蛋白质双向电泳实验报告
现代生物学技术实验报告
题目蛋白质双向电泳技术
姓名学号
专业
小组成员
指导教师
中国·武汉
年月
联系方式：
大肠杆菌组蛋白双向电泳技术
摘要：蛋白质双向电泳是一种等电聚焦与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术，也是蛋白质组学研究中分离纯化蛋白质的主要方法之一。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在等电点上的差异，而垂直方向反映出他们在分子量上的差别。本实验通过学习蛋白质双向电泳技术，熟悉了蛋白质双向电泳的简单流程。可以根据电泳所得的图像分析，分离蛋白质。
关键字：蛋白质双向电泳等电聚焦电泳 SDS-PAGE
前言：蛋白质组研究的发展以双向电泳技术（2-DE）作为核心。双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点（spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。本实验是要研究大肠杆菌中的蛋白质，并学习和初步掌握双向电泳技术。
正文：
1)实验原理：
从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二
向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH 环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。如果在pH梯度
环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH 即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质－SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然的电荷差别。在构象上，蛋白质－SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，这样的蛋白质－SDS复合物，在凝胶中的迁移就不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而仅取决于相对分子质量的大小，从而使我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）来测定蛋白质的相对分子质量。
单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺，在催化剂存在的条件下，通过自由基引发的聚合交联形成聚丙烯酰胺凝胶，这提供了蛋白质泳动的三维空间凝胶网络。在SDS - PAGE电泳时相对分子质量小的蛋白质迁移速度快，相对分子质量大的蛋白质迁移速度慢，这样样品中的蛋白质可以分开形成蛋白质条带。
2)实验步骤：
1.样品制备：
1.1 蛋白样品制备方法（TCA-丙酮法）
1、收集50mL菌液于离心管中，12000rpm，4℃离心一分钟
2、倒掉上清，加10mLPBSbuffer洗涤菌体一次， 12000rpm，4℃离心一分钟
3、去上清，加20mLPBSbuffer悬浮菌体，加入蛋白酶抑制剂（cocktail 一片），混匀
4、超声波破碎仪或压力破碎仪破碎细胞，至菌体悬浮液变澄清
5、12000rpm， 4℃离心10min，去除细胞碎片。
6、将上清转移到新的离心管中，加入适量的核酸酶，混匀，室温放置
20min，以除去样品中的核酸。
7、取0.9mL样品裂解液分装到1.5ml离心管中，并在离心管中加入0.3ml 40%的TCA（每组做4管，做好标记）。
8、混匀后，放置在冰上5min。
9、12000rpm， 4℃离心10min，倒掉上清
10、加入1ml丙酮洗涤沉淀， 12000rpm， 4℃离心5min，重复三次
11、最后倒出丙酮后，再短暂离心，用移液枪吸出残余的丙酮
12、打开离心管的盖子，室温放置10-15min，使丙酮完全挥发
13、向离心管中滴加50ul样品溶解液， 4℃放置至少3h，溶解蛋白样品。
1.2 制备蛋白样品所需试剂
1．细胞洗涤液 PBS buffer PH7.4
氯化钠 8g
氯化钾 0.2g
Na2HPO4 1.42g
KH2PO4 0.27g
向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解
滴加浓盐酸将PH值调至7.4，然后加入去离子水定容至1L.
灭菌后室温保存
2．蛋白沉淀剂 40%三氯乙酸（TCA）
40g TCA加水定容至100ml
3．丙酮
4．核酸酶
5. 蛋白酶抑制剂（cocktail，片剂）
6．样品溶解液：尿素 7M 4.2g
硫脲 2M 1.52g
CHAPS 4% 0.4g
MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
注：不要反复冻融，分装保存
1.3 蛋白定量
1.3.1 蛋白定量方法
标准曲线法测定蛋白质的含量
管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白液
0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8
(mL)
蒸馏水(mL) 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2
考马斯亮蓝G-
4 4 4 4 4 4
250(mL)
蛋白含量(μg) 0 10 20 40 60 80 OD595nm0 0.128 0.308 0.448 0.617 0.846
步骤：
1、取7个1.5ml的离心管，标记管号1-7
2、在1-6号管中，按上表加入标准蛋白液（0.1mg/ml BSA），蒸馏水，
考马斯亮蓝R250，混匀后室温放置5min
3、从冰箱中取出溶解的蛋白样品，用移液枪反复吹打几次，12000rpm，
4℃离心10min，之后将上清转移到一新的离心管中
4、取合适体积的蛋白样品加入7号管中，加蒸馏水补足至1ml，考马斯
亮蓝G-250 4mL，混匀后室温放置5min.
