双向凝胶电泳的图像分析
(完整版)双向电泳原理与流程
GE Healthcare Life Sciences ——实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破
GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis
2002
Amersham Biosciences launched Ettan™ DIGE
1991
Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip
1973
1978
1982
LKB introduced Immobiline™
1979
Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte™
The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed
4/ GE Title or job number /
2/3/2020
Why 2DE?
Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches.
2/3/2020
利用双向凝胶电泳技术进行胃癌差异蛋白质组研究
Ａｂ ｔａ ｔ Ｏｂｅｔ ｅ：ｕ ｕ ｐ ｓ ｓｔ ｉｖ ｈ ｉｃｅ ａ ｃ ｒ ｔｉ ｒ ｍ ｒｔｏ ｎ ａ ｏ ｎ ａｉｎ ｆ ｒｖ ｒｆｉｇ ｔ ｅ ｓｒ ｃ ｊ ｃｉ ｏ ｒｐ ｒ ｏ ｅ ｗａ ｏ ｓｅ ｅｔ ｅｄ ｓｒｐ ｎ ｙ ｐ ｏ ｅｎ ｆｏ ｐ ｏ ｅ ｍｅａ ｄ ｌｙ ａ ｆｕ ｄ ｔｏ ｏ ｅ ｉ ｎ ｈ ｖ ｙ
ｐ ｒ ｉｕ ａ ｒ ｔ ｉ ｉ ｓ ｉ ａ ｔｉ ａ ｃｎ ｍａ Ｍｅ ｈ ｄ ： － ａ ｔ ｌ ｒｐ ｏ ｅｎ ｓｔ ｎ ｇ ｓ ｒ ｃ ｒ ｉ ｏ ． ｔ ｏ ｓ ２ ＤＥ（ ＷＯ ｄ ｍｅ ｓｏ ａ ｏ ｙ ｃ ｙ ａ ｄ ｅ １ｃ ｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ） ｗａ ｓ ｄ ｔ ｃ ｅ ｃ ｔ — ｉ ｎ ｉ ｎ ｌ ｐ ｌ ａ ｒ ｌｍｉ ｅ ｇ ｌｅｅ ｔ ｏ ｈ ｒ ｓ ｓ ｓ ｕ ｅ Ｏ
测 共 有 蛋 白 质 点 １０ ９个 ， 现 两 者 问 共有 １４个 差 异蛋 白质 点 ， 中 ４ ７ 发 ６ 其 １个 点 仅 在 胃 癌 组 织 中表 达 ，７个 点 仅 在 正 常 胃粘 膜 ２ 中表 达 ，９个 点 在 胃癌 组 织 中 高表 达 ，７个 点 在 胃癌 组 织 中低 表 达 。结 论 ： 过 优 化 的 双 向凝 胶 电泳 和 图像 分 析 技 术 对 胃癌 ３ ５ 通
利 用双 向凝 胶 电泳 技 术 进 行 胃癌 差 异 蛋 白质 组研 究
马 波 赵 吉 生 宋 燕
摘 要 目的 ： 离 胃癌 蛋 白质 组 ， 出 胃癌 组 织 的 差 异 蛋 白 质 点 ， 进 一 步 鉴 定 胃癌 的 差 异 蛋 白质 打 下 基 础 。 方 法 ： 用 二 维 分 找 为 利 聚 丙烯 酰胺 凝胶 电泳 （Ｗ —ｉ ｎｉｎｌ ｏｙ ｃｙａ ｄ ｅ ｅ ｃｒｐ ｏｅｉ，－ Ｅ 分 离 胃癌 组 和 正 常 胃粘膜 对 照 组 总 蛋 白 质 ， ｔ Ｏｄｍｅｓ ａ ｐ ｌａｒｌｍｉｅ ｌ １ ｔ ｈ ｒｓ ２Ｄ ） ｏ ｇ ｅ ｏ ｓ 并 通 过 优 化 的计 算机 图像 分 析 软 件 分 析 电 泳 图谱 。 结 果 ： 胃癌 组 织 中点 检 测 共 有 蛋 白质 点 １１７个 ， 常 胃粘 膜 组 织 中 点 检 在 ４ 正
蛋白组学二维电泳
第一向等电聚焦与IPG胶条的剥离
聚焦程序设置
剥离IPG胶条
根据蛋白质的等电点设置等电聚焦程 序。
聚焦完成后，将IPG胶条从聚焦盘上 剥离下来。
开始聚焦
施加电压，使蛋白质在IPG胶条上分 离。
第二向SDS-PAGE电泳
转移蛋白质
将IPG胶条上的蛋白质转移 到SDS-PAGE凝胶上。
开始电泳
施加电压，使蛋白质在凝 胶上分离。
02
二维电泳技术原理
蛋白质的等电点与分子量
蛋白质的等电点
蛋白质是两性电解质，在特定的 pH环境中，蛋白质分子呈电中性 状态，这个pH值就称为该蛋白质 的等电点。
蛋白质的分子量
蛋白质的分子量是指其分子的大 小，通常以道尔顿为单位表示。
固相pH梯度技术
原理
通过在电泳过程中保持恒定的电流， 使蛋白质根据其等电点在电场中移动 ，从而实现分离。
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蛋白质翻译后修饰的研究
总结词
详细描述
二维电泳在蛋白质翻译后修饰的研究中具有 重要价值，通过分离和鉴定修饰后的蛋白质， 可以了解蛋白质的修饰类型和修饰位点。
二维电泳能够分离出各种翻译后修饰的蛋白 质，如磷酸化、泛素化、糖基化等。通过质 谱等技术对这些蛋白质进行鉴定和修饰位点 的确定，可以深入了解蛋白质的修饰类型、 修饰位点和功能调控。这些结果有助于揭示 生命过程的调控机制和疾病发生发展的机维 的基础，能够将复杂的蛋白质混合物 分离成多个条带。
双向凝胶电泳技术
原理
结合了等电聚焦和SDS-PAGE两种技术，首先根据蛋白质的等电点进行分离， 然后再根据分子量进行分离。
应用
双向凝胶电泳技术能够全面地展示细胞或组织中蛋白质的表达情况，为后续的 蛋白质组学研究提供基础。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
蛋白质组学
8、2D电泳的原理。
基本原理IEF-SDS-PAGE是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
9、2D电泳图像分析流程。
