EMS诱变步骤
马铃薯茎段~(60)Co-γ射线及EMS诱变技术的研究
民生活 中 占有 非常 重要 的地位 。 当前我 国马铃 薯 的育种 方法 ， 技术 方面 大体 可 分 为 从
杂 交育 种 、 生物技 术育 种和诱 变 育种 ３类 。
我 国马铃 薯 的辐射诱 变育 种现 已取 得 的成就 很 小 ， 进
展 也较 慢 ， 不 如 其 它作 物 （ 小 麦 、 远 如 水稻 、 豆 等 ） 展 大 发 迅速 ， 能 因为马 铃薯 是 多倍 体 作 物 ， 多倍 体 作 物 的 突 可 而
促 进 作 用 ， 达 到 显 著 水 平 ， 剂量 （＞ ０ ｙ 严 重 抑 制 试 管 苗 和 继 代 苗 的 生 长 ，０ ｙ应 为 马 铃 薯 茎段 辐 照诱 变 的 最 且 高 ３Ｇ） ２Ｇ 适 剂 量 。Ｅ ＭＳ处 理 分 别 以 ０ １ 、． ％ 、． ％ 、． ％ 、． ％ 浸 泡 １ 、ｈ ３ ． ％ ０ ３ ０ ５ ０７ １０ ｈ２ 、ｈ和 ４ ， 未 处 理 茎段 （ Ｋ ） 磷 酸 缓 冲 液 ｈ以 Ｃ １和
安 徽农 学 通 报 ， ｎ ｕ ． ｃ． ｕ１２ １ １ （ ） Ａ ｈｉ Ａ Ｓ ｉＢ ｌ ０ ０，６ ３ ．
４ ５
马 铃 薯 茎 段６ ｏ ｙ 线 及 Ｅ ０ 一＾射 Ｃ ＭＳ诱 变 技 术 的研 究
王 淼 马 晓梅 郭 晋。
（ １辽 宁 师 范 大 学 植 物 重 点 实 验 室 ， 宁 大 连 １６ ２ ； 辽 ０ ９ ２核 工 业 大 连 应 用 技 术 研 究 所 ， 宁 大 连 １ 辽 ３军 事 医 学 科 学 院 生 物 医 学 统 计 咨 询 中 心 ， 京 北 １Ｏ ５ ） ０ ８ ０ １６ ３ ０２ １
射 。另 外在 二倍体 马 铃薯 种 方 面 也很 少 有 人 通 过 辐射 诱变 的方法 来研究 。而 近些 年 来 发 展起 来 的等 离 子 束诱
EMS诱变技术研究进展
３ Ｅ Ｍ Ｓ诱 变 子 技 术
２ Ｅ Ｍ Ｓ诱 变 育种 的 关 键 技 术
Ｅ Ｍ Ｓ 诱变具有操作 简单 、 突变频率高 、 突变专
一
性 与 多效 性 等 优 点 。Ｅ ＭＳ诱 变 育种 成 败 的关 键
技术 有 ： （ １ ） 采 取适 当 的诱 变 剂量 ＿ ３ ｊ 。Ｅ ＭＳ处理 材料 时 采用 适 宜 的诱 变 剂量 以便 达 到较多 的变 异 ， 减少 植株 的损 伤 。通 常在诱 变 过程 中使用对 材料造 成半
生高密度 的系列等位基 因点突变。 在当前种质资源
库新基因极 为缺乏 ， 遗传 资源 日益枯竭 的状况下 ，
采用 Ｅ ＭＳ诱发 突变 技术 创 造 有用 基 因具 有 重 要 意
义［ １ 】 ｃ
致死效应的剂量作为诱变的最适剂量 ， 还可设置诱 变剂浓度梯度和时间梯度来筛选出最佳组合。（ ２ ） 对突变体库采取适当的技术筛选。目 前通常多采用 利用 表 型 鉴 定 筛选 、 生 物技 术 ＿ ４ （ 如 定 向诱 导 基 因
是 发 生 转 换 型 的 突 变 。 烷化 的 鸟 嘌 呤不 再 与 胞
嘧 啶配 对 而 与胸 腺 嘧 啶配 对 ， 从 而 造成 Ｇ Ｃ碱 基
对变 为 Ａ ＝ Ｔ碱基 对 ， Ｅ Ｍ Ｓ诱变 大 部分 为 这种 情 况； 二 是 发 生 置换 型 突 变 。烷 基 活化 的 鸟 嘌 呤 ， 由
湖南农业科学 ２ ０ １ ３ ， （ ０ ５ ） ： ７ ￣ ９ ， １ ３
创制植物突变体库的方法
创制植物突变体库的方法一、传统诱变方法1.1化学诱变化学诱变是创制植物突变体库的一种常用方法。
咱们都知道，化学物质就像一把双刃剑。
像甲基磺酸乙酯（EMS）这种化学诱变剂，它可以悄悄潜入植物的细胞，对植物的DNA分子搞点“小动作”。
它会和DNA碱基发生反应，使得碱基发生改变，就像给DNA的密码本上乱涂乱画了几笔。
这样一来，植物的基因就发生突变了。
这就好比一个精密的机器，里面的一个小零件被悄悄换了或者改造了，整个机器的运行就可能出现新的情况。
但是呢，使用化学诱变剂得小心翼翼，就像走钢丝一样，剂量控制不好就可能把植物弄得“病恹恹”的，甚至直接一命呜呼了。
1.2物理诱变物理诱变也是很有一套的。
比如说辐射诱变，γ射线就像一群无形的小炮弹，向植物细胞发起攻击。
它能量高，能够直接把植物的DNA链打断。
这就好比把一根绳子给切断了，植物细胞就得赶紧想办法把这断开的“绳子”重新连接起来。
在这个过程中，就很容易出现连接错误，这就产生了突变。
还有紫外线诱变，紫外线就像一个调皮的小精灵，它的能量虽然没有γ射线那么高，但也足以让DNA分子中的碱基之间的化学键发生变化，导致碱基配对出现错乱，这就像火车轨道接错了一样，火车就没法正常行驶了，植物的基因表达也就乱了套，从而产生突变体。
二、现代生物技术诱变2.1基因编辑技术现在的基因编辑技术那可是相当厉害。
就拿CRISPR Cas9系统来说，这简直就是基因编辑领域的“神器”。
它就像一把精准的手术刀，能够在植物基因组的特定位置进行切割。
这个系统里的Cas9蛋白就像一个聪明的小工匠，它能在向导RNA的引导下，准确地找到目标DNA序列，然后“咔嚓”一下把DNA链切断。
植物细胞为了修复这个断裂，就可能引入一些错误，这样就实现了基因的突变。
这就好比一个雕刻师，本来想在一块木头上雕刻出一个精美的图案，结果一不小心多削了一块或者少削了一块，就创造出了一个和原来不一样的造型。
2.2插入突变插入突变也是一种办法。
达乌里胡枝子愈伤组织及种子EMS诱变研究
达乌里胡枝子愈伤组织及种子EMS诱变研究朱泯珏;陈橙;史文甯;李景冲;殷俐娜;王仕稳;邓西平【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2024(43)3【摘要】为优化达乌里胡枝子愈伤诱导培养基的激素含量及比例,明确甲基磺酸乙酯(EMS)诱变愈伤组织及种子的最佳条件,本研究以达乌里胡枝子种子为外植体,探究了不同激素配比对愈伤诱导的影响,并针对愈伤组织和种子处理分别设置了两时间两浓度(2 h和6 h,0.3%和0.9%)及三时间两浓度(6 h、8 h、10 h,0.4%、0.8%)的EMS处理时间和浓度的组合,研究各处理对愈伤分化系数和后期植株成活率以及种子发芽率、发芽势和幼苗表型变异的影响。
结果表明,达乌里胡枝子种子愈伤的最佳激素配比为0.25 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D,此时达乌里胡枝子愈伤诱导率为94.9%。
