蛋白质双向电泳实验报告
蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis)过程与体会-3
蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis)过程与体会-3 二、一向电泳（13cm的holder）（1）取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl（2）将上述溶液加到holder 的两个电极之间。
（3）去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
（4）在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
（5）将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
（6）设置仪器的运行参数：三、胶条的平衡（由一向到二向）（1）将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（2）将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（3）用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳（1）将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.（2）设置仪器的运行参数：五、平板胶的染色硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。
（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。
（3）清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
（4）银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。
（5）显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml去离子水。
（6）终止：5%的醋酸。
（7）照相分析。
（8）保存制作干胶。
药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0. 2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65μl/ml。
蛋白质双向电泳实验报告
现代生物学技术实验报告题目蛋白质双向电泳技术姓名学号专业小组成员指导教师中国·武汉年月联系方式：大肠杆菌组蛋白双向电泳技术摘要：蛋白质双向电泳是一种等电聚焦与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术，也是蛋白质组学研究中分离纯化蛋白质的主要方法之一。
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在等电点上的差异，而垂直方向反映出他们在分子量上的差别。
本实验通过学习蛋白质双向电泳技术，熟悉了蛋白质双向电泳的简单流程。
可以根据电泳所得的图像分析，分离蛋白质。
关键字：蛋白质双向电泳等电聚焦电泳 SDS-PAGE前言：蛋白质组研究的发展以双向电泳技术（2-DE）作为核心。
双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点（spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。
本实验是要研究大肠杆菌中的蛋白质，并学习和初步掌握双向电泳技术。
正文：1)实验原理：从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
蛋白双向2D-WB电泳实验服务
蛋白双向2D-WB电泳实验服务蛋白双向2D-WB 电泳实验服务实验技术：2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。
一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离，然后将凝胶蛋白转印至支持膜上，再通过抗体杂交显色。
2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化，在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用；而2D-WB结合质谱鉴定技术，可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。
[晶莱生物]实验操作流程：1、第一项电泳（IEF），胶条平衡，第二项电泳SDS-APGE。
2、第二项电泳结束后，取出凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。
常用的膜是NC膜和PVDF膜。
3、封闭, 5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时（室温）或过夜（4度）。
4、一抗孵育,根据抗体说明书选择孵育时间，常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜，一抗孵育后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。