☐凝胶图像的扫描：☐图像加工：☐斑点检测和定量：☐凝胶配比：☐数据分析：☐数据呈递和解释：☐2-DE数据库的建立：10、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是什么？SDS的作用是什么？基本原理:天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）,在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。
可得到天然蛋白质的分子量。
①聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。
②加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。
11、等电聚焦电泳中，载体两性电解质pH梯度电泳与固相pH梯度电泳有何区别？（1）载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳是在支持介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的线性的PH梯度（预电泳）。
当蛋白质放进此系统时，靠近阳极的侧的蛋白质处于酸性环境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的侧的蛋白质处于碱性环境中，带负电和向正向移动，最终都聚焦于其等电点相当的PH位置上，形成不同的蛋白质区带。
目前在样品分析中趋向于选用超薄水平板式，具有分析样品多，两性电解质用量少，结果重复性好等优点。
（2）固相pH梯度等电聚焦是基于凝胶中的固相pH梯度。
这些具有弱酸或弱碱性物质的丙烯酰胺衍生物共价结合到聚丙烯酰胺凝胶介质形成pH梯度后，带电的蛋白质分子便开始向自己的等电点位置迁移，直到到达自己的等电点。
双向电泳操作步骤
3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。
参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。
用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。
离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。
置于冰上裂解2h。
13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。
用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。
3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。
1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。
加入300μL沉淀剂。
振荡或倒置搅匀。
冰浴中（4~5℃）培育15min。
2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。
3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。
保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。
后离心5min，去上清。
4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。
将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。
在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。
-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。
5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。
小心地将上清液移走弃去。
此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。
6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。
振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。
凝胶电泳拍照方法
凝胶电泳拍照方法引言：凝胶电泳是生物学和分子生物学中常用的实验技术，用于分离和分析DNA、RNA和蛋白质等生物大分子。
而凝胶电泳拍照作为凝胶电泳实验结果的记录和保存方式，是实验过程中不可或缺的一部分。
本文将详细介绍凝胶电泳拍照的方法和步骤。
一、准备工作：1. 凝胶电泳仪的设置：根据实验需求和样品类型，调整凝胶电泳仪的参数，包括电压、电流和运行时间等。
2. 凝胶染色：将凝胶染色剂均匀地涂抹在凝胶上，使样品能够被清晰可见。
常用的染色方法有乙溴化乙锭染色法和银染色法。
二、拍照设备和设置：1. 相机选择：选择一台高分辨率的数码相机或专业的凝胶电泳成像系统。
相机的像素越高，拍摄的凝胶图像越清晰。
2. 布光设置：为了获得最佳的凝胶图像，应根据实际情况调整光线亮度和曝光时间。
较暗的环境中，增加光线亮度；较亮的环境中，减少光线亮度。
曝光时间的选择应使凝胶图像的明暗对比度较高，但避免过曝光或欠曝光。
3. 焦距设置：根据凝胶大小和需要捕捉的细节，调整相机的焦距。
通常情况下，较大的凝胶需要较长的焦距，而较小的凝胶则需要较短的焦距。
三、拍照步骤：1. 准备好实验室环境：确保实验室内光线适中，无明显的光源干扰，避免出现反光和阴影。
