牛副结核分支杆菌抗体检测试剂盒
T-SPOT_TB操作说明电子版
结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。
【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。
T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。
记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。
这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。
与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。
分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。
标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。
通过洗涤去除任何未标记的抗体。
可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。
两种方法在奶牛结核病检疫中的对比试验
72020.02·试验研究 | Experimental research0 引言牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的慢性细菌性人兽共患病，在全球范围内广泛流行[1]。
该病不仅严重影响奶牛业发展，也是公共卫生的重大威胁。
传统诊断方法，如涂片镜检、细菌培养等存在较多缺点，因此要求研究人员开发新的诊断技术或对传统的诊断方法进行改进。
目前基层兽医常用的牛结核病检疫方法是皮内变态反应，牛结核病γ干扰素ELISA 是个很好补充。
2019年10月18日，崇明奶牛“两病”区域净化示范区项目以高分通过国家验收，并获得授牌，成为国内首个疫病区域净化示范区，为奶业振兴打造了“崇明案例”。
下一步上海将在全辖区内整建制推进奶牛“两病”区域净化模式，示范引领全国奶牛“两病”净化工作。
本试验选用崇明某场选用皮内变态反应和γ干扰素ELISA 检疫，进行净化牛结核病的尝试，以期为该病的检疫添砖加瓦。
1 材料与方法1.1 试验及采样上海某区3个奶牛场饲养984头奶牛，近年偶尔有结核病可疑牛和阳性牛出现，为根除牛结核病对该奶牛场的威胁，技术人员根据该奶牛场情况制定了检疫计划，选用皮内变态反应与γ干扰素ELISA 检测相结合的方法，进而达到检疫的目的。
1年2次检疫使用牛型结核病PPD （纯化蛋白衍生物）皮内变态反应，出现阳性或可疑牛后，再对其以及接触较为密切的牛进行γ干扰素ELISA ，目的在于更好地净化牛结核病。
1.2 主要试剂及设备牛结核菌素购自某生物疫苗有限公司，批号为201008；BOVIGAM?牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒购自上海某生物有限公司，批号为6332607801；瑞士Tecan Sunris 酶标读数仪。
1.3 牛结核变态反应试验奶牛结核病按照国家标准（GB/T18645-2002），用牛型结核分支杆菌PPD 皮内变态反应试验进行奶牛结核病检测。
局部炎性反应明显，皮厚差≥4 mm 判定为阳性牛；局部炎性反应不明显，2 mm ≤皮厚差＜4 mm 判定为可疑牛；无炎性反应，皮厚差＜2 mm 判定为阴性牛[2]。
用ELISA检测奶样中副结核分枝杆菌抗体
用ELISA检测奶样中副结核分枝杆菌抗体
史同瑞
【期刊名称】《畜牧兽医科技信息》
【年(卷),期】2000(000)012
【摘要】副结核在丹麦奶牛中广为流传。
且流行已久,但其流行状况一直不明,为了检测不同地区奶牛副结核的流行率,Nielsen等学者应用一种商品抗原,建立了ELISA方法,用于检测奶样中副结核分枝杆菌抗体。
1998年初,采集全国6个地区6个奶站的奶样,样品采用900个奶牛群,占全国奶牛群的7.5％,检测结果表
