结核杆菌(TB)核酸扩增(PCR)荧光体外检测试剂盒
体外诊断试剂分类和常见产品技术原理及应用
体外诊断试剂的分类（三）
按照技术方法分： 1.比色法（颜色反应）；2.分光光度法； 3.凝集法；4.散射法（沉淀反应）； 5.透射比浊法（沉淀反应）；
6.速率法、终点法（产物或底物量）；
7.标记技术；8.生物亲和；9.免疫技术； 10.发光技术；11.荧光技术；12. 放射技术；
13.形态分析； 14.流式细胞；15.电泳技术；
普通生化类试剂（清洁环境）
★原理：与普通生化试剂（十万级要求）类相同。 ★产品涉及：无机离子检测、血气电解质类、血液分析仪用试剂类等试剂。
★ 工艺要求：除生产可在清洁环境中进行操作外，生产工艺和关键控制点与普通生化试剂（十万级要求）类相同。
（第十四类） 干化学类试剂
干化学试剂（条、卡或盒）：干化学尿液分析试纸条； 尿微量白蛋白（UALB）测试卡
常见的体外诊断产品技术原理及应用
在实际应用中，单一技术往往不能满足检测需要，因此，诊断试剂会联合使用多种技术。常见的体外诊断产品：
1.生化分析仪、生化试剂；
2.酶标仪、酶免试剂； 3.免疫化学发光仪及试剂；
4.胶体金（乳胶、荧光）免疫层析试剂；
5.血细胞分析仪、细胞检测试剂；
6.尿液分析仪、尿液检测试剂（试纸）；
注：*号的品种，预期用途为血源筛查时按药品受理和审评，为临床诊断时，按第三类医疗器械进行管理。
体外诊断试剂的分类（二）
二、 按医疗器械受理和审评的体外诊断试剂 ：
1、临床血液学和体液学检验试剂
2、临床化学检验试剂 3、临床免疫学检验试剂 。 4、微生物学检验试剂 5、组织细胞学检验试剂 6、变态反应、自身免疫诊断检验试剂（盒） 7、遗传性疾病检验试剂 8、分子生物学检验试剂 9、其它检验试剂（盒）
T细胞检测和荧光PCR检测在结核分枝杆菌检测中的比较
T细胞检测和荧光PCR检测在结核分枝杆菌检测中的比较杨玉前【摘要】Objective To compare the sensitivity and specificity between T cell assay and fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis, and the application prospect in grassroot work of tuberculosis control and prevention. Methods Fluorescent PCR assay was used to detect the Mycobacterium tuberculosis in 194 fasting sputum specimens of suspected or con-firmed active tuberculosis collected from October the first 2013 to October the first 2014, and the results were compared with those of blood T cell assay. Results The positive rate of fluorescent PCR assay and T cell assay for the detection of Mycobacterium tu-berculosis was 12.9% and 7.7%, respectively, the diagnosis rate was 56% and 93.3%, respectively. Conclusion The specificity of T cell assay is higher while the sensitivity is poorer compared to the fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tu-berculosis. As there are various interfering factors existing in the clinical practice, combinative application of the two methods can improve the early diagnosis rate of tuberculosis.%目的：比较T细胞检测和荧光PCR检测两种方法对结核分枝杆菌检测的敏感性、特异性，及在基层结核病防治工作中的应用前景。
荧光定量PCR和FISH技术诊断肺结核的价值比较
