2d电泳名词解释
二维电泳
-
Dithiothreitol (DTT)
- reducing agent
- breaks disulphide bonds between subunits
-S-S-
DTT
-S-H
+
HS-
2.IPG胶条的平衡
3.第二向SDS-PAGE
(Ettan DALTsix系统) •装板,配胶
•胶条放臵
1367.1-16
三、蛋白质组研究的相关技术
（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：
2-D电泳 1. 1975年，Patrick OˊFarrel发明了二维凝胶电泳。 2. 操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS-PAGE。 （4）2-D胶上蛋白质鉴定 A 早期Western blot鉴定 B Edman降解法鉴定 C 肽质量指纹鉴定 D 蛋白质组信息学
根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的电泳方法称为等电聚焦电泳。 电泳后测定其各种蛋白质 “ 聚焦 ” 部位的 pH ，即可得知它们的等
电点。
2. pH 梯度选择
(1) 传统的凝胶等电聚焦电泳
在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物质是载体 两性电解质。 特点: 它具有依次递变但相差不大的等电点（ PI ），在电场中可以形成逐渐递
detergent binds strongly to proteins approx. 1 SDS/2 a.a.
Sodium dodecyl sulfate
SDS
+
=
-
-
-
Байду номын сангаас
Protein
Proteins (subunits) become linear. Gives all proteins an equal mass : charge ratio
二维电泳_PPT幻灯片
细胞裂解
温和裂解法
冻融法：细菌、组培细胞 去污剂裂解法：组培
▪ 1．菌液培养，收集菌体（5000×g，5min ）； ▪ 2．使用PBS洗菌体两次（5000×g，5min），悬于3ml
裂解buffer（7M urea，2M thiourea，4％CHAPS） 加1mM PMSF；
▪ 3．冰水浴超声破碎，400W，5s/14s，40次； ▪ 4．加RNase，DNase，16℃处理1h； ▪ 5．Bradford法测浓度； ▪ 6．-70 ℃冻存。
3. Running IPG strips
IPG胶条的蛋白质大约载样量
IPG Strip length
7cm
Analytical Load (silver staining) 10~100 g /125 l
Preparative Load (Coom staining) 200~500ug/125 l
▪还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还 原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷 的三丁基膦（TBP）进行还原。
▪起载体作用的两性电解质（ Carrier ampholytes ）： 即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白
质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态， 否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。两性电 解质的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋 白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2 ％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为 了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条 时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。
蛋白组学二维电泳
第一向等电聚焦与IPG胶条的剥离
聚焦程序设置
剥离IPG胶条
根据蛋白质的等电点设置等电聚焦程 序。
聚焦完成后，将IPG胶条从聚焦盘上 剥离下来。
开始聚焦
施加电压，使蛋白质在IPG胶条上分 离。
第二向SDS-PAGE电泳
转移蛋白质
将IPG胶条上的蛋白质转移 到SDS-PAGE凝胶上。
开始电泳
施加电压，使蛋白质在凝 胶上分离。
02
二维电泳技术原理
蛋白质的等电点与分子量
蛋白质的等电点
蛋白质是两性电解质，在特定的 pH环境中，蛋白质分子呈电中性 状态，这个pH值就称为该蛋白质 的等电点。
蛋白质的分子量
蛋白质的分子量是指其分子的大 小，通常以道尔顿为单位表示。
固相pH梯度技术
原理
通过在电泳过程中保持恒定的电流， 使蛋白质根据其等电点在电场中移动 ，从而实现分离。
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蛋白质翻译后修饰的研究
总结词
详细描述
二维电泳在蛋白质翻译后修饰的研究中具有 重要价值，通过分离和鉴定修饰后的蛋白质， 可以了解蛋白质的修饰类型和修饰位点。
二维电泳能够分离出各种翻译后修饰的蛋白 质，如磷酸化、泛素化、糖基化等。通过质 谱等技术对这些蛋白质进行鉴定和修饰位点 的确定，可以深入了解蛋白质的修饰类型、 修饰位点和功能调控。这些结果有助于揭示 生命过程的调控机制和疾病发生发展的机维 的基础，能够将复杂的蛋白质混合物 分离成多个条带。
双向凝胶电泳技术
原理
结合了等电聚焦和SDS-PAGE两种技术，首先根据蛋白质的等电点进行分离， 然后再根据分子量进行分离。
应用
双向凝胶电泳技术能够全面地展示细胞或组织中蛋白质的表达情况，为后续的 蛋白质组学研究提供基础。
蛋白质印迹法
蛋白质印迹法蛋白质印迹法经过几十年的发展，已经成为一种重要的生物分析技术，被广泛用于分析生物样品中蛋白质的组成和表达。
蛋白质印迹法可以快速、灵敏地检测出蛋白质的组成、表达和结构，有效地支持研究者完成生物科学研究，让研究者能够更全面地理解蛋白质的功能和作用机制。
蛋白质印迹法有多种方式，其中最常用的有电泳（SDS-PAGE）、蛋白凝胶印迹（2D-PAGE）、质谱印迹（MALDI-TOF）、重链接蛋白凝胶印迹（RCM-PAGE）、以及同步层析分离法（2D-LC/MS）。
电泳是蛋白质印迹中最常用的技术之一。
它使用一种叫做十二烷基硫酸钠（SDS）和变性剂的全蛋白溶液。
电泳可以指示蛋白质的分子量和结构。
通常，蛋白质溶液经过凝胶定性和定量分析。
蛋白凝胶印迹（2D-PAGE）是一种多维度的方法，可以用来分析蛋白质的复杂性和表达量。
2D-PAGE的基本原理是先将蛋白质溶液通过氨基酸印迹法定量分析，然后再将蛋白质分离出来，最后再通过电泳法进行定量分析。
质谱印迹（MALDI-TOF）是一种分析蛋白质的快速测试技术。
通过这项技术，研究者可以分析蛋白质的分子量、肽段结构和三维结构。
同时，MALDI-TOF也可以用来检测不同样品中的蛋白质表达量，增强蛋白质分析的准确性。
重链接蛋白凝胶印迹（RCM-PAGE）是一种分析蛋白质结构和电性特性的方法。
这个方法可以用来分析蛋白质的可解离结构，让研究者可以从样品中获得有关蛋白质结构和功能的全面信息。
最后，2D-LC/MS是一种结合了质谱印迹和液相色谱的技术，它可以同时对蛋白质的结构和表达量进行定量分析。
2D-LC/MS的优点是它可以快速准确地检测出蛋白质的结构，从而可以有效地支持蛋白质功能和作用机制的研究。
蛋白质印迹法是一种非常有用的研究工具，它可以有效地帮助研究者了解蛋白质的组成和表达，而且还可以帮助研究者分析蛋白质的结构和功能。