【总页数】2页(P9-10)
【作者】史同瑞
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S854.4
【相关文献】
1.结核分枝杆菌抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用 [J], 蒋纾芳;郭兰芹;宗克亮;杨锡琴;刘志强;赵照;修冰水;段翠密;陈堃
2.ELISA和DIGFA检测抗结核分枝杆菌抗体IgG的比较性研究 [J], 李一荣;吴正学;佟素香;吴健民
3.抗结核分枝杆菌抗体ELISA检测的临床应用 [J], 廖远泉;王后伟;李俊;王玲玲;
4.检测结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6分泌蛋白双抗体夹心ELISA的建立 [J], 唐宇
龙;刘湘新;杨华;柳彬;胡忠义
5.应用间接ELISA检测血清中副结核分枝杆菌抗体 [J], 王云光;王春仁
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结核分枝杆菌GeneXpert核酸扩增检测操作步骤
结核分枝杆菌GeneXpert核酸扩增检测操作步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)」INGBIAN结核分枝杆菌GeneXpert核酸扩增检测操作步骤一.准备工作：1. 开机①依次开启：UBS电源、仪器电源、打印机电源、笔记本电脑电源；⑥ 等待笔记本电脑进入系统，出现四个用户图案时，选择用户Cepheid,输入密码：cphd,等待约一分钟后系统弹出登录窗口，依次输入用户名和密码；③等待Gene-Xpert操作软件的启动与自检过程，自检过程中软件出现“数据库管理”提示窗，点选“否”;再在“存档”提示窗点选“否”，待模块进展显示“可用” o④仪器预热15分钟后再进行检测。
2. 耗材准备①标本处理液.©Cartridge反应盒、③前处理管（带有盖子的试管）、④塑料滴管（每个标本准备2支）、⑥待检标本。
3 •样品预处理①询处理管标号或粘贴条形码，再吸取2ml标本处理液在前处理管中，加入lml标本；②旋紧盖子，旋涡仪振荡10秒或剧烈摇动10-20次，室温静置10分钟，再旋涡仪振荡10秒或剧烈摇动10-20次，室温静置5分钟，观察无可见块状痰标本存在。
4.试剂盒①拆开Cartridge反应盒包装，小心取出，不要接触到正面的二维码、上面胶盖和后面有尖端区域，避免污染，可在侧面编号或粘贴条码。
②小心上拔开启Cartridge反应盒蓝色上盖的前部，取处理后的样品2ml,沿样品加入口的内壁缓缓加入反应盒内（避免吸到未液化的粘液部分，吸液量可以略超过两毫升，把尖端残液保留不注入，以免产生气泡）。
二、测定操作：1 .在GeneXpert Dx系统窗口的工具栏点击『创建测试』；2•在“扫描患者ID条形码”弹窗，选“手动输入患者条形码”,再输入患者的姓名：3. 在“扫描样品ID条形码”弹窗选“手动输入”,再在弹窗内输入痰检的实验室编号：4•在“扫描检测盒条形码”弹窗内，用扫码方法（或手动）输入测试盒上的条码，成功后软件自动指定待运行板块（（注意：为了保障每个模块有均等的运行机会，软件会选择运行次数最少的模块；但手工可以选择不同的模块）。
牛副结核病的检查诊断及处理措施
2012年第7期牛副结核病又称牛副结核性肠炎、约翰氏病。
由副结核分枝杆菌引起,临床上多呈隐性感染,是以持续性顽固性腹泻和渐进性消瘦、泌乳性能降低等为主征的慢性消化道传染病。
1病原本病病原菌为副结核分枝杆菌,属革兰氏阳性短粗杆菌。
长0.5~1.5μm ,宽0.2~0.5μm 。
不形成芽孢,无荚膜,无鞭毛。
具有抗酸性染色特性,呈红色。
在粪便或病料中成团或成丛排列。
本菌分离培养生长缓慢。
对外界不良环境的抵抗力比结核杆菌要强,在阴冷、潮湿条件下,可长期存活,如在粪土中可存活11个月,在污水中也能存活9个月。