5、用分光光度计测得1-7号管中溶液的光密度OD595nm，(测之前注意调
零，以1号管为空白对照调零)
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10µg、20 µg、
30 µg、40 µg、50 µg），在坐标轴上绘制标准曲线。
6、利用标准曲线查出回归方程A595nm=aX+b。
7、根据回归方程计算样品蛋白质含量
实验结果：经试验得知：标准曲线方程为Y=0.0101X+0.0416
其中，Y：吸光度（OD595nm值）
X：蛋白质含量（g）
2.第一向分离——等电聚焦
2.1 上样方法
1. 从-20℃取出保存的水化上样缓冲液，置室温溶解。
2. 从小管中取出水化上样缓冲液，加入适量样品、两性电解质(终浓度0.5-1%)和溴酚蓝，充分混匀。
3. 沿着聚焦盘中槽的边缘从左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响
到胶条中蛋白质的分布。
4. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 3-10），室温中放置10分钟。
而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
5．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。
6. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7.对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电
聚焦程序。
7cm胶条
水化 12小时（20℃）主动水化（50V）S1 250V 线性30分钟除盐S2 500V 快速30分钟除盐S3 4000V 线性3小时升压S4 4000V 快速20,000伏小时聚焦S5 500V 快速任意时间保持选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50 A/根）
设置等电聚焦时的温度。（17℃）
2.2 蛋白质上样量
双向电泳第一向上样蛋白质量
样品溶液的上样体积
我组试验中所得到的蛋白质量的数据为：
蛋白质的加入量为4ul，所测蛋白质的吸光度为0.354，由标准曲线公式可以得出所测蛋白质含量为30.93ug。经查表得：在200-500ul中取300ul，那么待测蛋白的点样量为40ul，即在步骤2.1.3中的样品量为40ul。
2.3 水化上样缓冲液配制：
水化上样缓冲液成分：尿素 7M
硫脲 2M
CHAPS 4%
DTT 50mM
Benzonase 0.3U/ul
PMSF 1mM
Carrier Ampholytes 0.2%(w/v)
溴酚蓝 0.001%
水化上样缓冲液母液配方：
尿素 7M 4.2g
硫脲 2M 1.52g
CHAPS 4% 0.4g
DTT 50mM 500ul（1M DTT）
Benzonase 0.3U/ul 120ul
PMSF 1mM 100ul
MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。（1M的DTT：1M的DTT每mL含DTT0.154g）
Carrier Ampholytes 0.2%(w/v) 50ul(40%)（现加）
溴酚蓝 0.001% 10µl（1% 溴酚蓝）（现加）2.4配制蛋白上样缓冲液：
蛋白溶解液适量（根据所制蛋白样品浓度）
上样缓冲液母液适量（根据蛋白样品体积）
Carrier Ampholytes 0.2%(w/v) 1ul (40%)（现加）溴酚蓝 0.001% 1ul（1% 溴酚蓝）（现加）
混匀之后，12000rpm，4℃条件下，离心2min，即可用于上样。
3.胶条的平衡
3.1 胶条平衡方法
1. 从聚焦盘或-20℃冰箱中取出的胶条，若直接从聚焦盘中取出胶条，可立即进行后续处理，如果是从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10-15分钟平衡。
2. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上，吸取胶条上的矿物油。用镊子夹住胶条的一端（不要碰到胶面），用蒸馏水缓缓冲洗胶条，洗去胶条上残留的矿物油和多余样品，这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。然后将胶条胶面朝上放在干净滤纸上。
3. 准备好干净的胶条溶胀盘，将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入根据胶条长度加入平衡缓冲液I。将溶胀盘放在水平摇床上平衡15分钟。
5. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液
l。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏
凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
6.用镊子夹住胶条的一端，取出胶条，同样用蒸馏水缓缓冲洗胶条，洗去多余的平衡液，然后将胶条胶面朝上放在干净滤纸上。
3.2 胶条平衡液配方
胶条平衡缓冲液母液：
尿素 6M 36g
SDS 2% 2g
Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）甘油 20% 20ml
MilliQ水定容至100ml；分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液I：胶条平衡缓冲液母液 10ml
DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II：胶条平衡缓冲液母液 10ml
碘乙酰胺 0.25g 充分混匀，用时现配。
4.第二向分离——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.1 聚丙烯酰胺凝胶的配制、胶条的转移及电泳
1. 配制12%的凝胶1块。配10ml凝胶溶液，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间，用MilliQ水或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，聚合至少1小时。(7cm胶条)
2. 用滤纸吸去上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面
上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
3. 将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。
4. 将10×电泳缓冲液稀释成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
6. 将平衡好的IPG胶条完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
7. 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。
8. 用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，不要在胶条下方产生气泡。
9. 之后在IPG胶条上注入低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。
10. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时低电压（80V），待样品在完全走出IPG胶条，再加大电压至（120V），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
4.2 聚丙烯酰胺凝胶试剂配制
低熔点琼脂糖封胶液：
低熔点琼脂糖 0.5% 0.5g