荧光定量PCR和FISH技术诊断肺结核的价值比较温韵洁;刘丽军;罗伟权;林斌;邓永键【摘要】目的比较荧光定量PCR和FISH技术对肺结核诊断的敏感性和特异性.方法共收集300例明确诊断为肺结核的患者作为阳性对照组,以及收集300例健康志愿者(明确排除肺结核患者)做为阴性对照组.收集800例新收临床疑似肺结核患者做为研究组.收集该800例患者的肺活检标本以及同期的痰液标本,其中痰液进行涂片、结核杆菌分离培养以及结核杆菌DNA荧光定量PCR检测和FISH检测.比较荧光定量PCR和FISH技术对肺结核诊断阳性符合率和阴性符合率.结果①FISH 技术检测结核杆菌阳性符合率为99.3％;荧光定量PCR检测结核杆菌阳性符合率为97.3％.两者阳性符合率存在统计学差别(p=0.015).②FISH技术检测结核杆菌阴性符合率为98.2％,荧光定量PCR技术检测结核杆菌阴性符合率为96.9％.两者阴性符合率存在统计学差别(p=0.007).结论与荧光定量PCR比较,FISH对肺结核诊断具有较高的阳性符合率和阴性符合率.【期刊名称】《现代医院》【年(卷),期】2014(014)011【总页数】3页(P85-87)【关键词】肺结核;荧光定量PCR;荧光标记原位杂交技术【作者】温韵洁;刘丽军;罗伟权;林斌;邓永键【作者单位】广州华银医学检验中心有限公司广东广州510000;广州华银医学检验中心有限公司广东广州510000;广州华银医学检验中心有限公司广东广州510000;广州华银医学检验中心有限公司广东广州510000;南方医科大学广东广州510000【正文语种】中文结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病［1－2］。
根据世界卫生组织的统计，我国是全球22 个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27 个耐多药结核病流行严重的国家之一［3］。
近十余年来，随着分子生物学的高速发展，以及检测手段的提高、检测软件的不断发展，基因诊断技术作为结核病非培养诊断技术是近年来结核病诊断的一项重大突破，具有特异、敏感、快速鉴定结核病的优点。
结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤
结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤结核分枝杆菌是引起结核病的病原体之一，因其具有较强的传染性和致病性，早期准确、快速地检测结核分枝杆菌对于结核病的防控具有重要意义。
为了满足临床检测需求，研发结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒是非常必要的。
下面是研发结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒的一般步骤：1.确定检测指标：首先需要确定要检测的结核分枝杆菌的特异性指标，常用的指标包括结核分枝杆菌特异性区域的基因片段、结核分枝杆菌特异性抗原等。
根据已有的研究结果和实际需求，选择一个或多个特异性指标作为荧光定量检测试剂盒的靶点。
2.设计引物和探针：根据选定的靶点，设计特异性的引物和探针。
引物和探针的设计需要考虑其与目标序列的亲和力和特异性，同时需要避免与其他相关菌株的DNA序列发生杂交。
3.合成引物和探针：根据设计的引物和探针序列，通过化学合成的方式合成引物和探针。
合成的引物和探针需要经过质量检测，确保其纯度和特异性。
4.设计PCR反应体系：根据引物和探针的特点，设计PCR反应的体系，包括反应缓冲液的配制、核酸模板的添加量、引物和探针的浓度等。
优化PCR反应条件，确保其在荧光定量检测的条件下具有高灵敏度和特异性。
5.建立荧光定量PCR方法：使用设计的引物和探针以及优化的PCR反应体系，进行一系列实验优化步骤，包括PCR温度和时间条件的优化，反应体积的优化，引物和探针的最佳浓度等。
通过不断的试验验证，建立一个可重复、准确、灵敏的荧光定量PCR方法。
6.确定标准曲线和阈值：通过使用已知浓度的结核分枝杆菌标准品，进行一系列PCR反应，并测量荧光信号强度。
根据PCR反应体系中添加的结核分枝杆菌标准品的浓度和相应的荧光信号强度，绘制标准曲线。
根据标准曲线的斜率和y-截距，确定荧光信号阈值，用于定量测定未知样品中的结核分枝杆菌浓度。
7.优化试剂盒成分：根据已建立的荧光定量PCR方法，进一步优化试剂盒的成分，包括引物和探针的最佳浓度、反应缓冲液的配制等。
结核杆菌核酸扩增检测试剂盒说明书