EMS诱变达乌里胡枝子愈伤组织的适宜浓度为0.3%,处理时间为6 h,分化系数和植株相对成活率分别为46.31%和47.78%,接近半致死范围,且生根数、根长和平均株高等指标与高浓度EMS处理相比受到的负面影响较小。
EMS诱变达乌里胡枝子种子的适宜浓度为0.8%,处理时间10 h,发芽率、出苗率、成苗率分别为53.61%、51.06%和53.28%,均接近半致死量,同时发现多株幼苗叶片出现了明显的形态变异。
本试验在达乌里胡枝子原有种质资源基础上,丰富了达乌里胡枝子突变体库,也为后续开展达乌里胡枝子诱变育种研究提供理论依据。
【总页数】10页(P1-10)【作者】朱泯珏;陈橙;史文甯;李景冲;殷俐娜;王仕稳;邓西平【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院;西北农林科技大学水土保持科学与工程学院;中国科学院水利部水土保持研究所;西北农林科技大学水土保持研究所【正文语种】中文【中图分类】S541.5【相关文献】1.达乌里胡枝子种子发芽吸水规律及吸水模型研究2.尖叶胡枝子和达乌里胡枝子牧草生产力研究3.达乌里胡枝子开花结实及种子特性4.二色胡枝子和达乌里胡枝子若干生物学特性和营养成分的分析5.尖叶胡枝子和达乌里胡枝子种子形成特性及其生产性能研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大豆EMS化学诱变处理条件分析
大豆EMS化学诱变处理条件分析杜园园;刘永忠;李万星;曹晋军;靳鲲鹏;赵文媛;王红兰【摘要】[目的]为使EMS(甲基磺酸乙酯)诱变效果最佳,获得高质量的诱变材料,其诱变时间和诱变浓度等基本条件分析是诱变处理的前提.[方法]采用化学诱变剂EMS处理大豆品种长豆18和黑豆品种长豆006,分析获得不同大豆品种的适宜诱变条件.试验设置2个品种、3个EMS浓度(0.2％、0.5％、0.8％)和3个诱导时间(4、8和12 h)共18个处理,以致死量达到50％为标准.[结果]大豆品种长豆18的适宜诱变条件以浸种4h,处理浓度0.5％ EMS,诱导时间8h和浸种4h,处理浓度0.5％ EMS,诱导时间12 h处理最优；黑豆品种长豆006的适宜诱变条件为浸种4h,处理浓度0.5％ EMS,诱导时间8h.[结论]大豆EMS化学诱变可适当提高致死剂量浓度作为大田处理浓度.%[Objective]In order to obtain high quality EMS mutagenesis material, the mutation time and mutagenic concentration of the basic conditions for analysis was the premise of chemical mutagenic. [Method] Chemical mutagen processing soybean varieties with long beans 18 and black soybean varieties long beans 006 were used-to obtain the suitable mutagenic conditions of different soybean varieties. In this study, two varieties, 3 EMS concentration (0.2% , 0.5% , 0.8% ) and 3 times (4,8 and 12 h) ,a total of 18 treatments were set. The standard was 50% lethal dose. [Result] 8 or 12 h treatment with 0.5% EMS after soaking seed in phosphate buffer solution 4 h were the proper protocol of long bean 18. The mutagenic conditions of black soybean varieties 006 was 8 hour treatment with 0.5% EMS after soaking seed in phosphate buffer solution 4h. [Conclusion] Soybean EMS chemical mutagenesis might be appropriate to increase the lethal dose concentration as a field of concentration.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)035【总页数】2页(P16995-16996)【关键词】化学诱变;大豆;EMS【作者】杜园园;刘永忠;李万星;曹晋军;靳鲲鹏;赵文媛;王红兰【作者单位】山西省农业科学院谷子研究所,山西长治046011;山西省农业科学院谷子研究所,山西长治046011;山西省农业科学院谷子研究所,山西长治046011;山西省农业科学院谷子研究所,山西长治046011;山西省农业科学院谷子研究所,山西长治046011;山西省农业科学院谷子研究所,山西长治046011;山西省农业科学院谷子研究所,山西长治046011【正文语种】中文【中图分类】S565.1化学诱变育种是指利用化学诱变剂，人为诱发作物发生突变，再通过选择而培育新品种的方法［1］。
EMS诱变番茄自交系TTD302A的突变表型鉴定和分析_杨建华
17.69
33.78
21.72
26.81 100.00
《中国蔬菜》学术论文下载
— 23 —
研究论文
中国蔬菜
CHINA VEGETABLES
出现叶片表型变异，变异频率为 1.5%（突变单株 / 总单株数） 。对照的叶片表现为绿色，二回羽状复 叶，叶片平展，裂刻中等（图 3-a） 。M2 群体叶片 变异主要发生在叶片颜色和叶片形态上，颜色变 异有黄色叶（图 3-b） 、黄绿色叶、颜色嵌合叶、 浅绿色叶（图 3-e） 、深绿色叶（图 3-f） 。黄绿色 叶变异有两种表现形式，即新生叶黄绿，老叶绿色 （图 3-c-1）和老叶黄绿，新生叶绿色（图 3-c2） 。颜色嵌合叶变异表现两种类型， 即白绿嵌合 （图 3-d-1）和白黄绿嵌合（图 3-d-2） 。在黄色叶、黄 绿色叶和颜色嵌合叶中，除了白绿色嵌合突变株在 整个生育期一直稳定表现外，其余的只出现在苗 期，变异色会随着生育期的推进逐渐恢复为正常叶
1 材料与方法