Tris 25mM 0.303g
甘氨酸 192mM 1.44g
SDS 0.1% 1ml（10% SDS）
溴酚蓝 0.001% 100µl（1%溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml；加热溶解至澄清，室温保存。
30% 聚丙烯酰胺贮液：
丙烯酰胺 150g
甲叉双丙烯酰胺 4g
MilliQ水 500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris pH8.8： Tris 90.75g
MilliQ 水 400ml 用 1mol/L HCl 调 pH 至 8.8，加 MilliQ 水定容至500ml。4℃冰箱保存。
10% SDS： SDS 10g
MilliQ水 100ml 混匀后，室温保存。
10% 过硫酸铵 Ap 0.1g
MilliQ水 1ml（用时加水溶解）溶解后，4℃冰箱保存。10×电泳缓冲液（1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris 30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
MilliQ水 1L 混匀后，室温保存。
分离胶配方
10%分离胶 10ml
30%凝胶母液 3.3ml
1.5M Tris
2.5ml
ddH20 4ml
10%SDS 100μl
10%APS(新备) 100μl
TEMED 4μl
依次缓慢加入上述试剂，轻轻摇匀后注入已封好的制胶板中，顶部预留0.5cm左右的空间，加正丁醇或纯水压平胶面。
5.凝胶染色——考马斯亮蓝染色
①电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，清水漂洗后放入
染色盘中
②在染色盘中加入适量染色液，放置在摇床上，过夜染色
③第二天，倒掉染色盘中的染色液，加入适量脱色液进行脱色，每隔
两小时更换一次脱色液，直到脱色完全为止。
染色液
0.1%考马斯亮蓝R-250 1g
25%异丙醇 250mL 10%冰醋酸 100mL
加蒸馏水定容至1L，滤纸过滤后室温保存
脱色液
10%醋酸 100ml
5%乙醇 50ml
加蒸馏水定容至1L，混匀后室温保存
6.凝胶的图像处理和照片分析
①凝胶图像的扫描
②图像加工
③斑点检测和定量
④凝胶配比
⑤数据分析
⑥数据呈递和解释
3)实验结果：
1.蛋白质含量标准曲线图如下：
y = 0.0081x + 0.0408R 2 = 0.9816-0.10
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0102030
405060
蛋白质含量O D 值系列1线性 (系列1) 测得此种蛋白质的吸光度为0.399。根据方程式计算出对应的蛋白质含量为
44.2mg 。
2.SDS-PAGE 分析
出现了严重的拖尾现象，说明样品中有多糖类和一些去污剂，DTT等类型的杂质，说明实验操作的过程中有些步骤的时间长短和试剂的剂量没有把握好。出现了大量的蛋白斑点，说明溶解蛋白不充分。应当添加多一些的溶解试剂和加长蛋白溶解时间。
4）参考文献
【1】生物化学王镜研编
【2】大肠杆菌可溶性蛋白质双向电泳条件的建立中国现代教育装备2010年第五期尹燕霞赵长云刘照蓬徐风亭刘进李森向本琼作
【3】蛋白质组学研究中的核心技术---双向凝胶电泳首席医学网 2006
年4月张曼作
【4】双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用 2012-11-29中图分类号 Q75；Q945.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）20-0013-02 【5】.蛋白质双向电泳图像分析[J].生物化学与生物物理进展贾宇峰，林秋霞，郭尧君，等，2001（2）：246-250.
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳
一、 实验原理：
2-DE 的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向 SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等 电点和分子量的信息。 二、 实验步骤：
1. 芽孢杆菌蛋白质的提取
2. 蛋白质样品的纯化 将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80 度冰箱里备用，取出蛋白质干粉 300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加 DTT）1.6ml，放置-20 度冰箱 2h，离心， 吸除丙酮酸，用超纯水中（加 DTT） ，清洗两次，离心，加水化液溶解。 水化液配置：用 dd H20 定容 水化液 尿素（60.06） 硫脲（76.12） CHAPS DTT(154.2) 浓度 7M/L 2M/L 4% 1% 100ml 42.0g 15.2g 4g 1g 20ml 8.4g 3.04g 0.8g 0.2g
（注：DTT 现用现加） 3. Bradford 法测蛋白含量 取 0.001g BSA（牛血清白蛋白）用 1ml 超纯水溶解,测定 BSA 标准曲线及样品蛋白含 量。 取 7 个 10ml 的离心管， 首先在 5 个离心管中按次序加入 0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul 的 BSA 溶解液，在分别加入 100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入 4ml 的 Bradfor。另取 2 管中分别加入 2 ul 的待测样品溶液，各管中分别加入 4ml 的 Bradfor， 摇匀，2min 在 595nm 下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度 BSA 的 OD 值，再测样 品 OD 值。(测量过程要在一个小时内完成)。 例如：
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展 摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。 关键词: 双向电泳，应用，前景 1.1双向电泳技术概述 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别， 产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。 1.2双向电泳基本原理 1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。 2双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其分辨率已从15 个蛋白质点发展到10 000多个蛋白质点。一般的双向电泳也能分辨 1 000～3000 个蛋白质点。因此，近年来，双向电泳被广泛应用于农业、医学等研究领域。 2.1 在动物科学中的应用 在动物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于小鼠血清蛋白、卵巢蛋白、兔晶状体蛋白质、昆虫离体细胞膜蛋白、户尘螨蛋白、家蚕雌性附腺及其Ng突变体蛋白质、大腹园蛛毒素蛋白质、家蚕蛋白质、牛精液蛋白、猪巨噬细胞蛋白等方面的研究。如钟小兰等[2]利用双向电泳技术分析肝郁症模型大鼠血清蛋白质组的差异表达。王治东等[3]采用蛋白质组学的双向电泳和蛋白质氨基酸序列分析技术研究了8Gy γ射线照射后24 h 小鼠血清蛋白质的变化。马翔等[4]通过双向电泳和质谱技术分析性成熟小鼠卵巢蛋白质组，并对其中的一种蛋白质进行免疫组化研究。刘奕志等[5]通过双向电泳和质谱鉴定有效分离和分析兔晶状体蛋白质组的特性，为白内障的防治带来新的前景。柳亦松等[6]以大腹园蛛粗毒为材料利用双向电泳技术获得蛋白质组双向电泳图谱，检测到500 个左右的蛋白质点，并对其中部分蛋白质点进行了质谱分析。靳远祥等[7]采用双向凝胶电泳和计算机辅助分析方法，分别对家蚕（Bombyx mori）限性黄茧品种雌蚕（黄茧）和雄蚕（白茧）的中部丝腺组织细胞蛋白质进行分离和比较分析。 2.2 在植物中的应用 在植物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于水稻蛋白质、小麦蛋白质、茶树蛋白质、杉树蛋白质等方面的研究。如易克等[8]利用双向电泳技术对水稻种子胚乳蛋白进行了分析，获得了较好的电泳图谱，为探讨水稻灌浆期间与籽粒充实相关蛋白表达的变化，建立了一套适于水稻种子胚乳蛋白双向电泳分析技术。Picard 等利用双向电泳分析了亲缘关系较近的硬粒小麦不同株系的遗传多样性。林金科等[9]利用双向电泳技术分析了茶树蛋白质组，探索出一种可获得重复性好，清晰度高的蛋白质双向电泳图谱技术，并发现
