2013分子实验考试 (2)

分子实验考试 题型——名词解释（4道） 简答题（3道） 综合分析题 （1道）

一、名词解释: 【复性】 变性DNA在适当条件下，两条分开的互补单链可重新恢复双螺旋构象，这种现象称为复性。

【质粒】 质粒是染色体外的稳定遗传因子，能自主复制和转录并表达所携带的遗传信息。大小为1-200Kb，为双链闭环超螺旋DNA，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

【感受态细胞】 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细胞经过一些特殊方法（电击法、 CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。

【转化】 是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

【卫星菌落】 某些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它可以破坏氨卞青霉素。当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶积累过多，就会使周围的氨卞青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，即出现卫星菌落。

【PCR】 聚合酶链式反应 (PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。

【转化效率】 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率。 转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数(10) （注：稀释倍数 = 涂布前总体积／涂板用菌液体积 ） 转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)

【酶切】 限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。 【连接】DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’- P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键，在有Mg2+、ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。

【报告基因】 GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因 ，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一种水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此GUS基因作为报告基因被广泛应用于基因调控的研究中。

二、填空 1、碱裂解法提取质粒的原理、主要试剂组成。 【原理】 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

【试剂组成】 1、E.coli 5а(含pUC18或19质粒)？？ 2、溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L） 3、溶液Ⅱ： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4、溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸 ； 28.5ml水 5、Tris饱和酚 6、氯仿+异戊醇（24：1） 7、无水乙醇 8、70%乙醇 9、ＴＥ缓冲液（pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ，1mmol/L EDTA(pH8.0) 10、RNaseA酶

2、PCR反应体系的组成 1、DNA模板：λ 噬菌体的质粒DNA 2、dNTP:4种dNTP混和物。 3、10× PCR缓冲液(buffer)，具体组分如下: MgCl2、KCl、Tris.HCl(pH8.3)、明胶 4、引物(primer):上游引物（M13 F），下游引物（M13 R） 5、Taq DNA聚合酶

3、感受态细胞生长状态和密度要求 菌悬液在LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右(对数生长期）。 注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。

4、转化主要操作的目的 质粒和感受态细胞混和：0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。 热击：在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。 复苏：使细菌恢复正常生长状态,即摄入了外源DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，并表达质粒编码的抗生素抗性基因Ampr（即外源基因）。当带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。

5、限制酶的几大类型、识别和作用特点、条件？？ 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。

Ⅱ型限制性内切酶的主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸（在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶），少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的（4-11）。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。 影响酶切反应的因素：DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+ 一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。 三、简答题 1、PCR原理 聚合酶链式反应 (PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。

2、PCR变温程序具体操作中，包括几个阶段？每个阶段的作用、大致范围及如何设定。 【变性】 作用：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备？？ 大致范围：94-95℃，30秒。 设定理由：变性不完全,往往使PCR 失败 ，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失 。

【退火(复性)】 作用：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合？？ 大致范围：50~60℃ 设定理由：通常PCR的退火温度选择为Tm-5℃。退火温度越高,所得产物的特异性越高。 ◇引物为20mer以下时： Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C) ◇引物为20mer以上时： Tm=81.5十0.41×(GC％)- 600/L 其中L为引物的长度

【延伸】 作用：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链？？ 大致范围：72℃，1-2kb/min 设定理由：延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。

循环数：35 cycles。因为循环次数过多，会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。 3、碱裂解法提取质粒原理、溶液I、溶液II和溶液III作用 【碱裂解法提取质粒原理】 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

【溶液I】 1、低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 2、EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 3、Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。

【溶液II】 1、SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 2、NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。

【溶液III】 由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。 1、能中和溶液II的碱性，使DNA复性。 2、K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。

4、连接的原理及反应体系组成、作用温度 【连接的原理】 核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。 DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’- P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。 一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。 【反应体系组成&作用温度】 体系：ddH2O、λDNA/EcoT14I片段(50ng/ul)、连接缓冲液、T4 DNA连接酶