1.1 试验材料 番茄自交系 TTD302A，由西北农林科技大学园 艺学院番茄课题组提供。该品系为普通番茄，有限 生长型，果实粉色，大小均匀，单果质量为 250 g， 配合力高，综合性状良好。 1.2 试验方法 1.2.1 种子诱变处理 2012 年 3 月，挑选 2 200 粒 — 21 —
表 2 EMS 诱变 TTD302A M2 群体突变表型分类
器官 变异类型 类型 叶器官 叶片颜色 变异表型 变异数 1 15 4 11 5 3 14 1 2 5 3 2 66 2 15 9 22 11 3 6 7 10 3 3 1 5 2 3 12 1 3 3 2 3 126 3 3 7 2 13 3 13 13 3 9 12 81 5 6 2 2 12 1 3 1 68 100 373
EMS诱变西瓜突变体库的构建及表型分析开题报告
EMS诱变西瓜突变体库的构建及表型分析开题报告1. 研究背景西瓜是世界上重要的果蔬作物之一，也是中国主要的经济作物之一。
然而，自然界中的西瓜种类受限，而现代农业对某些性状的追求需要更多具有新型性状的品种。
因此，育种技术成为了改良西瓜品种的重要途径。
现在，育种技术主要通过种间杂交获得新的性状，但这种方法存在限制，需要花费大量的时间和经费。
EMS（乙醛化合物）诱变是一种常用的物理/化学诱变技术，它可以诱导基因突变，从而产生新的性状。
EMS诱变技术在植物遗传变异的研究和育种应用方面，已经发挥了重要作用。
在西瓜育种方面，EMS诱变也可以被用来产生新的性状，如改善外观、增加抗逆性、提高产量等。
2. 研究目的本研究旨在构建一种EMS诱变的西瓜突变体库，并探讨其在育种方面的应用价值。
同时，本研究还将对突变体库中的突变体进行系统的表型分析，以期获得有关这些变异性状的重要信息。
3. 研究内容和方法3.1 突变体库的构建将EMS处理的幼苗培养到成熟期，并从中选出形态上表现出突变的株系。
随后，采用分子标记和测序技术对这些株系进行DNA序列分析，以确保它们是真正的突变体。
最终，将这些突变体保存在库中，以便进行后续的表型分析和育种应用。
3.2 突变体的表型分析对突变体进行多项表型分析，包括生长发育、形态特征、果实品质、抗病性、耐盐碱性等等。
这些数据将被用于评价每个突变体的重要性状，并与野生型进行对比分析。
在这个过程中，我们将使用图像分析技术和统计学方法，以获得更准确的表型数据。
4. 预期成果及实际应用成功构建EMS诱变的西瓜突变体库，并对其中突变体进行了系统的表型分析。
结果将为育种研究和新品种的开发提供有用的信息，从而提高西瓜的品质、增加抗逆性和产量。
同时，该研究可以为EMS诱变技术在植物遗传变异研究中的应用提供有价值的借鉴。
ems诱变技术在小麦上的应用
ＥＭＳ诱变技术在小麦上的应用曹亚萍∗ꎬ武银玉ꎬ范绍强ꎬ张凤琴ꎬ连㊀晋ꎬ高㊀炜(山西省农业科学院小麦研究所ꎬ临汾０４１０００)摘㊀要:小麦遗传基础日趋狭窄成为小麦遗传改良的瓶颈ꎮ甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)是一种高效稳定的烷化类诱变剂ꎬ能诱发产生高密度系列等位基因点突变ꎬ可在创造作物新品种㊁新种质㊁遗传材料以及解决育种工作中某些特殊问题等方面取得突破ꎮ本文从ＥＭＳ诱变的原理和特点着手ꎬ简述了小麦ＥＭＳ诱变及突变体鉴选方法ꎬ绘制了ＥＭＳ诱变研究备选方案图ꎬ为小麦科研工作者提供研究思路和参考依据ꎮ同时对ＥＭＳ诱变技术在抗病基因克隆㊁品质性状改良㊁叶片持绿机制研究㊁农艺性状解析㊁突变体库构建等方面的研究进展进行了前沿报道ꎬ分析了ＥＭＳ诱变在小麦研究中存在的问题及应对方法ꎬ并在此基础上对ＥＭＳ诱变技术在小麦上的发展前景进行展望ꎮ这对于丰富小麦遗传资源㊁加快育种进程和开展基因功能研究具有重要意义ꎮ关键词:小麦ꎻ甲基磺酸乙酯ꎻ化学诱变ꎻ突变体中图分类号:Ｓ５１２ꎻＱ８１３.５文献标志码:ＡＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００７￣７１４６.２０１９.０５.００２ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗｉｔｈＥＭＳｏｎＷｈｅａｔＣＡＯＹａｐｉｎｇ∗ꎬＷＵＹｉｎｙｕꎬＦＡＮＳｈａｏｑｉａｎｇꎬＺＨＡＮＧＦｅｎｇｑｉｎꎬＬＩＡＮＪｉｎꎬＧＡＯＷｅｉ(ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＷｈｅａｔＲｅｓｅａｒｃｈꎬＳｈａｎｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＬｉｎｆｅｎ０４１０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｎｅｏｆｔｈｅｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓｆｏｒｗｈｅａｔｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｓｔｈｅｎａｒｒｏｗｉｎｇｏｆｗｈｅａｔｇｅｎｅｔｉｃｂａｓｉｓ.Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ｉｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅａｌｋｙｌａｔｉｏｎｍｕｔａｇｅｎｓꎬｗｈｉｃｈｃａｎｉｎｄｕｃｅａｓｅｒｉｅｓｏｆａｌｌｅｌｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙꎬａｎｄｍａｋｅｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓｉｎｃｒｅａｔｉｎｇｏｆｎｅｗｖａｒｉｅｔｉｅｓꎬｎｅｗｇｅｒｍｐｌａｓｍꎬｇｅｎｅｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｓｏｌｖｉｎｇｓｏｍｅｓｐｅｃｉａｌｐｒｏｂ￣ｌｅｍｓｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ.ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓꎬｔｈｉｓｐａｐｅｒｂｒｉｅｆｌｙｄｅｓｃｒｉｂｅｓｔｈｅｍｅｔｈ￣ｏｄｏｆＥＭＳｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒｗｈｅａｔꎬａｎｄｄｒａｗｓａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｃｈｅｍｅｏｆＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｒｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｒｅｓｅａｒｃｈｉｄｅａｓａｎｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｗｈｅａｔｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ.ＡｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅꎬｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎬｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬｌｅａｆｇｒｅｅｎｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔａｎａｌｙｓｉｓꎬａｎｄｍｕｔａｎｔｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄ.ＴｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓｏｆＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎｗｈｅａｔｒｅｓｅａｒｃｈｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.ＴｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｗｈｅａｔｗａｓｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ.Ｔｈｉｓｉｓｏｆｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒｅｎｒｉｃｈｉｎｇｗｈｅａｔｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｓꎬａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｂｒｅｅｄｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓａｎｄｓｔｕｄｙｉｎｇｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｗｈｅａｔꎻｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅꎻｃｈｅｍｉｃａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓꎻｍｕｔａｎｔ第２８卷第５期２０１９年１０月激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报ＡＣＴＡ㊀ＬＡＳＥＲ㊀ＢＩＯＬＯＧＹ㊀ＳＩＮＩＣＡＶｏｌ.２８Ｎｏ.５Ｏｃｔ.２０１９收稿日期:２０１９￣０４￣２４ꎻ修回日期:２０１９￣０５￣２８ꎮ基金项目:山西省农业科学院农业科技创新研究课题项目(ＹＣＸ２０１８４１２)ꎻ山西省重点研发计划项目(２０１７０３Ｄ２１１００７￣４)ꎮ∗通讯作者:曹亚萍ꎬ研究员ꎬ主要从事小麦种质创新与遗传育种研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｃｙｐｉｎｇ１８０＠１６３.ｃｏｍꎮ㊀㊀小麦在长期演变过程中ꎬ由于人工选择和自然进化ꎬ导致遗传基础日趋狭窄ꎬ遗传脆弱性逐渐增加ꎮ绿色革命期间ꎬ半矮秆表型的选择减少了小麦遗传多样性[１]ꎻ近年来ꎬ随着小麦集约化生产和商品性经营ꎬ小麦育种以市场需求为导向ꎬ比较集中地利用少数遗传资源ꎬ许多抗逆㊁抗病虫㊁优质等优异基因逐渐丢失ꎬ育成品种的遗传基础更加狭窄ꎬ对于生物和环境胁迫愈加脆弱ꎬ致使育种进程缓慢ꎬ难以适应农业生产快速发展的需要ꎬ成为小麦遗传改良的瓶颈ꎮ丰富的遗传性状和基因资源是达到品种选育目标的重要基础ꎬ由于小麦属内遗传基因有限ꎬ而常规杂交育种所依据的主要遗传学原理是基因自由组合ꎬ只能利用已有基因进行重组ꎬ不能产生新的基因ꎬ难以解决小麦基因资源狭窄问题ꎮ刘志勇等[２]分析小麦育种现状ꎬ提出未来需大力加强种质资源的原始创新ꎮ长期实践证明ꎬ改变这种现状最基本㊁快速㊁有效的途径之一是诱变育种方法ꎬ诱发突变技术是创造作物新种质㊁丰富遗传多样性和培育优良新品种的一种重要技术手段ꎮ小麦诱变技术是人为利用物理诱变因素(如紫外线㊁Ｘ射线㊁γ射线㊁β射线㊁快中子㊁激光㊁离子束等)和化学诱变剂(如烷化剂㊁叠氮化物㊁碱基类似物㊁亚硝基化合物㊁抗生素等)诱发小麦基因组产生变异ꎬ从而创制出自然界原来没有的或一般常规方法难以获得的新类型㊁新性状㊁新基因ꎮ物理诱变因高能射线引起ꎬ染色体畸变率高㊁结构变异广泛ꎬ染色体组紊乱ꎬ后代不育率高ꎬ分离类型广ꎬ纯合世代长ꎻ化学诱变是化学药剂与遗传物质发生生化反应ꎬ结果多是基因的点突变ꎬ纯合世代较短ꎮ甲基磺酸乙酯(ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅꎬＥＭＳ)是一种高效稳定的烷化类化学诱变剂ꎬ能诱发产生高密度系列等位基因点突变ꎬ获得丰富的遗传材料ꎬ解决小麦育种中种质资源匮乏的问题ꎬ也为相关基因的精细定位㊁克隆及功能分析等提供了研究平台ꎬ在作物诱变技术中应用最广泛㊁效果最好ꎮ１㊀ＥＭＳ诱变原理及特点ＥＭＳ属于烷化剂ꎬ线性分子式为ＣＨ３ＳＯ２ＯＣ２Ｈ５ꎬ分子量为１２４.