western-blot实验报告
一、实验目的 1.掌握Western-blot实验原理及方法应用 2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作 3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术 二、实验原理 Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 三、实验材料 试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液 器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。 四、实验步骤 1、样品制备 取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。95°C水浴5分钟。10000 g离心30分钟，取上清。每管20 μl 分装。组织与匀浆液的比例= 1:5-1:10 2、清洗玻璃板 3、灌胶与上样 (1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。 (2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。 (3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 (4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后( 20 min )，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 (5)将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。) (6)加足够的电泳液后开始准备上样(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板)。用移液器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将移液器插至加样孔中缓慢加入样品。 4、电泳 电泳时间一般4～5h，电压为80V，1h；也可用120V，1.5h。电泳至溴酚兰至浓缩胶下3cm可终止电泳，进行转膜。 5、转膜 (1)转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的PVDF膜用甲醇浸泡15s，再用镊子捏住
双向电泳法
双向电泳法 双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。 原理 双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。 双向电泳法的关键步骤如下： 1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按 照其等电点进行分离。等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子 （OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。 2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝 胶垂直叠加。在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在 SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。 3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列 斑点，每个斑点代表一个蛋白质。常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。 步骤 双向电泳法的步骤如下： 1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使 得蛋白质在石蜡中可溶解。常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程 一．样品制备 1.研磨 研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。 2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。 先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。 3.振荡30min。 室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。 4.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。酚相（top phase）可置于冰上。 酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。 5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。 振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。 6.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。 7.沉淀酚相。取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。振荡30s，–20℃培育1h或过夜。 8.清洗沉淀 ①15 min，20,000 g，4℃。弃上清。 ②加10mL 0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。–20℃沉淀30min。 ③15 min，20,000 g，4℃。弃上清。 ④加入10 mL乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。–20℃沉淀30min。 ⑤15 min，20,000 g，4℃。弃上清。 ⑥加10mL 80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。 ⑦15 min，20,000 g，4℃。弃上清。 ⑧加入10 mL 80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。 ⑨15 min，20,000 g，4℃。弃上清。 ⑩加入10 mL 100%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。 ○1115 min，20,000 g，4℃。弃上清。 9.用药匙将离心管中的蛋白质样品取出，置于硫酸纸上，将样品制成粉末。 将粉末分装到2 mL的离心管中，每管装20 mg。用封口膜将离心管封口，做好标记，置于-20℃保存。