5、二抗孵育：根据一抗选择合适的二抗（抗鼠、抗人、抗兔等），室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。
6、显影：将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上，暗室中将胶片置于膜上，盖上压片夹，曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后在定影液中定影，曝光时间需综合考虑蛋白质的上样量，抗体稀释浓度，抗体孵育时间等因素。
7、定影后，清洗胶片，晾干，标定marker，扫描图片和2D Western blot图片分析。
一、2D Western blot2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。
一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离，然后将凝胶蛋白转印至支持膜上，再通过抗体杂交显色。
2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化，在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用；而2D-WB结合质谱鉴定技术，可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。
蛋白电泳实验的实验报告
实验名称：蛋白质电泳实验实验日期：2022年3月15日实验地点：实验室实验目的：1. 掌握蛋白质电泳的基本原理和操作方法；2. 了解不同蛋白质在电泳过程中的迁移规律；3. 学习利用电泳技术对蛋白质进行分离和鉴定。
实验原理：蛋白质电泳是一种基于蛋白质在电场中迁移速度不同的分离方法。
蛋白质分子在电场中受到电场力的作用，带电的蛋白质分子向与其电荷相反的电极移动。
蛋白质分子在电泳过程中的迁移速度取决于其分子大小、形状、电荷量和电泳介质等因素。
在电泳过程中，不同蛋白质分子会因迁移速度不同而在凝胶上形成不同的区带，从而实现分离和鉴定。
实验器材与药品：1. 器材：电泳槽、电源、垂直板凝胶电泳装置、微量移液器、镊子、剪刀、紫外灯、凝胶成像系统等；2. 药品：SDS-PAGE凝胶、丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、考马斯亮蓝G250、Tris-HCl缓冲液、SDS、牛血清白蛋白、分子量标准蛋白等。
实验步骤：1. 准备SDS-PAGE凝胶：按照试剂盒说明书配制丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED等试剂，加入Tris-HCl缓冲液，混匀后倒入垂直板凝胶电泳装置，制作SDS-PAGE凝胶。
2. 制备样品：将待测蛋白质样品与SDS、Tris-HCl缓冲液等试剂混合，制备成蛋白质样品。
3. 加样：将制备好的蛋白质样品加到SDS-PAGE凝胶的样品孔中，加入分子量标准蛋白作为对照。
4. 电泳：将加好样的SDS-PAGE凝胶放入电泳槽中，加入Tris-HCl缓冲液，接通电源，进行电泳。
5. 取样：电泳结束后，关闭电源，取出SDS-PAGE凝胶。
6. 染色：将SDS-PAGE凝胶放入考马斯亮蓝G250染色液中，染色一段时间。
7. 冲洗：将染色后的SDS-PAGE凝胶放入脱色液中，冲洗至背景清晰。
8. 成像：将处理好的SDS-PAGE凝胶放入凝胶成像系统，观察并记录电泳图谱。
电泳实验报告
电泳实验报告电泳是一种常见的生物分析技术，通过电场的作用将带电粒子在凝胶或溶液中移动，从而实现分离与检测的目的。
本次实验旨在通过蛋白质电泳分析样本中蛋白质的分布情况和相对含量。
以下将从实验原理、实验过程和结果讨论等方面进行说明。
实验原理电泳的基本原理是带电粒子在电场作用下受力并进行移动。
在本实验中，我们使用了聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，并将电场施加在凝胶上，使得带电的蛋白质在凝胶孔隙中移动。
蛋白质根据其大小和电荷性质，在电场作用下移动的距离和速率不同，从而实现分离。
实验过程首先，我们制备了聚丙烯酰胺凝胶。
将聚丙烯酰胺粉末溶解在缓冲液中，然后加入过氧化铵等试剂混合均匀，在模具中固化。
接着，将样本与电泳缓冲液混合，并加载到凝胶孔洞中。
将电泳仪连接到电源上，并设置所需的电压和电流参数。
开启电源后，等待一段时间，直到电泳进行结束。
最后，取出凝胶，进行染色以观察分离效果。
实验结果与讨论经过电泳分离后，观察到凝胶上出现了一系列不同距离的蛋白质带。
这些带的位置和宽度表明了蛋白质的分子量和电荷性质。
分析不同带的迁移距离和相对含量可以得出蛋白质样本的组成和纯度信息。
首先，我们通过与已知分子量的标准品进行比对，确定了不同蛋白质的分子量。
根据标准品带的位置和已知分子量的对应关系，我们能够推断出样本中蛋白质的大致分子量范围。
这对于进一步研究蛋白质的结构与功能有着重要意义。
其次，观察带的宽度可以得知蛋白质的电荷性质。
在电泳过程中，蛋白质分子受到缓冲液中离子的影响，会发生电荷遮盖现象，使得蛋白质的分离效果减弱。
当蛋白质具有多种电荷状态时，其带的宽度可能会增加，提示样本中存在多种同种蛋白质的变异形式。
最后，通过比较不同带的相对含量，可以推断出蛋白质样本的组成情况。
通过定量分析电泳带的强度或使用显色剂染色，我们可以得出不同蛋白质在样本中的相对丰度，从而评估样本的纯度和组分分布。
总结与展望通过电泳实验，我们成功地分析了样本中不同蛋白质的分子量、电荷性质和相对含量。
蛋白质双向电泳