１６ꎬ能与醇混溶ꎬ微溶于水ꎮＥＭＳ诱发的突变主要通过两个步骤来完成ꎬ首先鸟嘌呤(Ｇ)的Ｎ￣７位置被烷基化ꎬ成为一个带正电荷的季铵基团ꎬ从而发生两种遗传效应:一是转换型突变ꎬ烷化的鸟嘌呤(Ｇ)不再与胞嘧啶(Ｃ)配对ꎬ从而造成ＧʉＣ碱基对变成Ｔ＝Ａ碱基对ꎻ二是颠换型突变ꎬ鸟嘌呤的Ｎ￣７位置烷基化后ꎬ糖苷键断裂ꎬ造成脱嘌呤ꎬ该位置缺失ꎬ在随后的ＤＮＡ分子复制过程中ꎬ４种碱基都有可能进入到其互补位置ꎬ发生置换现象ꎮ如碱基置换发生于编码多肽区域ꎬ则因可影响密码子而使转录㊁翻译遗传信息发生变化ꎬ以一种氨基酸取代原有的另一种氨基酸ꎻ也可能出现终止密码使多肽链合成中断ꎬ不能形成原有蛋白质而完全失去某种生物学活性ꎮ此外ꎬ诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应ꎬ形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断ꎬ产生染色体缺失ꎮＳｉｄｈｕ等[３]采用生物信息学分析方法ꎬ在小麦品种ＩｎｄｉａｎＥＭＳ诱变群体中ꎬ共检测到１４１３０个点突变ꎬ突变频率为每５ｋｂ一个ꎬ其中７０％转换㊁３０％颠换ꎬ并发现存在于染色体远端区域的基因与近端区域中存在的基因相比更容易发生突变ꎮ这些ＤＮＡ结构上的变化一方面可能改变遗传信息ꎬ引起基因功能丧失ꎬ如抗锈病基因成为敏感型基因ꎻ另一方面可能促使不表达的基因或区段被激活ꎬ而表现出被掩盖的性状ꎮＥＭＳ作为化学诱变剂能够引起单一碱基对改变而形成点突变ꎬ染色体畸变相对较少ꎬ不需要进行遗传转化ꎬ可以在短时间内获得大量功能基因的点突变ꎬ引起不同基因的等位变异ꎮ与其它诱变剂相比ꎬＥＭＳ诱变后产生的突变频率高ꎬ且多为显性突变体ꎬ易于突变体的筛选ꎻ与常规杂交育种相比ꎬＥＭＳ诱变具有随机性ꎬ诱变后可获得丰富的种质遗传材料ꎬ具有种质创新频率高㊁遗传变异谱宽㊁基因纯合周期短等特性ꎬ可解决小麦遗传基础狭窄问题ꎬ有效弥补小麦常规育种方法短时间难以获得新性状和新基因的不足ꎮ２㊀小麦ＥＭＳ诱变研究现状近年来ꎬＥＭＳ诱变技术在国内外得到大规模研究与应用ꎬ在水稻[４ꎬ５]㊁玉米[６]㊁大豆[７ꎬ８]㊁高梁[９]㊁烟草[１０]㊁苜蓿[１１]㊁蓖麻[１２]㊁谷类[１３ꎬ１４]㊁油料作物[１５￣１７]㊁果蔬[１８￣２３]㊁木本植物[２４￣２６]㊁小麦近缘物种[２７ꎬ２８]等植物上均取得显著成就ꎮ由于普通小麦是异源六倍体ꎬ基因组庞大ꎬ高达１７Ｇｂ[２９]ꎬ应用ＥＭＳ进行诱变育种的研究远远落后于模式植物拟南芥[３０￣３２]和水稻[３３ꎬ３４]等ꎬ但也在诸多方面取得一定进展ꎮ２.１㊀在抗病基因研究方面利用ＥＭＳ诱变获得抗病基因突变体在研究抗病５９３第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曹亚萍等:ＥＭＳ诱变技术在小麦上的应用㊀㊀㊀基因结构㊁功能等方面具有独特优势ꎬ寻找抗病基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法ꎮ锈病是小麦生产上危害较重也是研究较多的病害之一ꎬ张维宏等[３５]用ＥＭＳ处理小麦抗叶锈病近等基因系ＴｃＬｒ１９的种子ꎬ于诱变３代(Ｍ３)获得６个感病突变材料ꎬ遗传稳定率达７０％以上ꎻＨｕｓｓａｉｎ等[３６]用ＥＭＳ诱导中抗叶锈小麦品种ＮＮ￣Ｇａｎｄｕｍ￣１ꎬ得到９个高抗和２个高感突变体ꎬＳＮＰ分析将抗性突变体变异位点定位于１Ｂ染色体短臂(１ＢＳ)ꎬ该位点的谷氨酸被丙氨酸取代ꎬ导致蛋白质结构改变ꎻＭａｇｏ等[３７]报道ꎬ利用ＥＭＳ诱导获得抗锈病基因敏感型突变体ꎬ已有几个抗锈病基因从小麦中克隆ꎮ此外ꎬ李韬等[３８]用ＥＭＳ诱变抗赤霉病小麦地方品种黄方柱和海盐种ꎬ得到病小穗率均显著高于相应野生型的６个突变系ꎬ是研究赤霉病扩展抗性的理想材料ꎮ陈洋等[３９]用ＥＭＳ处理抗黄矮病小麦－中间偃麦草易位系ＹＷ６４２的种子ꎬ筛选出１８个黄矮病抗性丧失程度不等的突变体ꎬ分子标记检测结果表明这些突变体分别在１~４个分子标记位点上发生变异ꎬ说明这些突变体中抗黄矮病基因Ｂｄｖ２及其附近区域有不同碱基位点发生突变ꎬ为小麦抗黄矮病基因克隆和功能基因组学研究奠定了坚实的材料基础ꎮ耿皆飞[４０]以ＥＭＳ诱变花培品系Ｈ２６１ꎬ获得小麦类病斑突变体ＬＦ２０１０ꎬ并将其突变基因ｌｍ３定位到小麦６ＢＬ染色体上６Ｂ０３和６Ｂ４０之间２.３６Ｍ物理距离之中ꎬ同时找到５８个候选基因ꎮ２.２㊀在品质性状改良方面随着人民生活水平的提高ꎬ小麦多样化食材成为适应市场经济的必然ꎬ因而对小麦籽粒最终用途要求也不尽相同ꎬ小麦品质改良成为科研工作者关注的焦点ꎮ研究较多的是糯性小麦ꎬＳｌａｄｅ等[４１]创建了普通小麦和硬粒小麦突变体库ꎬ将ＥＭＳ化学诱变技术与定向诱导基因组局部突变技术(ｔａｒｇｅｔｉｎｇｉｎ￣ｄｕｃｅｄｌｏｃａｌｌｅｓｉｏｎｓＩＮｇｅｎｏｍｅｓꎬＴＩＬＬＩＮＧ)相结合ꎬ筛选到２４６个等位变异位点ꎬ获得丰富的遗传信息和糯性小麦突变体ꎬ并育成糯性较好的小麦新品种ꎻ李晓等[４２]用ＥＭＳ诱变京４１１ꎬ以Ｗｘ￣Ａ１为候选基因ꎬ用ＴＩＬＬＩＮＧ技术检测所创建的突变群体ꎬ获得Ｗｘ￣Ａ１基因的７个点突变ꎬ突变密度为１/６７ｋｂꎬ其中有功能变异的４个错义突变系均可稳定遗传至下一代ꎬ其直链淀粉含量降低２.８％~７.４％ꎮ张纪元等[４３]利用ＥＭＳ诱变创制软质小麦宁麦９号高分子量谷蛋白亚基突变体ꎬ获得Ａｘ１㊁Ｄｘ２㊁Ｂｘ７㊁Ｂｙ８㊁Ｄｙ１２㊁Ａｘ１＋Ｂｙ８缺失突变系ꎬ其谷蛋白大聚体和谷蛋白/醇溶蛋白比值均有不同程度降低ꎬ为小麦品质研究奠定了良好的材料基础ꎮ淀粉占小麦籽粒胚乳的７０％左右ꎬ是决定小麦磨粉㊁加工品质的重要因素ꎬ高直链淀粉被认为是抗性淀粉(ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔａｒｃｈꎬ简称ＲＳ)ꎬ又称抗酶解淀粉和难消化淀粉ꎬ其性质类似溶解性纤维ꎬ对于维持肠道健康具有良好作用ꎬ同时具有一定的瘦身效果和保健意义ꎮ薛芳等[４４]用ＥＭＳ处理新春１１小麦种子ꎬ筛选出７个抗性淀粉含量高且综合性状优良的Ｍ２突变家系ꎮ张贞彩等[４５]用ＥＭＳ处理济麦２０和济麦２２ꎬ分别得到糊化粘度变异程度不同的突变体ꎬ可形成不同品质㊁不同功能的淀粉材料ꎮＭｉｓｈｒａ等[４６]鉴定了一组包含１０１个ＥＭＳ诱导的突变系(Ｍ４)群体ꎬ分别在约８９％和３８％的突变体系中观察到直链淀粉和抗性淀粉含量明显区别于野生型ꎬ群体中直链淀粉含量变化范围为３％~７６％ꎬ抗性淀粉含量的变化范围为１％~４１％ꎻ并用两种不同的直链淀粉含量突变体系研究了２０种淀粉代谢途径基因的定量表达模式ꎬ鉴定出直链淀粉生物合成候选基因ꎮ２.３㊀在叶片持绿机制研究方面ＥＭＳ诱变技术为小麦植株及叶片功能期研究提供了便利ꎮＤｅｒｋｘ等[４７]采用ＥＭＳ诱变方法得到小麦扬花期相同而后期冠层快速和慢速衰老突变体ꎬ通过研究突变体对产量和氮分配的影响ꎬ发现延迟衰老仅在较高氮供应时才显现ꎬ低氮供应增加了所有品系的衰老速率ꎬ并用田间试验证实了两种衰老模式ꎮ此外ꎬ通过对小麦叶片早熟突变体ｍ６８研究发现ꎬ叶片衰老表型受单个隐性核基因控制ꎬ转录因子和蛋白质转运基因在叶片衰老开始时起作用ꎬ尤其是ＷＲＫＹ家族和锌指转录因子ꎬ叶绿素和碳代谢相关的基因在后期发挥作用[４８]ꎮ２.