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取） 一、试剂配置： PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g 蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g 加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH） 裂解储液配方（细胞）： 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解储液配方（组织）： 尿素(MW 60.06) 5M 3g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g
CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris（MW 121.1） 40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解液： 裂解液储液 100uL IPG buffer（pH可选） 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix（100×） 1uL PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装 考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。 考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。 二、实验准备：
双向电泳技术的原理及应用
双向电泳技术的原理及应用 1. 原理 双向电泳技术是一种分离和鉴定蛋白质的常用方法。它结合了凝胶电泳和电泳移动的优势，可以在同一实验中实现更高的分辨率和更好的分离效果。 双向电泳的原理基于两个关键因素：分子大小和电荷。在实验中，蛋白质样品首先沿一个方向进行电泳。由于蛋白质的不同大小和电荷，它们会在凝胶中形成不同的带状图案。然后，凝胶会旋转90度，使蛋白质在垂直方向上进行电泳。这样一来，蛋白质会在另一个方向上发生分离。 双向电泳的核心是双向凝胶，其结构类似于二维网络。在第一个方向上，凝胶中的蛋白质会形成一维图案，而在第二个方向上，蛋白质会形成另一维图案。通过对这两个图案的分析，可以得到更为准确的蛋白质信息。 2. 应用 2.1 蛋白质分离和纯化 双向电泳技术在蛋白质分离和纯化中有着广泛的应用。由于双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。这在研究蛋白质结构和功能以及疾病诊断中具有重要意义。 2.2 蛋白质组学研究 双向电泳技术在蛋白质组学研究中发挥着重要作用。通过双向电泳，可以分离出复杂样品中的蛋白质，并获得其质量和电荷信息。这些信息可以用于鉴定蛋白质和研究其功能。 2.3 药物研发 双向电泳技术在药物研发中也有广泛的应用。通过双向电泳，可以分离和鉴定药物的靶点，进一步了解药物与蛋白质的相互作用机制。这对于药物设计和优化具有重要意义。 2.4 分子生物学研究 双向电泳技术在分子生物学研究中有着重要的应用。通过双向电泳，可以鉴定蛋白质的表达变化，从而了解基因表达调控机制。这对于研究细胞功能和疾病发生机制具有重要意义。
2.5 环境监测 双向电泳技术在环境监测中也有着广泛的应用。通过双向电泳，可以分离和鉴定环境中的污染物，从而评估环境质量和污染程度。这对于环境保护和治理具有重要意义。 3. 优缺点 3.1 优点 •分辨率高：双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。 •信息丰富：双向电泳可以获得蛋白质的质量和电荷信息，有助于了解蛋白质的结构和功能。 •广泛应用：双向电泳技术在蛋白质分离和纯化、蛋白质组学研究、药物研发、分子生物学研究和环境监测等领域有着广泛的应用。 3.2 缺点 •复杂操作：双向电泳技术相对于单向电泳技术来说，操作更为复杂，需要较高的实验技术。 •样品损失：双向电泳技术在操作过程中，样品损失的风险较大。对于样品量较少的情况，这可能会限制其应用。 4. 结论 双向电泳技术作为一种分离和鉴定蛋白质的常用方法，具有分辨率高、信息丰富等优点。它在蛋白质分离和纯化、蛋白质组学研究、药物研发、分子生物学研究和环境监测等领域有着广泛的应用。尽管双向电泳技术操作复杂，样品损失的风险较大，但随着实验技术的发展和改进，双向电泳技术的应用前景仍然广阔。
蛋白质sdspage电泳实验报告
蛋白质sdspage电泳实验报告 蛋白质SDS-PAGE电泳实验报告 引言： 蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着重要的 作用。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们开发了许多技术和方法。其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析方法，它通过电泳的方式将蛋白质按 照其分子量大小进行分离和定量。 实验目的： 本实验旨在通过SDS-PAGE电泳技术对不同来源的蛋白质进行分析，了解其分 子量和纯度，并探讨其应用于蛋白质研究中的意义。 实验步骤： 1. 样品制备：收集不同来源的蛋白质样品，如乳清蛋白、鸡蛋清蛋白等。将样 品加入SDS-PAGE样品缓冲液中，加热至100摄氏度，使蛋白质完全变性。 2. 准备电泳胶：根据实验需要，配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，加入TEMED 和过硫酸铵使其聚合。 3. 装载样品：将变性后的蛋白质样品注入电泳胶槽中，注意不要产生气泡。 4. 电泳：将电泳胶槽连接至电源，设置合适的电压和时间，进行电泳分离。 5. 凝胶染色：将电泳胶取出，用凝胶染色剂染色，使蛋白质带可见。 6. 图像分析：使用分子量标准品作为参照，通过图像分析软件测量蛋白质带的 迁移距离，计算其分子量。 实验结果： 通过SDS-PAGE电泳实验，我们成功地将不同来源的蛋白质样品分离出来，并
得到了清晰的蛋白质带。根据分子量标准品的迁移距离，我们计算出了各个蛋白质样品的分子量。 讨论： 1. 分子量测定：通过SDS-PAGE电泳实验，我们可以准确地测定蛋白质的分子量。这对于研究蛋白质的结构和功能非常重要，因为不同分子量的蛋白质可能具有不同的生物活性和相互作用方式。 2. 纯度分析：通过观察电泳胶上的蛋白质带的清晰度和数量，我们可以初步评估样品的纯度。纯度高的样品通常只有一个清晰的蛋白质带，而纯度低的样品则可能有多个模糊的带。因此，SDS-PAGE电泳可以帮助我们选择纯度较高的蛋白质样品进行后续实验。 3. 应用前景：SDS-PAGE电泳技术在生物医学研究中有着广泛的应用前景。它可以用于研究蛋白质的结构和功能，寻找新的药物靶点，评估药物的纯度和稳定性，以及检测蛋白质异常表达等。随着科学技术的不断发展，SDS-PAGE电泳技术也在不断改进，为蛋白质研究提供更多的可能性。 结论： 通过本次实验，我们成功地应用了SDS-PAGE电泳技术对不同来源的蛋白质样品进行了分析。通过分析蛋白质带的迁移距离，我们得到了蛋白质的分子量信息，并初步评估了样品的纯度。SDS-PAGE电泳技术在蛋白质研究中具有重要的应用价值，对于深入理解蛋白质的结构和功能具有重要意义。随着技术的不断进步，相信SDS-PAGE电泳技术将为蛋白质研究带来更多的突破和发展。
对流免疫电泳实验报告