实验报告蛋白质的双向电泳罗云云水产养殖20102190171、第一相等点聚焦电泳的胶条从负极到正极，pH如何排列，为什么？答：从负极到正极PH逐渐减小，也就是PH值小的的一端位于电泳的正极。
因为蛋白质在大于其等电点的PH环境中带负电，在小于其等电点的PH环境中带正点。
根据电泳时正电荷向负极移动原理，如果PH值小的一端位于负极，而此时带正电荷的蛋白质没法再向负极移动，因此只能是PH值小的一端位于正极。
即从负极到正极PH值逐渐减小。
2、为什么双向电泳（无论是第一相和第二相）过程中，要尽量消除气泡？答：第一向：如果在胶条和含蛋白质的水化液之间存在气泡，则气泡下面的蛋白质不能进入胶条。
对结果的影响可分为两种：①如果所有蛋白质在水化液中均匀分布，那么气泡只影响结果的显色程度，即银染后的黑色会减淡。
②如果某种蛋白质很少，恰巧只存在于气泡的下面，则气泡对结果的影响是严重的，直接影响电泳结果所能分析出来的样品中所含有的蛋白质的种类。
第二向：如果放入胶条时在胶条与电泳胶之间产生气泡，气泡会影响其所在通路上的电压分布。
其结果有两种：①蛋白质不能通过气泡，该处的蛋白质被遗漏。
②蛋白质可绕过气泡，但其所在跑道会发生偏移或改变，且移动距离也会发生改变，直接影响结果分析。
3、平衡液中的DTT和碘乙酰胺的作用是什么？答：①ＤＴＴ：即二流苏糖醇，它是一种还原剂。
可以还原蛋白质中的二硫键为巯基。
与巯基乙醇相比效果更好。
②碘乙酰胺：其所用是使蛋白质中由二硫键还原而成的巯基保持还原态。
其机制是在DTT作用的基础上使—SH与I—CH2—CO—NH2发生反映产生HI和—S—CH2—CO—NH2。
这样使—SH 不能复原。
4、水化液中CHAPS的作用是什么？它与SDS有什么区别？答：CHAPS是非离子型表面活性剂，有助于不易溶于水的蛋白质溶解。
SDS也是表面活性剂，但它是离子型的，与蛋白质结合后会使蛋白质分子带上大量的负电荷，从而影响蛋白质的等电点。
实验报告蛋白质电泳分析
实验报告蛋白质电泳分析实验报告：蛋白质电泳分析一、实验目的本次实验旨在通过蛋白质电泳技术，对不同样品中的蛋白质进行分离和分析，以了解蛋白质的分子量、纯度和组成等特性，为后续的生物化学研究和应用提供基础数据。
二、实验原理蛋白质电泳是根据蛋白质在电场中的迁移率差异来实现分离的一种技术。
在电场作用下，带电荷的蛋白质分子会向与其电荷相反的电极方向移动。
迁移率取决于蛋白质的分子量、电荷密度和形状等因素。
一般常用的电泳方法有 SDSPAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和 NativePAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）。
SDSPAGE 中，SDS（十二烷基硫酸钠）会与蛋白质结合，使其带上大量负电荷，并使蛋白质的天然构象变性为线性结构。
由于 SDS 结合量与蛋白质分子量成正比，因此在电场中，蛋白质的迁移率主要取决于其分子量大小，从而实现分子量的分离和测定。
三、实验材料与设备1、实验材料不同来源的蛋白质样品（如血清、组织提取液等）标准蛋白质分子量Marker丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺SDS（十二烷基硫酸钠）Tris（三羟甲基氨基甲烷）过硫酸铵TEMED（N,N,N'，N'四甲基乙二胺）甘氨酸考马斯亮蓝 R-250 染色液脱色液2、实验设备垂直电泳槽及配套的电泳玻璃板电源移液器离心机恒温水浴锅四、实验步骤1、制胶安装电泳玻璃板，确保密封良好。
配制分离胶和浓缩胶溶液。
先注入分离胶溶液，待其聚合后，再注入浓缩胶溶液，并插入梳子。
2、样品处理将蛋白质样品与上样缓冲液混合，在沸水浴中加热变性 5 分钟。
3、上样拔出梳子，用移液器将处理好的样品和标准分子量 Marker 加入上样孔中。
4、电泳连接电源，设置电压和时间，先进行浓缩胶电泳，再进行分离胶电泳。
5、染色与脱色电泳结束后，将凝胶取出，放入考马斯亮蓝染色液中染色1-2 小时。
然后用脱色液脱色至背景清晰，显示出蛋白质条带。
五、实验结果与分析1、结果观察经过染色和脱色处理后，在凝胶上可以观察到不同颜色和位置的蛋白质条带。
2-1 蛋白质双向电泳
增加样品溶解性的手段
• 离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是
尿素和硫尿。
• 去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团 后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢剂有离子 去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去垢剂 CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，
然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
• 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的 上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推， 使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
• 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的
蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的 DTT或-巯基 乙醇，以及不带电荷的三丁基磷（TBP）进行还原。
• 起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存
在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保 持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发 生沉淀。 • Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分， 从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应 小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，
然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
• 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的 上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推， 使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
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现代生物学技术实验报告题目蛋白质双向电泳技术姓名学号专业小组成员指导教师中国·武汉年月联系方式：大肠杆菌组蛋白双向电泳技术摘要：蛋白质双向电泳是一种等电聚焦与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术，也是蛋白质组学研究中分离纯化蛋白质的主要方法之一。
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在等电点上的差异，而垂直方向反映出他们在分子量上的差别。
本实验通过学习蛋白质双向电泳技术，熟悉了蛋白质双向电泳的简单流程。
可以根据电泳所得的图像分析，分离蛋白质。
关键字：蛋白质双向电泳等电聚焦电泳 SDS-PAGE前言：蛋白质组研究的发展以双向电泳技术（2-DE）作为核心。
双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点（spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。
本实验是要研究大肠杆菌中的蛋白质，并学习和初步掌握双向电泳技术。
正文：1)实验原理：从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH 环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH 即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质－SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然的电荷差别。
在构象上，蛋白质－SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，这样的蛋白质－SDS复合物，在凝胶中的迁移就不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而仅取决于相对分子质量的大小，从而使我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）来测定蛋白质的相对分子质量。
单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺，在催化剂存在的条件下，通过自由基引发的聚合交联形成聚丙烯酰胺凝胶，这提供了蛋白质泳动的三维空间凝胶网络。
在SDS - PAGE电泳时相对分子质量小的蛋白质迁移速度快，相对分子质量大的蛋白质迁移速度慢，这样样品中的蛋白质可以分开形成蛋白质条带。
2)实验步骤：1.样品制备：1.1 蛋白样品制备方法（TCA-丙酮法）1、收集50mL菌液于离心管中，12000rpm，4℃离心一分钟2、倒掉上清，加10mLPBSbuffer洗涤菌体一次， 12000rpm，4℃离心一分钟3、去上清，加20mLPBSbuffer悬浮菌体，加入蛋白酶抑制剂（cocktail 一片），混匀4、超声波破碎仪或压力破碎仪破碎细胞，至菌体悬浮液变澄清5、12000rpm， 4℃离心10min，去除细胞碎片。
6、将上清转移到新的离心管中，加入适量的核酸酶，混匀，室温放置20min，以除去样品中的核酸。
7、取0.9mL样品裂解液分装到1.5ml离心管中，并在离心管中加入0.3ml 40%的TCA（每组做4管，做好标记）。
8、混匀后，放置在冰上5min。
9、12000rpm， 4℃离心10min，倒掉上清10、加入1ml丙酮洗涤沉淀， 12000rpm， 4℃离心5min，重复三次11、最后倒出丙酮后，再短暂离心，用移液枪吸出残余的丙酮12、打开离心管的盖子，室温放置10-15min，使丙酮完全挥发13、向离心管中滴加50ul样品溶解液， 4℃放置至少3h，溶解蛋白样品。