４㊀在农艺性状解析方面株高和分蘖是影响小麦产量的两个主要农艺性状ꎬＸｕ等[４９]用ＥＭＳ处理普通小麦望水白ꎬ获得一个高分蘖矮秆突变体ＮＡＵＨ１６７ꎬ随后用ＮＡＵＨ１６７/Ｓｕ￣ｍａｉ３的ＲＩＬ２:６群体构建了基于分子标记的遗传图谱ꎬ并将控制两种性状的主效ＱＴＬ(ＱＨｔ.ｎａｕ￣２Ｄ)定位于２ＤＳꎬ其侧翼标记为Ｘｃｆｄ１１和Ｘｇｐｗ３６１ꎬ最后用２０１１Ｉ￣７８/ＮＡＵＨ１６７群体对ＱＨｔ.ｎａｕ￣２Ｄ进行了物理定位ꎮ赵天祥等[５０]采用ＥＭＳ突变技术构建了小麦６９３㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第２８卷品种偃展４１１０的突变体库ꎬ并且对其进行形态学分析和鉴定ꎬ得到株高在１０~１５ｃｍ左右的特矮变异类型ꎮＷ９８是用ＥＭＳ处理小麦品种偃展１号获得的突变体ꎬ其矮秆与圆粒性状呈显著相关ꎬ用Ｗ９８与高秆长粒的墨西哥品种１０ｔｈ１２配制杂交组合ꎬ对Ｆ２ʒ３分离群体进行遗传分析发现ꎬ圆粒性状由１对不完全显性基因控制ꎻ激素敏感性试验表明ꎬ该突变体与野生型都对赤霉素处理不敏感ꎬ但野生型对油菜素内酯不敏感而突变体Ｗ９８则表现敏感[５１]ꎮＭｏ等[５２]利用外显子捕捉技术ꎬ结合一个ＥＭＳ分离群体ꎬ对小麦４ＢＳ染色体上的一个矮秆基因区域进行了鉴定ꎬ发现在高秆突变体后代中大约存在一个１.９Ｍｂ的缺失ꎬ该缺失区间包含９个基因ꎬ其中之一为Ｒｈｔ￣Ｂ１基因ꎮ为了研究分蘖的潜在遗传变异ꎬＫｕｒａｐａｒｔｈｙ等[５３]用ＥＭＳ诱变二倍体小麦ꎬ得到分蘖能力受到损害的突变体ꎬ将分蘖抑制基因ｔｉｎ３定位在染色体３ＡＬ远端１０％位置ꎬ并开发出一个与ｔｉｎ３共分离的ＲＦＬＰ标记Ｘｐｓｒ１２０５ꎬ促进了小麦有效分蘖的改良ꎮ抽穗期作为普通小麦重要农艺性状之一ꎬ对适应不同生态环境条件具有至关重要的作用ꎬ通过调节小麦抽穗期ꎬ使其与光㊁温等环境因子变化密切协调ꎬ从而提高小麦适应性和稳产性ꎮ刘国祥[５４]对偃展４１１０ＥＭＳ突变体库６０份抽穗期突变体研究发现ꎬ光周期对突变体抽穗期的影响极为显著ꎬ通过对光周期基因Ｐｐｄ￣Ｄｌ的克隆测序与比对ꎬ发现突变体有单碱基突变㊁Ｃ缺失㊁Ｃ/Ｔ转换㊁Ｇ插入和Ｔ插入多种类型ꎬ这些点突变造成启动子区碱基转换㊁氨基酸改变以及内含子调控序列变化ꎬ从而导致抽穗期发生变异ꎮＺｈａｎｇ等[５５]用ＥＭＳ处理ＹＺ４１１０ꎬ获得晚抽穗期突变体ｍ６０５ꎬ这种晚期抽穗性状由一个名为ＴａＨｄｍ６０５的隐性基因控制ꎬ采用遗传作图方法将ＴａＨｄｍ６０５基因定位在３ＤＬ分子标记ｃｆｄ１５２和ｂａｒｃ４２之间ꎬ而后进一步将该基因座定位到包含２６个预测基因的１.８６Ｍｂ物理基因组区域ꎬ为ＴａＨｄｍ６０５克隆以及改变小麦抽穗期奠定了遗传基础ꎬ并且该突变体可在秋季播种时至少延迟７天ꎮＷｕ等[５６]从ＥＭＳ处理普通小麦品种望水白的突变体文库中获得突变体Ｍｅｈ０２３９ꎬ通过对其进行形态学㊁生理学㊁解剖学和遗传学的研究ꎬ鉴定出一个与产量性状相关的多效性基因Ｙｔ１ꎬ该突变体为小麦染色体７ＤＳ上Ｘｗｍｃ５０６远端约３.１ｃＭ处单个隐性突变ꎮ２.５㊀在突变体库构建方面据Ｋｒａｓｉｌｅｖａ等[５７]报道ꎬ用ＥＭＳ处理四倍体小麦Ｋｒｏｎｏｓ和六倍体小麦Ｃａｄｅｎｚ种子ꎬ提取Ｍ２植株ＤＮＡ进行外显子捕捉测序ꎬ在１５３５份Ｋｒｏｎｏｓ和１２００份Ｃａｄｅｎｚａ的ＥＭＳ群体中ꎬ在基因水平上鉴定出超过一千万个突变位点ꎬ平均每个单株存在２７０５(四倍体)和５３５１(六倍体)个位点ꎬ突变频率大约在３５~４０个ＳＮＰ/ｋｂꎮ对于单个基因来说ꎬ大约有２３~２４个突变位点造成了错义或提前终止ꎮ由于单个突变单株在整个基因组水平上均含有大量突变位点ꎬ将突变体与野生型材料进行杂交并连续回交ꎬ可以纯化遗传背景以消除其它突变位点对目标性状造成的影响ꎮ该突变体库包含四倍体小麦Ｋｒｏｎｏｓ和六倍体小麦Ｃａｄｅｎｚꎬ可以用作改善小麦营养品质㊁籽粒大小㊁鉴定等位基因等方面的研究ꎬ也是小麦功能基因组学研究的宝贵遗传资源ꎬ同时也为解析在人工或自然选择中被忽略掉的隐性突变提供帮助ꎮ在鉴定突变位点的基础上ꎬ作者又对突变位点进行了注释ꎬ相关突变信息可以通过ｗｗｗ.ｄｕｂｃｏｖｓｋｙｌａｂ.ｕｃ￣ｄａｖｉｓ.ｅｄｕ/ｗｈｅａｔ￣ｔｉｌｌｉｎｇ网站进行查询ꎬ山东农业大学付道林组有四倍体Ｋｒｏｎｏｓ的突变体库ꎬ国内感兴趣的研究人员可以向他们申请(信息来源于小麦研究联盟)ꎮ３㊀小麦ＥＭＳ诱变突变体选择３.１㊀小麦ＥＭＳ诱变及突变体表型选择诱变材料需选用待处理品种(系)的纯系ꎮ育种研究需要根据育种目标选用具有较好综合性状㊁只需进行少数性状改进的当地推广品种或高代品系ꎻ遗传研究需要选择目标性状突出的亲本材料ꎮ小麦ＥＭＳ诱变处理宜采用种子处理方式ꎬ具体操作如下:首先ꎬ将待处理种子在室温下用蒸馏水浸种１０ｈ左右ꎬ使种子充分膨胀或萌动ꎬ随后放在吸水纸上晾干ꎬ将种子含水量控制在２０％以下ꎻ其次ꎬ以磷酸缓冲液(ｐＨ＝７)为溶剂ꎬ配制０.５％~０.８％的ＥＭＳ化学诱变剂ꎬ将晾干的种子在室温下浸种８~１０ｈꎻ最后ꎬ将诱变后的种子装入小网袋中ꎬ在自来水下反复冲洗１ｈꎬ除去种子胚上残留的ＥＭＳꎬ风干备用ꎬ５天内播种ꎮ值得注意的是ꎬ不同基因型材料对ＥＭＳ敏感程度不同ꎬ不同处理时间㊁不同ＥＭＳ浓度及不同浓度与时间组合对突变频率影响也具有较大差异ꎮ首次应用时需谨慎对待ꎬ最好设不同剂量ＥＭＳ浓度来处理种子ꎬ以达到理想效果ꎻ另外ꎬＥＭＳ具有强烈的致癌性和挥发性ꎬ常用５％硫代硫酸钠作为解毒剂ꎬ因此在操作过程中要注意安全防护ꎬ严格遵守试验７９３第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曹亚萍等:ＥＭＳ诱变技术在小麦上的应用㊀㊀㊀规则ꎮ诱变Ｍ１表型不分离ꎬ一般按单株或单穗(每株１穗)收获ꎻＭ２是变异最大的世代ꎬ也是选择的关键时期ꎬ可根据育种目标及性状遗传特点选择各种表型突变体(图１)ꎬ如株高㊁株型㊁穗型㊁叶色㊁分蘖㊁生育期㊁育性等性状ꎻＭ３代及以后ꎬ随着世代的增加ꎬ性状分离减少ꎬ有些性状一经获得即可迅速稳定ꎮ图２和图３为笔者采用ＥＭＳ诱变得到的表型稳定突变体ꎬ目前已用于突变基因遗传和功能研究ꎮ图１㊀ＥＭＳ诱变Ｍ２代表型突变体Ｆｉｇ.１㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃｍｕｔａｎｔｓｏｆＥＭＳｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎＭ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ(ａ)良星９９色泽突变ꎻ(ｂ)济麦２２分蘖力突变ꎻ(ｃ)晋麦４７号生育期突变ꎻ(ｄ)冀麦３２５株型突变(ａ)ＭｕｔａｔｉｏｎｏｆｃｏｌｏｒｏｆＬｉａｎｇｘｉｎｇ９９ꎻ(ｂ)ＭｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｉｌｌｅｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｏｆＪｉｍａｉ２２ꎻ(ｃ)ＭｕｔａｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈｓｔａｇｅｏｆＪｉｎｍａｉ４７ꎻ(ｄ)ＭｕｔａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｔｙｐｅｏｆＪｉｍａｉ３２５图２㊀晋麦４７号(ａ)及其抗白粉病突变体(ｂ)Ｆｉｇ.２㊀Ｊｉｎｍａｉ４７(ａ)ａｎｄｉｔｓｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｕｔａｎｔ(ｂ)３.２㊀利用ＴＩＬＬＩＮＧ技术定向筛选突变体尽管ＥＭＳ在表型选择方面依旧被广泛利用ꎬ但存在ＥＭＳ诱发产生的点突变难以鉴定的问题ꎮＴＩＬＬＩＮＧ是由美国ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ癌症研究中心ＳｔｅｖｅｎＨｅｎｉｋｏｆｆ领导的研究小组发展建立的一种反向遗传学研究方法ꎬ它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与ＰＣＲ筛选技术和高通量检测方法有效结合ꎬ以发现分析目标区域点突变ꎬ是一种全新的高通量㊁低成本的反向遗传学研究方法ꎮＴＩＬＬＩＮＧ作为一种定向点突变筛选技术ꎬ对目标突变体的筛选不受遗传背景㊁基因互作㊁表型特征㊁生长环境等因素影响ꎬ鉴定准确性高ꎬ能够实现高通量㊁大群体㊁多基因㊁多性状的快速高效鉴定ꎬ提高突变体鉴选效率ꎮＴＩＬＬＩＮＧ提供了从分子水平上定向规模化筛选突变体的技术平台ꎬ尤其对品质和营养成分等无法从植株表型上加以选择的性状筛选尤为有利ꎮ其技术原理是将传统的酶切技术与ＰＣＲ技术相结合后采用红外双色荧光系统进行结果鉴定ꎬ从而筛选出相应的突变体ꎮ首先ꎬ提取具有性状分离的Ｍ２植株的基因组ＤＮＡꎬ将多个不同样品的ＤＮＡ进行等量混合ꎬ构建ＤＮＡ池ꎻ其次ꎬ以此ＤＮＡ池为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ并将扩增片段进行退火形成ＤＮＡ片段的异源双链分子ꎬ采用ＣＥＬＩ进行酶切后ꎬ利用红外双色荧８９３㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第２８卷图３㊀长６８７８及其黄叶突变体Ｆｉｇ.３㊀Ｃｈａｎｇ６８７８ａｎｄｉｔｓｙｅｌｌｏｗｌｅａｆｍｕｔａｎｔ(ａ)苗期ꎻ(ｂ)抽穗期ꎻ(ｃ)灌浆期ꎻ(ｄ)子粒(ａ)Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｔａｇｅꎻ(ｂ)Ｈｅａｄｉｎｇｓｔａｇｅꎻ(ｃ)Ｆｉｌｌｉｎｇｓｔａｇｅꎻ(ｄ)Ｇｒａｉｎ注:每张图片左或上为野生型(长６８７８)ꎬ右或下为突变体Ｎｏｔｅ:Ｔｈｅｌｅｆｔｏｒｕｐｐｅｒｐａｒｔｏｆｅａｃｈｐｉｃｔｕｒｅｉｓｗｉｌｄｔｙｐｅ(Ｃｈａｎｇ６８７８)ꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｒｉｇｈｔｏｒｌｏｗｅｒｐａｒｔｉｓｍｕｔａｎｔ光电泳分析技术进行电泳ꎻ再次ꎬ对检测到突变的ＤＮＡ池中每个单株的ＤＮＡ样品进行筛选ꎬ找出相应的突变体ꎻ最后ꎬ从对应的突变体植株中筛选出有变化的表型ꎮ详细操作方法见参考文献[５８]和[５９]ꎮ值得注意的是ꎬ按目标基因序列设计引物ꎬ是ＴＩＬＬ￣ＩＮＧ技术的一个重要步骤ꎬ设计的好坏直接影响ＴＩＬＬＩＮＧ的筛选效果ꎮ３.３㊀突变体真实性检测虽然普通小麦为自花授粉植物ꎬ但也存在１％~４％的天然异交率ꎬ如果诱变后代不能严格套袋自交ꎬ必须确认突变体的变异来源ꎬ才能对诱变后代进行遗传变异评价和基因功能研究ꎮ利用表型鉴定通常难以鉴定诱变后代突变体的真实性ꎬ而利用分子标记分析可以有效排除诱发突变体中的假突变体ꎮ耿皆飞等[６０]在小麦ＥＭＳ突变体真实性检测方面进行了首次报道:ＬＦ２０１０㊁ＬＦ２０９９和ＬＦ２１００是小麦品系Ｈ２６１经ＥＭＳ诱变后遗传稳定的突变体ꎬ用分别位于小麦２１条染色体上特异性和稳定性均好的２１对ＳＳＲ引物对突变体及其亲本进行检测ꎬＨ２６１与ＬＦ２０１０和ＬＦ２０９９的差异ＳＳＲ标记为０个ꎬ但与ＬＦ２１００的差异ＳＳＲ标记为１０个ꎻＳＮＰ芯片分析结果表明ꎬＨ２６１与ＬＦ２０１０和ＬＦ２０９９之间的差异位点分别为６６和１２个ꎬ与ＬＦ２１００之间的差异位点为２８４６个ꎮ证明ＬＦ２０１０和ＬＦ２０９９突变体与亲本Ｈ２６１的遗传背景高度一致ꎬ是Ｈ２６１经过ＥＭＳ诱变的后代ꎬ而ＬＦ２１００是天然异交或机械混杂产生的假突变体ꎮＳＳＲ标记和ＳＮＰ芯片２种方法均可有效鉴定ＥＭＳ突变体的真实性ꎬ由于ＳＮＰ芯片可以进行高通量和全基因组水平分析ꎬ在小麦突变体真实性鉴定方面具有更大应用潜力ꎮ４㊀ＥＭＳ诱变存在问题及解决方案ＥＭＳ诱变原理是进行ＤＮＡ碱基配对的干扰ꎬ使其发生碱基置换从而形成点突变ꎮ这种方法以诱发基因突变为目的ꎬ实质上主要依赖于物种在诱变条件下所发生的基因随机突变ꎬ其突变机理是在诱变条件下ＤＮＡ复制过程中所产生的一个或几个碱基的变化ꎬ这一过程是随机突变的过程ꎬ具有突变位点不确定性㊁突变方向偶然性的特点ꎮ由于碱基变化是随机的ꎬ整个变异过程无目的性ꎬ即使是用ＥＭＳ处理相同品种并且重复同样诱变条件ꎬ也无法预知必然可以出现某一特殊性状尤其是目标性状改良的突变ꎮ由表１可知ꎬ不同材料ＥＭＳ诱变结果具有较大差异ꎬ同一部位突变率差异较大且具随机性ꎬ多项报道也进一步证实了这一点ꎮＤｈａｌｉｗａｌ等[１]报道了一个用ＥＭＳ处理春小麦品种Ｉｎｄｉａｎ生成的突变体群体ꎬ在Ｍ４代观察到的表型稳定群体中ꎬ植物高度的变化最常见ꎬ其次是叶形态ꎮ许云峰等[６１]用ＥＭＳ对小麦品种烟农１５进行诱变处理ꎬ在Ｍ３代得到１１个农艺性状发生明显变异的突变系ꎬ以籽粒大小和株高２个性状的变异幅度最大ꎬ并且均有复合性状突变出现ꎮＧｕｏ等[６２]采用０.５％㊁１.０％和１.５％三种ＥＭＳ浓度处理京４１１种子ꎬ表型鉴定结果表明ꎬ除生育期外ꎬ其余性状的突变频率均随着ＥＭＳ浓度的增加而增加ꎮ９９３第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曹亚萍等:ＥＭＳ诱变技术在小麦上的应用㊀㊀㊀表１㊀小麦ＥＭＳ诱变群体中不同性状类型突变率(％)Ｔａｂ.