对流免疫电泳实验报告 对流免疫电泳实验报告 引言： 对流免疫电泳是一种常用于生物医学领域的实验技术，它结合了电泳和免疫学 的原理，能够用于检测和分离复杂的生物样品中的蛋白质。本实验旨在通过对 流免疫电泳技术的应用，探索其在蛋白质分析中的潜力和应用价值。 实验材料与方法： 1. 样品制备：从细胞培养物中收集蛋白质样品，并通过离心将细胞碎片去除， 得到纯净的蛋白质溶液。 2. 凝胶制备：制备聚丙烯酰胺凝胶，根据所需分辨率选择合适的凝胶浓度。 3. 样品加载：将蛋白质样品加载到凝胶孔中，注意控制样品的加载量和均匀性。 4. 电泳条件：设置适当的电压和电流，进行电泳分离。 5. 免疫检测：将蛋白质迁移至膜上，进行免疫染色或免疫印迹分析。 实验结果与讨论： 通过对流免疫电泳实验，我们成功地分离和检测了目标蛋白质。在电泳过程中，蛋白质根据其分子量的大小迁移至凝胶不同位置，形成清晰的蛋白质条带。通 过免疫染色或免疫印迹，我们能够特异性地检测目标蛋白质，并确定其分子量 和相对丰度。 对流免疫电泳的优势在于其高分辨率和高灵敏度。凝胶孔的尺寸可以根据需要 进行调整，以实现对不同大小蛋白质的分离。同时，免疫检测使得我们能够选 择性地检测特定蛋白质，而不受其他蛋白质的干扰。这为我们研究蛋白质的功 能和相互作用提供了有力的工具。
在实验中，我们还发现凝胶浓度对蛋白质分离的影响。较低浓度的凝胶可分离 较大分子量的蛋白质，而较高浓度的凝胶则适用于分离较小分子量的蛋白质。 这一发现提示我们在实验设计中需要根据目标蛋白质的特性选择合适的凝胶浓度，以获得最佳的分离效果。 除了分离和检测蛋白质，对流免疫电泳还可以用于研究蛋白质的修饰和变异。 通过将不同样品加载到同一凝胶中，我们可以比较它们之间的蛋白质差异，进 而探索这些差异对蛋白质功能和疾病发展的影响。这为我们深入了解蛋白质的 多样性和复杂性提供了重要的手段。 然而，对流免疫电泳也存在一些局限性。首先，样品的制备和加载过程可能引 入一定的误差，影响实验结果的准确性。其次，对于高丰度蛋白质的检测，可 能会受到低丰度蛋白质的掩盖。因此，在实验设计和数据分析中需要注意选择 合适的方法和策略，以克服这些限制。 结论： 对流免疫电泳是一种有效的蛋白质分析技术，具有高分辨率和高灵敏度的特点。通过该技术，我们可以实现蛋白质的分离、检测和定量，进而深入研究蛋白质 的功能和相互作用。然而，我们也需要认识到该技术的局限性，并在实验设计 和数据分析中加以考虑。未来，随着技术的不断发展，对流免疫电泳有望在生 物医学领域发挥更大的作用，为我们揭示生命的奥秘提供更多的线索。
生物蛋白质的检测实验报告
生物蛋白质的检测实验报告 生物蛋白质的检测实验报告 引言： 蛋白质是生物体中最基本的分子之一，其在细胞结构、代谢调控、信号传导等方面扮演着重要角色。因此，准确地检测生物蛋白质的存在和量级对于研究生物学过程具有重要意义。本实验旨在通过一系列方法，对蛋白质进行检测并分析。 材料与方法： 1. 样本制备：选取不同类型的生物组织，如肌肉、肝脏和心脏，分别进行细胞裂解并制备蛋白质提取液。 2. 蛋白质定量：利用BCA法对蛋白质提取液进行定量，根据标准曲线计算样本中的蛋白质浓度。 3. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合后，经过电泳分离，然后进行染色和成像。 4. 免疫印迹：将电泳分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，然后进行抗体探针的孵育和检测。 5. 质谱分析：将蛋白质样品经过酶解后，利用质谱仪进行分析，得到蛋白质的质量和序列信息。 结果与讨论： 1. 蛋白质定量结果显示，不同组织中蛋白质的浓度存在差异。肌肉组织中蛋白质浓度最高，而心脏组织中蛋白质浓度最低。这可能与组织功能和代谢需求有关。
2. SDS-PAGE电泳结果显示，不同组织中蛋白质的分子量也存在差异。肌肉组织中蛋白质的分子量较大，而心脏组织中蛋白质的分子量较小。这与组织的功能和结构有关。 3. 免疫印迹结果显示，不同组织中蛋白质的表达模式也存在差异。肌肉组织中特定蛋白质的表达量较高，而心脏组织中特定蛋白质的表达量较低。这可能与组织的功能和代谢调控有关。 4. 质谱分析结果显示，蛋白质样品中存在多个肽段，通过对质谱峰的分析，可以推测蛋白质的氨基酸序列和质量。 结论： 通过本实验的一系列方法，我们成功地检测了生物蛋白质的存在和量级，并对其进行了分析。结果显示，不同组织中蛋白质的浓度、分子量和表达模式存在差异，这与组织的功能和代谢调控密切相关。质谱分析进一步揭示了蛋白质的氨基酸序列和质量信息。这些结果对于深入理解生物学过程以及研究相关疾病具有重要意义。 展望： 虽然本实验对生物蛋白质的检测和分析取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。例如，样本的选择范围较为有限，未能涵盖所有生物组织类型。此外，质谱分析的结果还需要进一步验证和确认。未来的研究可以扩大样本范围，并结合其他技术手段，如蛋白质互作网络分析和功能研究，以全面了解生物蛋白质的特性和功能。 结语： 本实验通过一系列方法对生物蛋白质进行了检测和分析，结果显示不同组织中
电泳实验报告
电泳实验报告 电泳是一种常见的生物分析技术，通过电场的作用将带电粒子在凝胶或溶液中移动，从而实现分离与检测的目的。本次实验旨在通过蛋白质电泳分析样本中蛋白质的分布情况和相对含量。以下将从实验原理、实验过程和结果讨论等方面进行说明。 实验原理 电泳的基本原理是带电粒子在电场作用下受力并进行移动。在本实验中，我们使用了聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，并将电场施加在凝胶上，使得带电的蛋白质在凝胶孔隙中移动。蛋白质根据其大小和电荷性质，在电场作用下移动的距离和速率不同，从而实现分离。 实验过程 首先，我们制备了聚丙烯酰胺凝胶。将聚丙烯酰胺粉末溶解在缓冲液中，然后加入过氧化铵等试剂混合均匀，在模具中固化。接着，将样本与电泳缓冲液混合，并加载到凝胶孔洞中。将电泳仪连接到电源上，并设置所需的电压和电流参数。开启电源后，等待一段时间，直到电泳进行结束。最后，取出凝胶，进行染色以观察分离效果。
实验结果与讨论 经过电泳分离后，观察到凝胶上出现了一系列不同距离的蛋白 质带。这些带的位置和宽度表明了蛋白质的分子量和电荷性质。 分析不同带的迁移距离和相对含量可以得出蛋白质样本的组成和 纯度信息。 首先，我们通过与已知分子量的标准品进行比对，确定了不同 蛋白质的分子量。根据标准品带的位置和已知分子量的对应关系，我们能够推断出样本中蛋白质的大致分子量范围。这对于进一步 研究蛋白质的结构与功能有着重要意义。 其次，观察带的宽度可以得知蛋白质的电荷性质。在电泳过程中，蛋白质分子受到缓冲液中离子的影响，会发生电荷遮盖现象，使得蛋白质的分离效果减弱。当蛋白质具有多种电荷状态时，其 带的宽度可能会增加，提示样本中存在多种同种蛋白质的变异形式。 最后，通过比较不同带的相对含量，可以推断出蛋白质样本的 组成情况。通过定量分析电泳带的强度或使用显色剂染色，我们
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验报告
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验报告 一、实验介绍 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳是一种常用的生物化学实验，用于分离血 清中的蛋白质。该实验利用电泳原理，将血清中的蛋白质按照它们的 电荷、大小和形状进行分离。这种技术可以帮助诊断一些疾病，并可 作为治疗方案的参考。 二、实验步骤 1. 样品制备：取少量血清，加入等量的缓冲液，混合均匀。 2. 样品处理：将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸5分钟。 3. 准备凝胶：将凝胶混合物倒入凝胶模板中，待凝胶固化后倒掉上层 溶液。 4. 加载样品：将处理好的样品加入凝胶孔中。 5. 电泳：将凝胶放入电泳槽中，连接电源进行电泳。 6. 染色：取出凝胶，在染色溶液中染色15分钟至2小时。 7. 脱色：取出凝胶，在脱色溶液中脱色至背景清晰。 三、实验结果 实验结果可通过观察凝胶图谱来进行分析。在凝胶上，蛋白质会被分 离成多个带状区域，每个区域代表一种蛋白质。观察带状区域的大小、形状和颜色，可以判断样品中蛋白质的种类和含量。