在研究蛋白质功能和作用机制方面，蛋白质印迹法已经发挥了重要作用。
二维电泳常见问题及其解答
二维电泳常见问题及其解答摘要：二维电泳即双向电泳,是蛋白质分析常用的技术手段.本文总结了二维电泳中常见的14个问题并对其解答.二维电泳即双向电泳,是蛋白质分析常用的技术手段.第一向等电聚焦电泳：根据蛋白的等电点分离蛋白质;第二向SDS-PAGE电泳：根据蛋白分子量的大小分离蛋白质.本文总结了二维电泳中常见的14个问题及其解答.1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑2D的一向吗?一般情况下是可以的.但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完1D和2D胶后,会有很多横向条纹.所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳.2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面?这是因为BioRad的电泳槽有个盖子.为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条.由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面.如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的.为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量(80%满)的矿物油.3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50μA/胶)?电流的平方和功率成正比.电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加.当温度超过30摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响.4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高?刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子).所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的.由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压.当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的pH条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的pH区域移动.5. 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动?蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的.溴酚蓝也是pH指示剂,当它移动到酸性区时(pH4 ),颜色会变成黄色.溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前.6. 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值?当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值.7. 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低?当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH值区域值,从而变成中性分子.这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小.8. 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生?等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的pI值区域,而成为中心分子.这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气.9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么?硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性.双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性.当蛋白移动到相应的pH值后,就变成了中性分子.而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾.而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集.10. 怎样估计2D胶上蛋白质点的分子量和pI值?可以用 BioRad生产的2D胶标准蛋白来校准.也可以用体系内已知蛋白来做比对.11. 为什么2D胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾?横的脱尾可能是：1)一向等电聚焦不完全; 2)某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3)蛋白的丰度太高.竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好.12. 什么成分会影响2D胶的效果?核酸,盐,去垢剂等等.13. 2D胶的上样量应该在什么范围?上样量和样品有关.样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到.一般的全细胞裂解体系,上样量大概在100微克(银染)到500微克(考染)之间.14. 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩?蛋白质的浓缩有很多方法.大致有超滤法,沉淀法和透析法.超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失.它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附).另外超滤对样品的要求比较高.甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果.沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好.缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失).沉淀法中,又以TCA法最为普遍使用.使用TCA法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的TCA和其他沉淀下来的杂质.透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难. 透析法可以和超滤法联用.先把样品透析到一个比较干净的环境(不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤.注意事项：要想获得比较好的电泳结果,蛋白样品的制备是很关键的一个步骤,蛋白样品中存在杂质会影响等点聚焦,一定要采取有针对性的办法去除相应的杂质例如：盐和带电小分子、核酸等.。
生物化学与分子生物学常考名词解释总结!!!
蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为次级键而形成有规则的构象，如α螺旋β折叠β转角等。
肽单位：肽键是构成在分子的基本化学键，肽键与相邻的原子所组成的基团，成为肽单位或肽平面。
结构域是位于超二级结构和三级结构间的一个层次。
结构域是在蛋白质的三级结构内的独立折叠单元，其通常都是几个超二级结构单元的组合。
在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密的三维实体，即结构域。
超二级结构又称模块或膜序是指在多肽内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。
三级结构具有二级结构、超二级结构或结构域的一条多肽链，由于其序列上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作用，而进行范围更广泛的盘曲与折叠，形成包括主、测链在内的空间排列，这种在一条多肽链中所有原子和基团在三维空间的整体排布称为三级结构。
一级结构蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，以及二硫键的位置。
四级结构多亚基蛋白质分子中各个具有三级结构的多肽链，以适当的方式聚合所形成的蛋白质的三维结构。
增色效应增色效应或高色效应。
由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后 DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
固定化酶不溶于水的酶。
是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。
脂肪酸的β氧化饱和脂肪酸在一系列酶的作用下，羧基端的β位C原子发生氧化，C链在α位C原子与β位C原子间发生断裂，每次生成一个乙酰CoA和较原来少两个C单位的脂肪酸，这个不断重复进行的脂肪酸氧化过程称为脂肪酸的β氧化。
脂肪酸的β-氧化基本过程：丁酰CoA经最后一次β氧化：生成2分子乙酰CoA 。
故每次β氧化1分子脂酰CoA生成1分子FADH２，1分子NADH+H+，1分子乙酰CoA，通过呼吸链氧化前者生成2分子ATP，后者生成3分子ATP。
二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学研究中的应用
二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学研究中的应用摘要随着科学技术的迅猛发展，现代生物学技术已经发展到后基因组时代，蛋白质组学是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。
二维差异凝胶电泳（Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）技术是在双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术，是分析和鉴定基因功能的强有力工具，比经典的2-DE技术具有更高的动力学范围和灵敏性。
该文就2D-DIGE 技术的发展以及在昆虫研究上的应用前景进行了展望。
关键词二维差异凝胶电泳；蛋白质组学；昆虫1 研究背景随着大量生物体全基因组序列的揭示，特别是人类基因组测序计划的完成，标志着生命科学研究取得了极其重要的阶段性成果，同时也标志着生命科学正式进入崭新的后基因组时代[1-2]，研究的重心也从揭示遗传信息结构的基因组学转移到功能基因组学上来，蛋白质组学作为高通量的蛋白质分析方法，也将对功能基因的研究做出巨大贡献。
蛋白质作为基因表达的产物与生命活动的执行者，直接体现了生命现象的复杂性和多变性。
因此，只有对实现最终功能的蛋白质进行分析鉴定，才能更好地描述细胞活动或行使功能的动力学过程，才能更贴近对生命现象和本质的掌握。
二维差异凝胶电泳（Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）技术是分析和鉴定昆虫基因功能的强有力工具，其是在双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术，在生物学各个领域得到广泛的应用[3-6]。
2D-DIGE在昆虫免疫调节、生理发育、昆虫毒理学以及传毒媒介昆虫的传毒机制等领域的应用也变得越来越广泛，其研究结果受到科学家们的高度重视。
2-D 电泳
双向电泳分离牛血清蛋白质（1）蛋白质组：1994年提出，最早见于文献是1995年7月的“Electrophoresis”杂志上。
指基因组表达的所有相应的蛋白质，也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。
（2）蛋白质组学：研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学。
1. 细胞或组织内蛋白质的表达模式（表达蛋白质组学）：关键技术：2-DE2. 蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析等。
3. 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用。
蛋白质组学的研究内容（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）双向电泳法是根据不同组分之间的等电点差异和分子量差异建立的。
第一向根据蛋白质的等电点(pI)不同，用等电聚焦电泳(Isoelectric focusing, IEF)分离蛋白质。
第二向则按蛋白质分子量大小的差异，通过蛋白质与SDS形成复合物后在聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中迁移率的不同而达到分离的目的。
载体两性电解质形成pH梯度的模式图1 样品处理2 载体两性电解质3 两向间的平衡4 分离后斑点的检测聚焦时间、电压......制备原则应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。
完全去除样品中的核酸、多糖，以及某些干扰蛋白。
变性剂：通过改变或破坏的氢键等次级键的结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露。
其典型代表是尿素和硫脲。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。
常用的表面活性剂有非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。
还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。