１㊀ＭｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｉｔｔｙｐｅｓｉｎｗｈｅａｔＥＭＳｉｎｄｕｃｅｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ(％)ＷｉｌｄｔｙｐｅＥＭＳＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＋ＴｉｍｅＭｕｔａｔｉｏｎｔｙｐｅＳｐｉｋｅＬｅａｆＳｔｅｍＦｅｒｔｉｌｉｔｙＭａｔｕｒｉｔｙＯｔｈｅｒｓＴｏｔａｌｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓＳｈｅｎｇｎｏｎｇ１０.４％＋１６ｈ０.７１０.８９０.４９０.２２０.０４１.５１３.８６[６３]Ｙｕｎｏｎｇ２０１０.８％＋１２ｈ０.６０２.２０３.４９５.１５１１.４４[６４]Ｙａｎｚｈａｎ４１１０１.２％０.２６０.６３１.０６３.３４１.５９１.２２８.１０[５０]Ｙａｎｚｈａｎ４１１００.７％０.２００.９３０.８０２.２２１.１２０.４３５.７０[５０]Ｘｉｎｏｎｇ９９１.０％＋１０ｈ５.１２２.０９３.９６０.０８２.１４０.２０１３.５９[６５]Ｘｉｎｏｎｇ９７９１.０％＋８ｈ１.６００.６４４.０００.０００.１６０.００６.４０[６５]Ｘｉｎｏｎｇ９７７１.０％＋１２ｈ３.２４１.３９３.７００.０００.６９０.２３９.２５[６５]Ｘｉａｏｙａｎ２２１.０％＋１２ｈ３.６０１.２７５.０８０.００１.６９０.２１１１.８６[６５]㊀㊀应用小麦ＥＭＳ诱变技术ꎬ除构建突变体库外ꎬ还需要针对性地创制新基因和新材料ꎬ尤其是应用于育种研究时需要对少数不利性状进行改良ꎬ实现定向诱变ꎮ为了解决ＥＭＳ诱变的随机性和研究目标的定向性这一矛盾ꎬ需要在诱变群体中有效添加选择压ꎬ以提高目标突变体选择准确性和利用效率ꎬ进而实现对小麦某一特殊性状进行遗传改良ꎮ如对诱变群体Ｍ２进行干旱㊁低温㊁高温㊁盐碱等环境胁迫ꎬ可以鉴定出各种抗逆性强的突变体ꎻ对Ｍ２进行病㊁虫㊁菌接种鉴定或土壤带菌操作等试验ꎬ可鉴定出抗各种病害突变体ꎻ对Ｍ２籽粒进行蛋白电泳分析ꎬ可检测品质性状相关基因突变体ꎻ提取Ｍ２植株基因组ＤＮＡꎬ按目标基因序列设计引物ꎬ用ＴＩＬＬＩＮＧ技术定向筛选ꎬ可鉴定更多相关基因突变ꎮ图４给出了小麦ＥＭＳ诱变研究备选方案ꎬ旨在为科研工作者提供一种研究方法和策略ꎬ以便根据研究目标选择性借鉴ꎮ５㊀小麦ＥＭＳ诱变技术发展前景５.１㊀培育小麦新品种近年来ꎬ我国小麦生产上大面积种植品种的产量㊁品质㊁抗性大多取得了明显改进ꎬ但由于生态环境等因素影响ꎬ对于各地育种家来说ꎬ如能改进某个品种的某１~２个性状ꎬ即可产生良好的社会和经济效益ꎮ小麦ＥＭＳ诱变育种的主要特点是对少数不利性状进行改良ꎬ在小麦育种实践中发挥不可替代的作用ꎮ基于ＴＩＬＬＩＮＧ的诱变技术ꎬ将是一种高效定向性育种技术ꎬ它不但继承了诱变育种稳定快㊁只改变原亲本单个目标性状的传统优点ꎬ而且无须耗时的转基因和连续的杂交㊁回交过程ꎮ由ＴＩＬＬＩＮＧ分析所鉴定的大量目标突变体分别含有不同的或新的等位变异ꎬ通过与常规育种技术有效结合ꎬ能够实现目标性状优良等位变异的基因聚合ꎬ从而创制综合性状优良的育种新材料ꎬ促进小麦耐逆㊁高产㊁优质新品种的培育ꎮＥＭＳ诱变创造出有利性状的变异ꎬ可以作为优良育种亲本或自交纯合作为品种推广应用ꎬ也可从育种材料转为基因组学研究的重要基础材料ꎮ５.２㊀诱生小麦新基因在当前小麦种质资源库新基因极度缺乏㊁遗传资源日益枯竭的状况下ꎬＥＭＳ高效诱导点突变和不易造成染色体畸变的优势ꎬ被广泛应用于小麦研究中ꎬ能够在短时间获得新性状和新基因ꎬ极大程度丰富了小麦种质资源ꎮ这些资源源于人工诱变ꎬ控制这些性状的基因或等位基因与来自自然变异的基因或等位基因通常是不相同的ꎬ是一种新的基因资源ꎮ这些表型性状变异是由人工诱变获得的新型等位基因变异ꎬ可以与传统品种进行杂交ꎬ增加小麦育种的创新性ꎬ丰富自然界种质资源ꎻ部分优异资源将成为分子设计育种的理想材料ꎮ５.３㊀图位克隆基因选择具特定变异的稳定突变株ꎬ与其野生型或同种性状中表型差别较大的品种配制杂交组合ꎬ培育大分离群体ꎬ可以对控制该性状的基因进行精细定位㊁图位克隆ꎬ并为了解变异产生的分子遗传机制提供基础材料ꎮＥＭＳ诱变丰富了图位克隆的数量与资源ꎬ随着分子生物学研究的深入和技术的更新ꎬ这种方法思路在小麦功能基因的发掘与利用方面会越来越深入ꎮ００４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第２８卷。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
EMS诱变步骤：
原生质体诱变时，buffer里要加15%的蔗糖、平板为R6；
孢子诱变时，需要在TSB预萌发
材
料
1
原生质体原液：109个/ml OK
2
稀释缓冲液：pH7.2 0.1M 磷酸缓冲液+15%蔗糖 （过滤灭菌） OK
3
终止液:5%硫代硫酸钠+15%蔗糖溶液（过滤灭菌） OK
4
平板：R6 OK
5
消毒液：20%硫代硫酸钠溶液 OK
6
EMS 原液： OK
步
骤
1
取1ml原生质体原液，加9ml稀释缓冲液。得到108个/ml原生质体悬液
2
将上述悬液分装每份0.5ml。
3
取5ul EMS原液（10M/L MES),加入0.5ml原生质体悬液（工作浓度0.1M/L),于
30℃静置培养对照组不加EMS。
4
加入时间（min） 0 40 60 70 不加
诱变时间（min） 80 40 20 10 0 （CK）
5
诱变和CK的处理：样品取出后加入0.5ml终止液，离心，除去上清。再加入稀释
缓冲液洗涤2次。最后一次除去上清后加稀释缓冲液0.5ml。（约108个/ml)。用
稀释缓冲液按10-2、10-3、10-4稀释，涂板2次重复
诱 变 指 标 1
致死率： 不同诱变条件下的致死率，从平板计数可直接得出
2 突变率： （1）表型多样性：再生后直接观察计数
（2）产量分布：需将各致死率下的克隆发酵，统计产量分布
甲基磺酸乙酯 Ethyl methylsulfonate
分子式: C3H8O3S; 分子量: 124.16, 沸点: 85-86℃
性质描述: 无色透明油状液体
相对密度1.1452 (10M/L)
溶于乙醚、乙醇、氯仿，微溶于水
终止液: 1M NaOH, 20% w/v Na2S2O3