四、实验注意事项 1. 样品处理时需要加入SDS-PAGE样品缓冲液，以去除蛋白质的天然电荷。 2. 凝胶制备时需要严格按照说明书操作，确保凝胶固化均匀。 3. 电泳槽中需要加入足够的电泳缓冲液，并保证电极完全浸入缓冲液中。 4. 染色和脱色时需要注意时间控制，过长或过短都会影响染色效果。 5. 实验过程中应注意安全，避免接触电源和有毒溶液。 五、实验应用 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳广泛应用于临床诊断和治疗方案的制定。例如，在肝功能异常的患者中，可以通过该技术检测血清中的蛋白质种类和含量，以判断肝脏功能是否正常。此外，该技术还可用于研究蛋白质结构和功能，以及新药物的筛选。 六、实验优化 为了提高实验效率和准确性，可以对实验进行优化。例如，可以选择不同类型的凝胶和电泳缓冲液来适应不同的样品类型；也可以尝试不同的染色方法来提高染色效果。此外，在实验过程中还需要注意控制变量，以确保实验结果的可靠性。 七、总结
蛋白双向2D-WB电泳实验服务
蛋白双向2D-WB电泳实验服务 蛋白双向2D-WB 电泳实验服务 实验技术：2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离，然后将凝胶蛋白转印至支持膜上，再通过抗体杂交显色。2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化，在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用；而2D-WB结合质谱鉴定技术，可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。[晶莱生物] 实验操作流程： 1、第一项电泳（IEF），胶条平衡，第二项电泳SDS-APGE。 2、第二项电泳结束后，取出凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。 3、封闭, 5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时（室温）或过夜（4度）。 4、一抗孵育,根据抗体说明书选择孵育时间，常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜，一抗孵育后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。 5、二抗孵育：根据一抗选择合适的二抗（抗鼠、抗人、抗兔等），室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。 6、显影：将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上，暗室中将胶片置于膜上，盖上压片夹，曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后在定影液中定影，曝光时间需综合考虑蛋白质的上样量，抗体稀释浓度，抗体孵育时间等因素。 7、定影后，清洗胶片，晾干，标定marker，扫描图片和2D Western blot图片分析。 一、2D Western blot 2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离，然后将凝胶蛋白
甘草愈伤组织蛋白质组双向电泳技术的建立
甘草愈伤组织蛋白质组双向电泳技术的建立 曹君迈;张欣 【摘要】以来源于野生乌拉尔甘草的愈伤组织为试材，对甘草愈伤组织蛋白质的提取、SDS－PAGE电泳、上样量、染色方法等关键步骤进行了优化，结果表明：采用改良丙酮法可提高提取液中蛋白质的含量及单向电泳图谱的分辨率；17 cm IPG胶条上样量为450μg时，采用银染法提高了双向电泳图谱的分辨率及分离效果，获得了1132个蛋白点。建立了一套适用于乌拉尔甘草的愈伤组织蛋白质组分析的双向电泳方法。%Callus of Glycyrrhiza uralensis was used in this research for extraction of total proteins ,SDS -PAGE , loading quantity and staining method ,allowing optimization of the two-dimensional gel electrophoresis (2D-E) technolo-gy .The results showed that improved acetone precipitation could increase the protein contents and image resolution of gel electrophoresis .There were 1 132 protein spots identified using silver staining when the loading quantity of the sample protein was 450 μg/(17 cm IPG trip ) .This research developed a 2D-E method applicable for protein analysis of Gly-cyrrhiz a uralensis callus . 【期刊名称】《干旱地区农业研究》 【年(卷),期】2015(000)003 【总页数】6页(P153-158) 【关键词】甘草;愈伤组织;双向电泳;蛋白质组学 【作者】曹君迈;张欣
Western-Blotting实验报告
Western Blotting 本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。 Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。它通常分为两种方法： Western Blotting 方法一: 直接法方法二: 间接法 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起 的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择
4. 可选择不同的Marker 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使 用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化 同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。 一、实验原理 Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。据有无浓缩效应可将电
蛋白质凝胶电泳实验报告
蛋白质凝胶电泳实验报告 蛋白质凝胶电泳实验报告 一、实验目的： 本次实验旨在通过蛋白质凝胶电泳技术，对不同来源的蛋白质进行分离和检测，掌握蛋白质电泳的原理、操作方法及结果分析。 二、实验原理： 1. 蛋白质凝胶电泳原理 蛋白质凝胶电泳是一种常用的分离和检测蛋白质的方法。其原理是利用聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶作为分离介质，将不同大小和电荷的蛋白质分离开来。当通电时，带有不同电荷的蛋白质会在凝胶中移动，并最终被定位在相应位置。 2. 凝胶制备 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂组成。单体与交联剂经过聚合反应形成三维网状结构，从而形成凝胶。根据所需分辨率可选择
不同浓度的聚丙烯酰胺溶液。 3. 样品处理 蛋白质样品需要经过还原、变性和煮沸等处理步骤，使其呈现线性结构，便于电泳分离。 4. 电泳操作 将凝胶浸入电泳缓冲液中，通电后将样品加在凝胶上，再进行电泳。根据所选缓冲液和电场强度的不同，可实现不同程度的分离效果。 5. 染色检测 经过电泳分离后，使用染色剂对凝胶进行染色，以便观察蛋白质条带并进行定量分析。 三、实验步骤： 1. 准备工作：制备聚丙烯酰胺凝胶、制备缓冲液、样品处理等。 2. 制备凝胶：按照所需浓度配制聚丙烯酰胺溶液，并加入交联剂和引发剂，混合后倒入模板中，在上方覆盖一层异丙醇以防止表面干燥。