结核杆菌(TB)核酸扩增检测试剂盒说明书(PCR-荧光探针法)【名称】通用名：结核杆菌(TB)核酸检测试剂盒说明书英文名：Mycobacterium Tuberculosis Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction(PCR)Diagnostic kit汉语拼音：jie he fen zhi gan jun he suan kuo zeng jian ce shi ji he【目的】本试剂盒适用于检测疑似患者痰液、血液、及乳液或肺脏组织等样本中结核分支杆菌(TB)DNA，用于结核分支杆菌(TB)感染的辅助诊断及流行病学调查。
其检测结果仅供参考。
【原理】本试剂盒选取一对结核分支杆菌(TB)一段高保守区域特异性引物和一条特异性荧光探针，应用碱裂解法提取DNA，后者在耐热DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR-荧光探针体外扩增法对结核分支杆菌(TB)进行扩增，从而达到快速实时定量检测之目的。
【组成】名称数量规格核酸提取液B4管500μl/管Taq酶系1管80μl/管TB PCR MIX1管960μl/管TB-阳性质控品1管50μl/管(1×107Copies/ml)阴性质控品1管500μl/管【标本采集、保存和运输】1.适用标本：血液、痰液、乳液或肺脏组织等。
2.标本采集：血液：无菌注射器抽取待检者静脉血2-3ml，置于EDTA2Na抗凝管中，充分混匀，密闭送检。
痰液：无菌条件下取受检者深部痰液2-3ml，置入5ml离心管，密闭送检。
3.保存和运输：上述处理后的标本可保存于-20℃，保存期为6个月，-70℃可长期保存。
运送应采用0℃冰壶。
【适用仪器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、ABI PRISM7300、LightCycler等毛细管的仪器，MJ Opticon系列或取得资格认证的定量PCR仪。
痰涂片抗酸染色、结核抗体试验、荧光PCR、T-SPOT.TB在肺结核诊断中的临床意义
痰涂片抗酸染色、结核抗体试验、荧光PCR、T-SPOT.TB在肺结核诊断中的临床意义秦庆;胡瑛;吕永强【摘要】目的比较痰涂片抗酸染色、结核抗体试验、荧光PCR和结核感染T细胞斑点试验在肺结核诊断中的价值.方法 96例经肺结核诊断和治疗指南标准确诊为肺结核患者设为实验组,56例其他肺部疾病(非肺结核)患者设为对照组,用上述四种方法同时进行检测.计算每种方法的灵敏度、特异度、准确性,并进行四种检测方法之间的配对X2检验.结果痰涂片抗酸染色、结核抗体试验、荧光PCR、T-SPOT.TB检测的灵敏度分别为11.46％、44.80％、38.54％和93.75％,特异度分别为98.96％、82.14％、94.64％、91.10％,准确性分别为43.42％、58.55％、59.21％、92.76％,四种方法两两之间比较差异均有统计学意义.结论每种方法各有优缺点,综合评价T-SPOT.TB检测方法优于其他三种方法.工作中,应多种检测方法联合使用,以便对肺结核做出正确的诊断.【期刊名称】《中国医药科学》【年(卷),期】2017(007)021【总页数】4页(P130-133)【关键词】抗酸染色;结核抗体试验;TB-DNA;T-SPOT.TB;肺结核【作者】秦庆;胡瑛;吕永强【作者单位】中国人民解放军第210医院检验科,辽宁大连116021;中国人民解放军第210医院检验科,辽宁大连116021;中国人民解放军第210医院检验科,辽宁大连116021【正文语种】中文【中图分类】R521结核病是由于结核分枝杆菌感染人体各个器官而引起的一种慢性传染病，其主要侵袭的是肺部脏器，作为危害人类健康的传染病之一，是中青年人的重要死因[1]。
结核病之所以得到全世界的重视，不仅仅是发病率高，其死亡率长期以来一直居高不下，最主要原因是缺少快速有效的检测方法[2]。
结核病的临床表现复杂多样，对临床医生诊断该病带来了很大的障碍。
目前结核病的普查方法是结核菌素试验，该方法在全世界广泛的应用，但在我国由于非结核分枝杆菌感染率较高，因此TST 出现了较多的假阳性，而免疫力低下的患者，又会出现一定的假阴性[3]。
如何用PCR技术检测结核杆菌
如何用PCR技术检测结核杆菌PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，可以在体外迅速扩增目标DNA片段。
结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起结核病的主要致病菌，PCR技术可以帮助快速、敏感地检测结核杆菌的存在。
PCR技术的基本原理是在适当的温度和条件下，通过DNA的模板作用，采用DNA聚合酶酶促反应，不断重复进行DNA的复制和扩增。
PCR主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