对热和常用消毒药液敏感,80℃时,1~5m in 死亡,在10%~20%漂白粉液中20min 可被杀死,在50%甲醛液和0.2%升汞液中约需10m in 被杀死。
2病例介绍我县某养殖场于2009年10月从省外购入9头荷斯坦奶牛,购入1个多月后,其中1头青年母牛发生剧烈腹泻,治疗多日未见明显好转而淘汰,经细菌学检验,确诊为奶牛副结核病。
3症状表现患病青年母牛的粪便不成形,初期怀疑为饲喂精料过多引起的稀便,减少精料后粪便恢复了正常,但5d 后突然发生剧烈腹泻,类似水柱样,体温、心率、呼吸频率均正常,经用氨苄青霉素静脉注射及支持疗法后粪便恢复正常。
10d 后又开始出现灰色水柱样剧烈腹泻,用中药、西药及中西医结合疗法等治疗仍腹泻不止,腹泻前可听到肠管发出钢管音。
病牛被毛逆立、体形消瘦,后躯被粪便污染,精神萎靡,食草量及反刍次数减少,精料废绝,卧多站少。
根据上述症状,怀疑为奶牛副结核病。
刮取直肠黏膜涂片,抗酸染色镜检,可见副结核杆菌。
因购牛和后期治疗费用较大,奶户不愿淘汰,采用人医治疗结核病的药物疗法,连用3d 后,腹泻减轻,但该牛食欲废绝且反刍停止,至4d 后淘汰扑杀。
4病理变化剖检可见严重营养不良,皮下脂肪少,整个肠管变粗增厚,苍白色,肠黏膜因增厚形成皱襞呈脑回样,黏膜表面光滑。
肠系膜淋巴结及浆膜水肿,淋巴管增粗,淋巴结切面呈黄白色髓样、湿润。
牛副结核病的发病过程及诊断方法
饲料博览2020年第3期疾病防控Disease Control and Prevention收稿日期：2019-12-23作者简介：王荣芳（1971-），男，内蒙古通辽人，助理兽医师，主要从事畜禽防疫、监管工作。
*通讯作者：教授，E-mail:***************1牛副结核病概述牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性肠炎，对牛养殖业危害较大。
本病在我国也一直存在，而且在规模化养殖逐步替代传统散养模式的过程中其对养牛业的潜在威胁逐渐凸显。
因此，了解副结核病的发病过程并及时诊断对控制该病的发生至关重要。
牛副结核菌感染的临床表现包括腹泻、消瘦以及产奶量减少等。
这些临床症状通常会在初次感染后两到五年出现，发病牛肠壁会明显增厚，抑制营养吸收，随着病程的发展最终消瘦脱水致死。
多数牛副结核菌感染发生在犊牛期，被粪便污染的水、牛奶等均为感染途径，同时也可能垂直传播。
牛对副结核菌感染的敏感性具有年龄依赖性，犊牛在前3个月最易感，在4~12月龄易感性逐渐减弱，这时感染副结核菌需要更高的感染剂量和时间。
2牛副结核病发病过程2.1副结核菌入侵肠道病原菌最早可经扁桃体黏膜侵入宿主，而扁桃体隐窝可能是副结核菌的感染部位，细菌经扁桃体进入后可随血液扩散到肠系膜淋巴结和回肠，但多数研究表明其入侵部位主要在回肠。
副结核菌侵入肠道后，小肠淋巴结中M 细胞携带其穿过上皮细胞，并将细菌释放于黏膜下层，位于黏膜下层的细菌可被巨噬细胞吞噬。
有报道称，将副结核菌接种于回肠后，5h 内感染部位巨噬细胞中即可检测到副结核菌的存在，而一旦副结核菌成功在巨噬细胞内寄生，感染将进入下一阶段。
2.2副结核菌入侵巨噬细胞巨噬细胞吞噬副结核菌后，首先将试图消灭副结核菌。
由Th-1型淋巴细胞产生的多种细胞因子，如干扰素-γ等可以活化巨噬细胞，并对吞噬的副结核菌产生杀灭作用，部分免疫力强的牛可以成功消灭侵入的副结核菌，不会发展为副结核病。
但许多受感染牛不能清除副结核菌则会导致其在宿主巨噬细胞内持续生存并继续扩增。
结核分枝杆菌IgG抗体检测对结核病诊断有什么作用
结核分枝杆菌IgG抗体检测对结核病诊断有什么作用结核病是一种由结核杆菌感染引起的慢性传染病，感染后可侵犯较多组织器官。
公众所熟知的肺结核属于典型的结核病之一，也是结核病的主要类型，患者在临床可表现出低热、咳嗽、乏力、咳血等症状。
单纯根据临床症状无法对结核病作出鉴别诊断，免疫学检测技术的发展对结核病诊断提供了新的方法，那么，结核分枝杆菌IgG抗体检测对结核病诊断有什么作用？本文将对上述问题予以分析。
