几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
ß
把膜置于第二抗体中，温和振荡2小时
ß
在TBST中洗膜1小时，中间更换4次
ß
显影，定影这一步骤为最重要的步骤之一，非常容易出现问题，必须小心仔细，我们在实验中采用的是上海康成公司生产的第二代化学超敏发光试剂盒，说明书另附PDF。在实验中发现有时发光很快减弱；肉眼可以看到发光，但是底片显不出来等问题。联系了康成公司的技术员，改动如下：膜与发光显色剂接触时间改为2分钟（不是说明书中的5min），底片压片时间2分钟。显影时有一些基本的原则，如严格的避光，压片前注意排除气泡，压片过程中底片不能接触液体等，按照一定的规则放置膜。将底片压片曝光结束后，将其中一角折起以助定位。定影后将膜贴于显出的条带，条带旁表明marker条带。底片注明实验日期、名称。
（2）分类
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot（以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cruz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
蛋白互作几种方法比较
蛋白互作几种方法比较IP与CO-IP的关系：IP就是用抗体把你要的蛋白免疫沉淀下来，然后去检测它。
例如蛋白A在细胞内的蛋白量不同，或者有着不同的翻译后修饰，这是可以用A蛋白的抗体+prorein A beads来IP，从细胞中把A拉下,再用特异的抗体（如磷酸化，泛素化抗体）来检测A的变化。
co-ip的原理和IP是一样的，但是它检测的是和A相互作用的蛋白，也就是说用A的抗体把A拉下来后，用和A相互作用蛋白B的抗体去检测，来证明A和B之间的相互作用。
就是说只要用A的抗体把B拉下来就能证明A和B之间有相互作用。
这种关系只能说是存在相互作用，但这种相互作用并不能确定是直接的还是间接的，也就是所也许是A与c作用，而B也和C作用，这样，用A的抗体可以把C拉下来，但同时C 又把B也拉下来了。
要确定A和B之间直接的相互作用，你可以做体外的GST PULL DOWN实验。
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
（GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)）GST pull down 和 Coim munoprecipitation关系问题啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 学过生物的地球人都知道. 这是研究蛋白质相互作用的两种方法。
简单通俗的打个比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上, 除非蜂马牛不相及, 同类男女之间该发生的一般都会发生. 这种关系是直接的。
蛋白质电泳与操作
3. 分离；
1
4. 染色和脱色。
2
3
应用：用于分析蛋白质的分子量，常用于蛋白质 纯度鉴定和相对定量。
案例二：2-DE分析
• 2-DE简介：2-DE即双向凝胶电泳，是一种分离复杂 蛋白质混合物的方法。通过第一向等电聚焦和第二 向SDS-PAGE分离蛋白质，可展示蛋白质的等电点和 分子量。
案例二：2-DE分析
采用自动化技术，减少人为误差，提高电泳操作的重复性和可靠性。
04 蛋白质电泳实验注意事项
安全注意事项
1 2
避免使用未经灭菌的器具
在实验过程中，应确保所有使用的器具均经过严 格的灭菌处理，以防止微生物污染。
避免直接接触缓冲液
某些缓冲液可能含有刺激性或腐蚀性成分，应避 免直接接触皮肤或眼睛。
3
正确处理废弃物
03 蛋白质电泳技术优化
优化电泳条件
01
02
03
缓冲液选择
根据蛋白质的性质选择合 适的缓冲液，以提高电泳 分离效果。
电压与电流控制
优化电泳过程中的电压和 电流，以获得更好的分辨 率和分离效果。
电泳温度
选择适当的电泳温度，以 减少热量对蛋白质的干扰， 提高分辨率。
改进样品制备方法
样品溶解与变性
采用适当的溶解和变性方法，使蛋白质充分溶解并保持其天然构 象。
琼脂糖凝胶电泳
根据蛋白质分子的电荷和分子 量进行分离，常用于基因工程 和分子生物学研究。
等电聚焦电泳
根据蛋白质分子的等电点进行 分离，常用于蛋白质组学和生
物医学研究。
蛋白质电泳的应用
蛋白质组学研究
用于鉴定、分离和比较不同组织和细胞类型的蛋 白质，有助于深入了解生命活动的分子机制。
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较(总6页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除蛋白质各种定量方法的优缺点的比较1．蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏（Kjeldahl）定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是 3 分子的脲经180℃左右加热，放出1分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg）优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近缺点：①灵敏度差；②③三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3 Folin-酚试剂法原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
测定范围：20~250ug优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效缺点：①费时，要精确控制操作时间；②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐,且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和脲素均会干扰反应。
鉴别蛋白质的方法
鉴别蛋白质的方法
鉴别蛋白质的方法主要有以下几种：
1. SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）：通过对蛋白质进行电泳分离，根据蛋白质分子量的差异在凝胶中形成不同的条带，可以确定蛋白质的存在与否以及其分子量大小。
2. Western blotting（免疫印迹）：通过将蛋白质从电泳凝胶转移到膜上，然后用特定的抗体与目标蛋白发生特异性结合，通过检测抗体与目标蛋白的结合情况来确定蛋白质的存在与否及其相对数量。
3. 质谱：使用质谱仪对蛋白质进行分析，通过解析蛋白质的质荷比特征峰，可以确定蛋白质的分子量、序列和修饰（如糖基化、磷酸化等）等信息。
4. 免疫染色：利用特异性抗体标记蛋白质，通过显色检测方法（如免疫组化染色、免疫荧光染色等），可以直观地观察蛋白质的位置和表达情况。
5. X射线衍射：通过将蛋白质晶体暴露在X射线下，通过测量晶体中X射线的衍射模式，可以解析出蛋白质的结晶结构，从而确定其原子级别的构造。
以上方法的选择取决于研究的目的和所需的信息深度，常常结合使用，来确保对蛋白质进行全面的鉴别分析。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