检测结核杆菌的PCR方法通常基于目标DNA序列的选择。
结核杆菌的完整基因组中有很多可供选择的DNA序列，其中包括ESAT-6（Early Secreted Antigenic Target 6-kDa protein）和MPB64（Mycobacterial Protein of 64 kDa）等。
这些DNA序列作为靶序列，能够准确、特异地识别结核杆菌。
PCR检测结核杆菌的具体步骤如下：1.样本采集：从患者的痰液、组织或其他临床样本中采集目标DNA。
对于结核杆菌的检测，通常采集深咳嗽产生的痰液样本。
2.DNA提取：利用商业化的DNA提取试剂盒或其他方法，从样本中提取出DNA。
DNA提取过程中需要注意避免污染和降解DNA。
3. PCR反应体系的制备：准备PCR反应体系，包括引物（primer）、缓冲液、聚合酶、模板DNA等。
4.PCR反应条件的设置：设置合适的PCR反应条件，包括退火温度、延伸温度和时间等。
这些反应条件的选择需要根据引物的退火温度和特异性来确定。
5.PCR反应的进行：将PCR反应体系加热至相应温度，开始PCR反应。
PCR反应通常经历多个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
6.PCR产物的分析：利用凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可以通过检测标记在PCR产物上的荧光剂或染料来确定PCR反应的结果。
7.结果判断：根据PCR反应产物的大小、形状和荧光信号等特征，判断是否存在结核杆菌DNA。
1150817803结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书
结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒(PCR-荧光法) 说明书【产品名称】通 用 名 称：结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)【包装规格】32人份/盒【预期用途】本试剂盒用于定性检测患者痰液中结核分枝杆菌核酸,可作为临床结核分枝杆菌检测的辅助手段。
适应症：由结核分枝杆菌感染引起的肺结核、肠结核、结核性腹膜炎等疾病。
【检验原理】本试剂盒选用结核分枝杆菌保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Tap酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，既能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对结核分枝杆菌核酸的自动化检测。
【主要组成成份】组成 组成成分 规格核酸提取液 含0.5％Triton-100、5％Chelex-100 1.8mL×1TB反应混合液 含Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP、引物、荧光探针 1.2mL×1Taq酶含TapDNA酶及抗体 14μL×1阳性对照品 主要成分为含TB基因组DNA（重组克隆）人工构建的质粒100μL×1阴性对照品 主要成分为TE Buffer 100μL×1注：不同批号试剂盒中各组份不可以互换。
【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月，未使用完的试剂继续冷冻保存不影响其稳定性，但试剂反复冻融不得超过三次。
【适用仪器】具有FAM荧光通道的ABI 7300 、ABI 7500 荧光PCR扩增仪。
【样本要求】1.标本：人痰液。
2. 采集：将患者用力咳出肺深部的痰液采集于无菌样本保存管，密闭送检。
采集具体方法请参考《微生物标本采集手册》一书。
3. 存放：2-8℃保存，不超过24小时；-20℃下保存，不超过3个月；-70℃下长期保存，但应避免反复冻融。
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结核杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光体外检测试剂盒
试剂盒简介：
深圳匹基生物工程有限公司开发的结核杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光体外检测试剂盒采用RT－PCR荧光探针检测技术检测结核杆菌TB核酸。
试剂盒特点
高灵敏度:该试剂盒在香港卫生署公共卫生检测中心与欧盟已批准的商业化ＡＲＴＵＳ试剂进行比对试验结果显示，相关性达到93％，达到国际先进水平。