1、结核分枝杆菌IgG抗体是如何产生的？根据当前研究分析，结核病的发生同机体免疫功能之间有着密切关系，人体免疫力低下的情况下很容易感染结核杆菌，从而发生结核病。
当机体再次受到结核分枝杆菌刺激的情况下，人体可产生B淋巴细胞，然后产生IgG抗体，IgG抗体具有免疫保护作用，对感染性疾病的预防有一定效果，可以作为患者机体免疫功能变化的参考。
对此，结核病诊断过程中，通过检测患者的血清IgG抗体，能够为结核病的初步诊断提供依据，同时也为结核病的进一步治疗提供依据。
2、如何进行结核分枝杆菌IgG抗体检测？目前结核分枝杆菌IgG抗体检测主要使用胶体金法，主要是抽取空腹静脉血2ml，然后进行离心处理，离心速度1500r/min，离心时间10min，之后分离血清，获取的血清进行结核分枝杆菌IgG抗体检测。
具体的操作主要是按照不同试剂盒操作说明，规范性完成IgG抗体检测。
按顺序将2滴封闭液、40μl的新鲜血清标本、6滴洗涤液、2滴金标液等加入到反应板的反应孔，确保不同滴加物薄膜吸入，然后向反应孔中加入6滴洗涤液，确保薄膜吸收，观察试剂盒中有无红色斑点的出现。
如果质控点是红色，反应孔中间出现红色斑点，则表明IgG抗体为阳性；如果指控点为红色，反应孔中间无红色斑点则为阴性。
根据目前研究分析，结核病患者经过检测，其IgG抗体阳性率明显高于非结核病IgG阳性率，提示通过IgG抗体检测，可作为结核病临床诊断的方法之一。
3、结核分枝杆菌IgG抗体检测对诊断结核病的局限性？结核分枝杆菌IgG抗体检测在诊断结核病过程中，主要使用胶体金法，该方法在实际应用期间存在一定的局限性。
牛结核分枝杆菌y-干扰素在牛结核病检测中的优势
牛结核分枝杆菌y-干扰素在牛结核病检测中的优势牛结核是一种常见的传染病，在全球范围内都有发生。
它由分枝杆菌通过呼吸道或消化道等途径传播，会引起牛只的呼吸系统、淋巴组织、胸腺和泌乳器等部位的感染。
牛结核对于农业和畜牧业的发展会造成重大的经济损失，而且它也是一种致病性很强的病原体，会对牛只的身体健康和人类的健康造成直接或间接的危害。
为了及早发现牛结核的感染情况，可采用很多种方法，其中牛结核分枝杆菌y-干扰素检测方法是一种具有优势的检测方法。
牛结核分枝杆菌y-干扰素检测方法牛结核分枝杆菌y-干扰素是一种注射剂，由基因重组技术制备而成。
它含有重组的人类y-干扰素基因和牛结核的菌株，能够诱导牛只体内分泌y-干扰素，通过检测牛只的血清y-干扰素含量，来对牛结核进行诊断。
牛结核分枝杆菌y-干扰素检测方法的优势灵敏度高牛结核分枝杆菌y-干扰素检测方法可以检测到牛只体内非常微小的牛结核分枝杆菌感染，因此它的灵敏度非常高。
通过对标准菌株和实际样本的检测，研究人员发现该方法可以检测到1-10个CFU/mL的分枝杆菌。
特异性好牛结核分枝杆菌y-干扰素检测可以特异性地检测到牛结核分枝杆菌，不会对其他的细菌或病原体产生干扰。
因此，该方法可以避免错误的诊断和误判。
操作简便牛结核分枝杆菌y-干扰素检测的操作比较简便，只需要提取牛只血清并将其置于检测板中，加入指定稀释的检测液，进行相应的反应，最后读取检测结果即可。
该检测方法的简便性有助于加快检测速度，提高检测效率。
确诊效果好牛结核分枝杆菌y-干扰素检测结果非常准确和可靠，不同于其他检测方法可能会因为疫苗接种等原因产生假阳性或假阴性的结果。
此外，通过对大量临床真实样本的检测，牛结核分枝杆菌y-干扰素检测方法可以发现一些被其他检测方法无法发现的牛结核患者。
结论牛结核分枝杆菌y-干扰素检测方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便以及确诊效果好等优势，可以在牛结核病的诊断和监测中被广泛应用。
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牛副结核分支杆菌抗体检测试剂盒
使用说明
用途：
牛副结合分支杆菌抗体检测试剂盒是爱德士的一种酶联免疫吸附试验，可检测来
源于反刍动物血清或血浆样品中的牛副结核分支杆菌特异性抗体。
概述：
牛副结核病又称Johne氏病，是由感染副结核分支杆菌引起的衰竭性、慢性肠炎。