1.2 制备蛋白样品所需试剂1．细胞洗涤液 PBS buffer PH7.4氯化钠 8g氯化钾 0.2gNa2HPO4 1.42gKH2PO4 0.27g向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解滴加浓盐酸将PH值调至7.4，然后加入去离子水定容至1L.灭菌后室温保存2．蛋白沉淀剂 40%三氯乙酸（TCA）40g TCA加水定容至100ml3．丙酮4．核酸酶5. 蛋白酶抑制剂（cocktail，片剂）6．样品溶解液：尿素 7M 4.2g硫脲 2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gMilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
注：不要反复冻融，分装保存1.3 蛋白定量1.3.1 蛋白定量方法标准曲线法测定蛋白质的含量管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8(mL)蒸馏水(mL) 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝G-4 4 4 4 4 4250(mL)蛋白含量(μg) 0 10 20 40 60 80 OD595nm0 0.128 0.308 0.448 0.617 0.846步骤：1、取7个1.5ml的离心管，标记管号1-72、在1-6号管中，按上表加入标准蛋白液（0.1mg/ml BSA），蒸馏水，考马斯亮蓝R250，混匀后室温放置5min3、从冰箱中取出溶解的蛋白样品，用移液枪反复吹打几次，12000rpm，4℃离心10min，之后将上清转移到一新的离心管中4、取合适体积的蛋白样品加入7号管中，加蒸馏水补足至1ml，考马斯亮蓝G-250 4mL，混匀后室温放置5min.5、用分光光度计测得1-7号管中溶液的光密度OD595nm，(测之前注意调零，以1号管为空白对照调零)以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10µg、20 µg、30 µg、40 µg、50 µg），在坐标轴上绘制标准曲线。
6、利用标准曲线查出回归方程A595nm=aX+b。
7、根据回归方程计算样品蛋白质含量实验结果：经试验得知：标准曲线方程为Y=0.0101X+0.0416其中，Y：吸光度（OD595nm值）X：蛋白质含量（g）2.第一向分离——等电聚焦2.1 上样方法1. 从-20℃取出保存的水化上样缓冲液，置室温溶解。
2. 从小管中取出水化上样缓冲液，加入适量样品、两性电解质(终浓度0.5-1%)和溴酚蓝，充分混匀。
3. 沿着聚焦盘中槽的边缘从左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 3-10），室温中放置10分钟。
而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
5．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。
6. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7.对好正、负极，盖上盖子。
将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。
7cm胶条水化 12小时（20℃）主动水化（50V）S1 250V 线性30分钟除盐S2 500V 快速30分钟除盐S3 4000V 线性3小时升压S4 4000V 快速20,000伏小时聚焦S5 500V 快速任意时间保持选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。
（50 A/根）设置等电聚焦时的温度。
（17℃）2.2 蛋白质上样量双向电泳第一向上样蛋白质量样品溶液的上样体积我组试验中所得到的蛋白质量的数据为：蛋白质的加入量为4ul，所测蛋白质的吸光度为0.354，由标准曲线公式可以得出所测蛋白质含量为30.93ug。
经查表得：在200-500ul中取300ul，那么待测蛋白的点样量为40ul，即在步骤2.1.3中的样品量为40ul。
2.3 水化上样缓冲液配制：水化上样缓冲液成分：尿素 7M硫脲 2MCHAPS 4%DTT 50mMBenzonase 0.3U/ulPMSF 1mMCarrier Ampholytes 0.2%(w/v)溴酚蓝 0.001%水化上样缓冲液母液配方：尿素 7M 4.2g硫脲 2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 50mM 500ul（1M DTT）Benzonase 0.3U/ul 120ulPMSF 1mM 100ulMilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
（1M的DTT：1M的DTT每mL含DTT0.154g）Carrier Ampholytes 0.2%(w/v) 50ul(40%)（现加）溴酚蓝 0.001% 10µl（1% 溴酚蓝）（现加）2.4配制蛋白上样缓冲液：蛋白溶解液适量（根据所制蛋白样品浓度）上样缓冲液母液适量（根据蛋白样品体积）Carrier Ampholytes 0.2%(w/v) 1ul (40%)（现加）溴酚蓝 0.001% 1ul（1% 溴酚蓝）（现加）混匀之后，12000rpm，4℃条件下，离心2min，即可用于上样。
3.胶条的平衡3.1 胶条平衡方法1. 从聚焦盘或-20℃冰箱中取出的胶条，若直接从聚焦盘中取出胶条，可立即进行后续处理，如果是从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10-15分钟平衡。