用被本菌污染而又未煮熟 的海产品和其他食品而引起中毒。
• 在固体培养基上，菌落通常隆起，圆形半 透明，表面光滑、湿润、一般不产生色素。 • 在血平板和嗜盐性平板上，菌落生长良好。 • 肉汤、琼脂、生化管都应含有3-4%的NaCl 含量。
• 神奈川现象(Kanagawa phenomenon，
KP) --在特定条件下，某些菌株在含 高盐(7％)的人O型血球或兔血球及以D 甘露醇作为碳源的我妻琼脂平板上产 生β溶血的现象 • 神奈川现象与本菌的 致病性密切相关
• 对所有显示生长的增菌液，用接种环在距 离液面以下 1 cm内沾取一环增菌液，于 TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分 离。一支试管划线一块平板。于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
TCBS平板上典型特征
•典型的副溶血性弧 菌 在TCBS上，呈 圆形、半透明、表 面光滑的绿色菌落。
TCBS平板上典型特征
GB 4789.7-2013 副溶血性弧菌检验
• 一、概述 • 二、生物学特性 • 三、检测方法
一、概 述
• 副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus于 1950年从日本一次暴发性食物中毒中发现。 • 该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、 贝壳等海产品中。在37℃、pH7.7、3～ 4%NaCl环境中生长最好。
流行病学
• 季节分布：8-9月为高峰期 • 中毒食品：主要为海产品、其次为水产制 品、淹制品、咸菜及污染食品 • 地区分布：沿海地区居多 • 临床症状：主要有腹痛、腹泻、恶心、呕 吐、发热 • 潜伏期：10小时左右物中毒和 感染性腹泻。由于病菌在食品中大量繁殖， 侵入肠道后继续繁殖并释放出大量肠毒素， 引起剧烈的胃肠炎。
• • • • 甘露醇发酵试验--含3%氯化钠的培养基 赖氨酸脱羧酶试验 V-P试验 ONPG 试验—采用3%氯化钠三糖铁琼脂隔 夜培养物进行 • 副溶血性弧菌： 甘露醇 + 赖氨酸脱羧酶+ V-P ONPG -
ONPG 试验
• 挑取1满环新鲜培养物接种 于0.25 mL 3%氯化钠溶液， 在通风橱中，滴加1滴甲苯， 摇匀后置37 ℃水浴5 min。 加0.25 mL ONPG溶液，36 ℃培养观察24 h。 • 阳性结果呈黄色。阴性结果 则24 h不变色。
二、生物学特性 ---菌体形态及染色特征
• 革兰氏阴性杆菌，无芽孢 • 0.3~0.7×2~6 µm 两端浓染 呈多形态（棒 状、弧状、球状、卵圆形等）排列不规则 • 液体培养基生长单鞭毛，固体培养基常有 周生鞭毛（侧毛）
二、生物学特性 ---培养特性
• 需氧兼性厌氧 • 在含 NaCl 3-4%的培养基中生长良好 • 无盐和NaCl 10%的培养基中均不生长 • 最适培养温度为：30--37℃ • 最适pH范围：pH7.4-pH8.2
ONPG--邻硝基酚-β-D-半乳糖苷
可选择生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统。 • API 20E
7、选做试验
• 血清学分型--11种O抗原血清 • 神奈川试验--我妻氏血琼脂平板
8、结果与报告
• 根据检出的可疑菌落生化性状，报告25 g （mL）样品中检出副溶血性弧菌。
• 如果进行定量检测，根据证实为副溶血性 弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN） 检索表，报告每g（mL）副溶血性弧菌的 MPN值。
科玛嘉弧菌显色平板--紫色菌落
4、纯培养
• 挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯化 钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1 ℃培养 18 h～24h。
5、初步鉴定
• • • • 氧化酶试验 涂片镜检 3%氯化钠三糖铁 嗜盐性试验
• 底层变黄不变黑，无气泡， 斜面颜色不变，有动力
6、确定鉴定