高特异性
防污染:该试剂盒无需PCR后处理，完全闭管扩增和检测，有效地防范了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性。
操作简单、耗时短:试剂盒在特定的荧光PCR检测仪上进行扩增和检测，不需要进行电泳或杂交的操作，只需0.5－1.5小时（针对不同机型）即可完成PCR过程，有利于提高报告出具的速度。
适用面广:本试剂盒可对粪便和血浆样本进行检测。
结果客观可靠:无需人为判断，仪器自动收集和分析数据。
适用机型：PE5700；PE7000；MJ OpticonⅡ；Roche LightCycler；
ABI7300/7500/7900；Roter-gene等
近20年来，曾经控制在很低水平的结核病，在世界范围内有死灰复燃
的趋势。
全球现有结核病人2000万人，其中95%的病人是在发展中国家，如果不加控制，今后10年还将有3亿人受到结核杆菌的感染。
为此，世界卫生组织于1993年宣布全球进入结核病紧急状态，1998年又重申遏制结核病的行动。
根据最新的卫生部调查显示：我国有5.5亿人感染过结核杆菌，目前有肺结核病人约450万，其中传染性肺结核病人约150万，结核病患者数量居世界第二位。
中国每年style="COLOR: black"约有145万新发病例，是全球22个结核病高负担国家之一，每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。
如果不采取有效措施，在未来的10年中，可能有3000万人发生结核病。
结核病的致病菌是结核杆菌，属于放线菌目分支杆菌科分支杆菌属。
结核杆菌主要通过呼吸道传播，还可通过消化道进入人体。
结核杆菌对外界的抵抗力较强，在阴湿的地方能生存5个月以上，因此带菌的痰液是结核杆菌主要的传染源。
健康人吸入病人咳嗽、打喷嚏时喷出的飞沫，即可引起肺部结核杆菌感染。
结核病有一个不同于一般传染病的发病特点，即大多数人被传染上结核杆菌后并不马上发病，多数可以终生不发病。
结核杆菌在人体内可以长期潜伏，处于静止不活动状态，其中约5%~8%的人在随后的几年甚至数十年后，由于各种原因导致机体抵抗力降低时发病。
结核杆菌被吞噬细胞吞噬后可经淋巴-血循环散播到全身，在人体免疫力低下时而造成多种系统或脏器的结核病变，如骨结核、肾结核、生殖器结核、结核性脑膜炎等。
结核杆菌常规检验方法主要有以下几种：
痰涂片镜检结核杆菌对苯胺染料、特别是石炭酸复红具有独特亲和力，一经染色，再用酸性酒精冲洗无法使之脱色，在显微镜下即可识别。
痰涂片方法虽然操作简易，但其阳性率通常只有30%左右，并可为其他抗酸性分枝杆菌如耻垢分枝杆菌污染等。
培养法对结核杆菌最可靠的诊断方法就是培养法，但结核杆菌生长缓慢，人工培养通常需要2-4周才能有菌落生长，不利于临床上的及时诊断和用药。
另经过抗结核药物治疗后，结核杆菌受到抑制，培养需要6-8周甚至20周后才出现菌落。
量过少或细胞壁缺陷菌及化疗后受到损伤的细菌均可导致培养失败。
影像学胸部X线检查不但可早期发现肺结核，而且可对病灶部位、范围、性质、发展情况和治疗效果作出判断，尤其适用于集体健康检查。
结核杆菌素试验结核杆菌素皮肤试验阳性率约为75%，但其阳性反应仅表示结核感染，并不一定代表患病。
血清抗体检测主要是PPD抗体检测。
血清结核抗体检测易于开展，但由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广泛的交叉，对其特异性是有影响的。
荧光PCR检测TB DNA的临床意义
荧光PCR检测主要是在一定的反应体系中通过首先查找到样本中结核杆菌本身的基因，并进而对其基因上某高保守的特定区段进行体外快速、高保真的复制增殖，使其迅速被放大到巨大的信号量而能够被检测到。
具有高特异性、高灵敏度、快速简便等特点。
结核杆菌易受物理、化学(药物)以及免疫因素的影响而发生变异(细胞壁缺陷型或称L型，耐药变异菌、持续菌或休眠菌等)，用传统细菌学技术难以检测出，造成假阴性、漏诊。
PCR方法检测对象是结核杆菌基因保守区段，不受细胞表型和耐药等因素的影响，可提高阳性的检出率和工作效率，为临床上及时诊断和治疗提供依据。
肺外结核包括多系统、多脏器、多种类型的结核病变，通常标本中含菌量较少，特别是组织等标本中的结核杆菌不易被暴露，不易获得细菌学证据，从而增加了的肺外结核的漏诊和误诊，造成治疗的延误。
PCR方法公认的高灵敏度对诊断和鉴别诊断肺外结核有较高的临床价值，可作为早期肺外结核的诊断方法。
血行播散性肺结核通常临床表现不典型，早期患者不咳或仅有干咳，或仅有发热等中毒症状，而无影象学的改变，极易误诊为其他疾病。
而用PCR 检测血标本中的结核杆菌可大大提高阳性诊断率。