蛋白质分子量测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较梁永达（复旦大学药学院，上海）摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。
该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。
关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法Comparison of the methods of molecular weightdetermination of proteinsLiangYongda(School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai)Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages.Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。
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几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较
作者：秦慧，刘霆，柳斌，宋鑫，黄欣，杨金亮，赵霞，魏
于全
【摘要】 本研究对蛋白质染色法进行比较和分析，以求获得满足
蛋白质组研究所需的适宜的蛋白质检测法。实验采用2-D电泳分离急
性早幼粒白血病细胞株NB4的全蛋白及1-D电泳分离蛋白质分子量标
准物，从蛋白质检测的灵敏性、质谱兼容性、操作的简便性等角度，
比较了传统考马斯亮蓝染色法、胶体考马斯亮蓝染色法、改良考马斯
亮蓝染色法和银染法4种蛋白质着色法对凝胶分离蛋白质的检测影
响，探讨了影响蛋白质染色与鉴定的影响因素。结果显示，银染检测
灵敏度最高，但质谱鉴定相容性差，鉴定率近10%；改良考马斯亮蓝
染色法检测灵敏度也高，可达4 ng/spot，质谱鉴定率可接近55%。结
论： 改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质检测灵敏度高，与质谱兼容好，
能满足蛋白质组研究需要。
【关键词】 蛋白质组
Abstract The aim of this study was to compare and analyze
protein staining in order to select the optimal staining method
for proteomic research. Proteins from acute promyelocytic
2
leukemia cell line NB4 and protein molecular weight marker were
separated respectively by 2-D or 1-D electrophoresis and
detected respectively by the typical Coomassie brilliant blue，
the colloidal Coomassie brilliant blue，the modified Coomassie
brilliant blue and the silver staining protocols. The protein
detection sensitivity，compatibility with mass spectrometry (MS)
and facility of the four staining protocols were compared. The
results indicated that the silver staining exhibited the highest
sensitivity and MS showed the lowest compatibility 10% of
protein identification rate. The detection sensitivity of the
modified Coomassie brilliant blue staining was superior to that
of other two Coomassie brilliant blue stainings，close to but
lower than the silver staining，however the compatibility with
MS was better （protein identification rate about 55%）. It is
concluded that the protein detection sensitivity of the modified
Coomassie brilliant blue staining is high，and its compatibility
with MS is better，this modified Coomassie brilliant blue
staining is an optimal staining method for proteomic research.
Key words proteomics；two-dimensional gel
electrophoresis；protein detection；Coomassie brilliant blue
staining；silver staining
3
蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的
质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨
率，同时也影响后续的质谱鉴定。选择适当的蛋白质染色法将有助于
提高蛋白质组学研究结果的质量。蛋白质的染色常用的有4类：有机
试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马
斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质
分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高，却常
与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，
能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作
为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题
［1-4］。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质
着色法是蛋白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近
年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改
进，方法众多，评价不一 ［5-7］。我们在作双向凝胶电泳时，将常用
的几种考马斯亮蓝染色
法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
材料和方法
试剂