待凝固后取出模板。 3. 制备缓冲液：根据所需 pH 值和离子强度配制缓冲液。常用的缓冲液有 Tris-HCl 缓冲液、MES 缓冲液等。 4. 样品处理：将蛋白质样品加入还原剂和变性剂混合，煮沸 5 分钟后降温至室温。 5. 电泳操作：将凝胶浸入缓冲液中，通电后将样品加在凝胶上，根据所选缓冲液和电场强度进行电泳。 6. 染色检测：将凝胶浸泡在染色剂中，染色后观察蛋白质条带并进行定量分析。 四、实验结果与分析： 经过本次实验，我们成功地利用蛋白质凝胶电泳技术对不同来源的蛋白质进行了分离和检测。通过观察凝胶上的蛋白质条带及其大小和位置，我们可以得到以下结论： 1. 蛋白质的大小和电荷会影响其在凝胶中的移动速度和位置。较小的蛋白质移动速度更快，较大的蛋白质移动速度更慢；带有正电荷的蛋白质向阴极移动，带有负电荷的蛋白质向阳极移动。
工作报告之蛋白质电泳实验报告
蛋白质电泳实验报告 【篇一：凝胶电泳实验报告模板】 重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称：实验指导教师：学院：专业及类别：学号：姓名：实验日期：成绩：凝胶电泳实验生物学 重庆大学研究生院制 一、实验目的 1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本 原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。 3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。 4.利用琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度、浓度和分子量以及分离大小 不同的dna片段。 5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定dna和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂 1.材料：菌落pcr产物（待检测dna片段）； 2.用具：①琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器 凝胶成像仪； ②聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子； dl5,000 dna marker (takara)。 三、实验原理 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化 dna或rna片段，具有以下优点：便于分离、便于检测和便于回收。其工作原理相对而言比较简单、主要用到了物理学的电荷理论。 当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当 的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也 就是说，电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁 移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应 活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而降
低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。 已知摩擦系 数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电 泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理 条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意 义上讲，d n a 和rna多核苷酸链可叫做多聚阴离子 ( polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链dna几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。 在一定的电场强度下，dna分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的dna分子比 分子量较大的dna 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离dna片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼 脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用 较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼 脂糖凝胶分离dna度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度 从200bp至近50kb的dna段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方 向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段dna(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的dna段就能分开。聚丙烯酰胺凝 胶电泳很快,可容纳相对大量的dna,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂 糖水平平板凝胶电泳装置进行dna电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和page凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原 理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的 双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物 质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不 仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大
电泳分离血清蛋白实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除电泳分离血清蛋白实验报告 篇一：醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验报告 前言 血清蛋白： 血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。 牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70000，这就是一个数据了。在做pcR的时候会用到它。 牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血
液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、ph缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。 醋酸纤维薄膜电泳： 醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。 应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血 清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。 特点： 1.（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。 （2）快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需