2. 凝胶定位：将凝胶放置在透明的凝胶图像拍摄板上，并确保凝胶完全平整。
注意避免手指触摸凝胶表面，以免留下指纹或损坏凝胶。
3. 设置相机：根据实验需要，选择合适的拍摄模式（如自动模式或手动模式），并进行相应的设置。
4. 调整焦距：使用相机的取景器或屏幕，调整焦距以使凝胶图像清晰可见。
可以通过放大取景器或调整相机位置等方式进行微调。
5. 拍摄凝胶图像：按下相机的快门按钮，拍摄凝胶图像。
建议进行多次拍摄，以确保至少有一张清晰可用的图像。
四、保存和分析：1. 存储图像：将拍摄到的凝胶图像保存到计算机或存储设备中。
可以选择保存为常见的图像格式，如JPEG或TIFF。
2. 图像分析：利用图像处理软件打开保存的图像文件，进行凝胶图像的分析和处理。
SDS蛋白电泳相关试剂配方
高低分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol ................................................................... - 2 - 1实验材料........................................................................................................................... - 2 -1.1标本采集................................................................................................................ - 2 -1.2主要试剂：............................................................................................................ - 2 -1.3主要仪器设备及软件：........................................................................................ - 3 -2实验方法........................................................................................................................... - 3 -2.1标本采集................................................................................................................ - 3 -2.2主要溶液配制........................................................................................................ - 3 -2.3蛋白质样品制备.................................................................................................... - 7 -2.4Bradford法蛋白质定量 ......................................................................................... - 8 -2.5SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 ......................................................................... - 9 -2.6等浓度混合低分化腺癌组（Pp）高分化腺癌组（Wp） ................................ - 10 -2.7双向凝胶电泳（IEF+SDS-PAGE）................................................................... - 10 -2.7.1第一向是等电聚焦电泳（isoclectric focusing，IEF）.................................. - 10 -2.7.2第二向SDS-PAGE电泳.................................................................................. - 11 -2.8图像分析.............................................................................................................. - 13 -2.9差异蛋白点的切取.............................................................................................. - 13 -高低分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol1实验材料1.1标本采集3例人高分化胃腺癌及3例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本（2009年4月-10月），并经病理检查确诊（WHO分型），所取组织没有出血和坏死。