被感染的主要宿主是牛、绵羊和山羊，但也可感染猪和马。在世界上大部分地区受该
病的影响，引起值得重视的经济损失。早期诊断对控制该病是十分重要的。细菌培养
是一种确认的检测方法，但是耗费时间和劳力。对牛副结核分支杆菌（M.PT）特异性
抗体检测通常用于筛选性的检测。尽管在不同的实验室之间检测标准有所区别，但在
某些国家做血清学诊断时仍用补体结合试验。酶联免疫吸附试验（ELISA）的特点是
他的敏感性高。用草分支杆菌（M.phlel）吸附后，酶联免疫吸附试验（ELISA）的特
性得到改进，是为了减少与其他分支杆菌和相关细菌的交叉反应。
试剂：
所有试剂贮存在2--8℃，只供兽医使用。
数量
1、M.pt抗体包被板/条 2块 5块
2、10x倍浓缩洗液 125ml 480ml
3、阴性对照 0.5ml 0.9ml
4、M.pt阳性对照 0.5ml 0.9ml
5、样品稀释液（Absorbent Solution） 45ml 100ml
6、（HRPO）辣根过氧化物酶（100x） 0.4ml 0.9ml
7、TMB/H2O2底物溶液 30ml 60ml
8、终止液—1M HCL（注意！强酸） 30ml 60ml
原理：
所有试剂要保存在2--8℃。
仅供兽医使用。畜得测（Herdchek）M.pt牛副结核分支杆菌抗体检测试剂河，是
检测来源于反刍动物血清或血浆中牛副结核分支杆菌特异性抗体。该间接酶联免疫吸
附试验（ELISA）是用副结核分支杆菌（M.pt）抗原包被微量孔。首先预孵育样品和
草（phlei）分支杆菌提取物，这是为了结合非特异性抗体。然后将和草（phlei）分
支杆菌提取物预孵育过的样品加入抗原包被微量孔，特异性抗体将结合在固定的层面
上，未结合的物质经过洗涤被去除。用辣根过氧化物酶（HRPO）标记的蛋白质G缀合
物，可检测出结合的抗体。标记的蛋白质G可以和多种抗体反应。底物由于酶的存在
而转化成一种物质，该物质与显色剂产生蓝颜色。加入终止液后产生黄颜色。吸收值
可以用单波长450nm[A(450)]或450nm和620nm[A（450/620）]双波长的分光光度计
检测。样品对样品阳性率用检测样品[A（450）]或[A（450/620）]的吸光值和阳性对
照计算。用阴性对照吸光值修正。
自备材料：
1、精确的微量移液器或连续移液器，用来吸取10—100微升（ul）的液体；
2、一次性微量移液器吸头；
3、用来稀释洗涤液的500ml量筒；
4、适用96孔微量反应板的酶标仪；
5、纯化水（去离子水或蒸馏水）；
6、吸取和加入洗液用的仪器；
7、用于抽气防污染的真空泵；
8、可保湿的箱体或微量板密封材料；
9、混匀器；
10、离心管或微量管。
注意事项：
1、尽管保包被板中M.pt抗原已无传染能力，但是必须谨慎处理。
2、不要用口吸液；
3、操作样本和试剂盒时不能饮食、抽烟。
4、TMB和样品稀释液对眼、呼吸系统和皮肤具有腐蚀性，皮肤和眼应避免接触。
5、终止液含有1M HCL，会引起灼伤。
6、TMB溶液不能直接暴露在日光下，也不可接触任何氧化剂；应用干净的玻璃皿
或塑料试剂槽盛装TMB。
7、试剂盒内所有组分应保存在2--8℃，使用前恢复到室温；使用后再放回2--8℃。
为避免产生结晶，10x浓缩洗涤液可于室温存放。
8、所有使用的材料在废弃前，应做无污染化处理。
9、防止试剂盒内组分被污染。
10、不要使用过期的试剂，也不要把不同批号的组分混放在一个试剂盒内。
11、严格遵守检测规程，在全部操作中需要仔细、准确移液、定时洗涤，可以获
得最好的结果。
12、种对照在每次的检测中都必须做。
13、在检测中只能用蒸馏水或去离子水配制试剂。
14、未使用的微量板孔必须经密封后放在封口的塑料袋内放于2--8℃。
试剂准备：
微量板或条，样品稀释液、对照液、TMB底物液和终止液可直接使用，不需再配
制。
洗涤液制备：
先将10倍浓缩的洗液置室温20--25℃，并摇动混合，确保析出的盐类全部溶解。
浓缩洗液必须用纯化水（蒸馏水/去离子水）作10倍稀释（每板约需40ml浓缩液加
入360ml蒸馏水）。
HRPO辣根过氧化物酶（100x）:
使用浓缩辣根过氧化物酶前，必须用1x的洗液进行稀释。如果只使用部分板，
计算出足够使用的浓缩辣根过氧化物酶，用1x的洗液将其做100倍稀释，并在混匀
器上混匀。例如：1块板需120ul（100x）的浓缩辣根过氧化物酶加入12ml的（1x）
洗液，并在混匀器上混匀。
样品的准备：
操作预孵育这一步骤是使用塑料管或没有包被的微量孔，每次吸取样品时必须更
换吸头。
1、取135ul的稀释液加到每孔或每管。
2、在阳性对照孔、阴性对照孔和样品孔中分别加入对应的15ul阳性对照、阴性
对照和15ul样品，并使加入液均匀布满孔底。
3、在室温（18--25℃）孵育60分钟。
检测规程：
注意：试剂盒各组分在使用前放置室温（18--25℃），试剂各组分在室温至少放
置1小时。
1、将已预孵育过的对照和样品各100ul移至微量板对应的抗原包被孔中。放置
一个湿盒中或将微量板密封避免蒸发，室温孵育60分钟。
2、倒空孔内液体并用1x的洗液（见《试剂的准备》）淋洗5次加样孔。每次淋
洗时，每孔的洗液要加满。最后一次洗完，倒空所有孔内液体并用力扣拍微量板以去
掉孔内残余的液体。或者用自动洗板机淋洗微量孔，每孔加入250—300ul洗液。
注意：加样品和对照后的微量孔，在洗涤时应谨慎操作防止交叉污染，确定所有
孔内的残余颜色被去除。
3、各孔中加入100ul的稀释后的HRPO辣根过氧化物酶（见《试剂的准备》），放
置一个湿盒中或将微量板密封避免蒸发，室温孵育30分钟。
4、洗涤各孔（见步骤2#:倒空孔内液体并用1x的洗液淋洗5次加样孔。每次淋
洗时，每孔的洗液要加满。最后一次洗完，倒空所有孔内液体并用力扣拍微量板以去
掉孔内残余的液体。），各孔中加入100ul底物液后置黑暗中，室温18--25℃孵育10
分钟，从第一孔加入底物液开始计时。
5、10分钟后每孔加入100ul的终止液停止反应。倒空孔内液体并用1x的洗液淋
洗5次加样孔。每次淋洗时，每孔的洗液要加满。最后一次洗完，倒空所有孔内液体
并用力扣拍微量板以去掉孔内残余的液体。每孔加入100ul的终止液停止反应,(是否
再孵育10分钟？？)操作程序同步骤4#底物的加入。
6、用微量板读数仪以450nm或以450nm和620nm双波长测量样品和对照的吸收
值。（用空气调零）。
结果：
阳性对照平均数（XPC）和阴性对照平均数（XNC）之间的差（P-N）必须大
于或等于0.150，且阴性对照孔所得的均值必须小于或等于0.20，检测才有效。对于
无效的检测，应怀疑操作技术，并应遵循产品说明书重新检测。
每份样品M.pt抗体的吸收值是由样品与阴性对照（S/P）的比值确定的，阳性对
照是标准化的，代表显著的M.pt抗体水平。见样本的计算。
注意：北京爱德士元享生物科技有限公司提供所需的设备和软件（xchek），计算
平均值、S/P比值和提供综合信息。
计算方法：
1、阴性对照平均值（XNC）的计算
2
21450450ODODXNC阴性阴性
例如：085.02090.0080.0
2、阴性对照平均值（XPC）的计算
2
21450450ODODXPC阳性阳性
例如：505.02500.0510.0
3、S/P值的计算
S/P值=XNCXPCXNCOD450样品
例如：样品平均值=0.450
S/P=87.0420.0365.0085.0505.0085.0450.0
结果判定：
牛 1.牛样品S/P值小于或等于0.15，样品判为M.pt抗体阴性。
2. 牛样品S/P值在0.15—0.30之内，样品判为可疑。
3. 牛样品S/P值大于或等于0.30，样品判为M.pt抗体阳性。
小型反刍动物
1. 小型反刍动物样品S/P值小于或等于0.30，样品判为M.pt抗体阴性。
2. 小型反刍动物样品S/P值在0.30—0.40之内，样品判为可疑。
3. 小型反刍动物样品S/P值大于或等于0.40，样品判为M.pt抗体阳性。
注意：单头动物检测的结果只可在有副结核史和已知整群检测结果后才可判定。
尽管通常被感染的是初生牛，它的免疫反应不能立即形成。目前有资料认为血清转换
通常发生在任何临床症状出现之前。