产淀粉酶米曲霉的分离、鉴定及酶促动力学分析
米曲霉的研究及应用进展
⽶曲霉的研究及应⽤进展⽶曲霉的研究及应⽤进展摘要：介绍了⽶曲霉的⽣物学特性，并综述了⼯业上的相关应在基础相关领域、发酵产物领域、宏观诱变及微观诱变领域的研究与应⽤并提出展望。
关键词：⽶曲霉⽣物学特性⼯业应⽤1 ⽶曲霉的⽣物学特征⽶曲霉(Aspergillus oryzae)是⼀种好⽓性真菌，分类学归属于半知菌亚门、曲霉属。
菌落⽣长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，菌丝⼀般呈黄绿⾊，酸度较⼤的培养基上呈绿⾊，酸度较⼩的培养基上呈黄⾊，⽼化后逐渐为褐⾊。
分⽣孢⼦梗⽣长在厚壁的⾜细胞上，分⽣孢⼦头呈放射形，顶囊球形或瓶形。
培养适温37℃。
⽶曲霉主要存在于粮⾷、发酵⾷品、腐败有机物、⼟壤等处，是我国传统酿造⾷品酱、酱油和酒类的⽣产菌种，也可⽤于⽣产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益⽣素等。
在众多曲霉属家族中，⽶曲霉占有着重要的地位。
随着应⽤领域的蓬勃发展，⼈们对⽶曲霉的关注⽇渐增长。
2.⽶曲霉基础领域的研究2．1 ⽶曲霉基因组的破译⽇本研究⼈员历经四年零四个⽉时间成功的破译了⽶曲霉基因组，并于2005年12⽉在《⾃然》杂志上发表了分析结果：⽶曲霉基因组⼤约有3800万个碱基对，共有8条染⾊体，包含约1．2万个基因。
这⼀成果为从微观领域研究⽶曲霉打下了⼀个良好的基础。
2．2⽶曲霉原⽣质体制备、再⽣和融合为了更进⼀步研究⽶曲霉，制备原⽣质体就变得尤为重要。
原⽣质体(Protoplast)即在⾼渗压溶液中，⽤酶法将细胞壁分解除掉，剩下由原⽣质膜包住的球状胞体。
它保持了原细胞的⼀切活性。
原⽣质体因去掉细胞壁屏障⽽对诱变剂的敏感性增强、变异率提⾼，⽽且表⾯易形成电极性，使不同种原⽣质之间相互易于吸引、脱⽔粘合⽽形成聚集物，因⽽原⽣质体诱变、融合是菌种选育的⼀种⾏之有效的⽅法。
王燕等⼈利⽤纤维素酶、溶壁酶、蜗⽜酶三种酶混合，并按5:3:1的配⽐，结果达到了最优的破除细胞壁的效果。
章运等⼈考虑了茵龄、酶解温度、酶解时间、再⽣培养基的稳渗剂等多种因素，对沪酿3．042的原⽣质体制备与再⽣做了相关研究。
甜酒曲中一株高产淀粉酶根霉的筛选与鉴定
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DOI：10.13746/j.njkj.2018177
甜酒曲中一株高产淀粉酶根霉的筛选与鉴定
周金虎 1，陈茂彬 1，毛志海 2，方尚玲 1
糯米酒，又称江米酒、甜酒、酒酿、醪糟，主要原 料是糯米，酿制工艺简单，口味香甜醇美，乙醇含量 极少，主要含有糖、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质 等营养成分，适宜各类人群食用，因此深受人们喜 爱。不同的甜酒曲酿制的米酒口感风格迥异[1]。
目前市场上销售的甜酒曲共分为传统土曲、现 代工业化生产的甜酒曲、纯种的根霉曲 3 类，质量 参差不齐[2]。现代工业化生产的甜酒曲主要含有酵 母 菌 和 根 霉 ，而 纯 种 的 根 霉 曲 中 就 只 有 单 一 的 根 霉，传统土曲是由根霉、毛菌、细菌、酵母菌等多种 微生物及米粉、辣蓼草等中草药制作而成，酿制的
米酒芳香独特，口感香醇，但甜度不够，主要是因为 土曲在培养的过程中有多种微生物共同生长，但却 没有糖化力较强的菌株，而根霉菌的特性之一就是 有较强的糖化酶活力 。 [3] 由此可见，甜酒曲都需要 有较强糖化力的根霉菌。甜酒曲的质量直接影响 米酒的品质及产量，因此研究甜酒曲中的根霉菌具 有十分重要的现实意义。鉴于此，本研究着重从 4 种不同的甜酒曲中筛选出糖化力较强的根霉菌，并 通过 18S rDNA 分子生物学进行鉴定，以期与同行 共同探讨学习。
基金项目： “十三五”国家重点研发计划项目中的重点课题子课题（2016YFD0400500）：传统酿造食品风味与品质调控及新型酿造技术创制。 收稿日期：2018-06-12 作者简介：周金虎(1993-)，男，湖北枣阳人，在读硕士研究生，研究方向为酿酒技术及微生物。 通讯作者：方尚玲，博士，教授，研究方向为工业微生物，E-mail：1425176720@。 优先数字出版时间：2018-08-28；地址：/kcms/detail/52.1051.TS.20180828.1021.003.html。
米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定
米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定武金霞;常淑英;孙鹏;张永阔;张贺迎【摘要】The crude enzyme solution from Aspergillus oryzae Huniang 3. 042 mature Koji was extrac ted for the purpose of revealing the roles of cellulases in the process of material decomposing, and the ac tivity of exocellulase , endocellulase and β-glucosidase was analyzed by DNS method . Four Cx enzymes were identified by Congo red staining, called as Cx enzyme Ⅰ , Cx enzyme Ⅱ , Cx enzyme Ⅲ and Cx en zyme Ⅳ respectively in this article. DEAE-Cellulose-52 ion exchange chromatography was used to primari ly separate endocellulases in the crude enzyme solution, it was found that the elution peak of 0. 15 , 0. 20 , 0. 25, 0. 30 mol/L NaCl contained the active components. Then, four purified Cx enzymes were obtained by preparative electrophoresis. First three Cx enzymes were monomeric enzyme and their molecular mass were 31 800,34 000, 26 000 u respectively determined by SDS-PAGE, the last one contained four subunits ,and their molecular mass were 14 000,23 600,26 000,33 500 u respectivly. The optimal temperature of en docellulases in the crude enzyme solution was 50 ℃,and the optimal pH was 4. 0.%为了解米曲霉纤维素酶在物料分解过程中的作用,从米曲霉沪酿3.042成曲中提取粗酶液,利用DNS法分析了粗酶液中外切酶、内切酶及β-葡萄糖苷酶的活力.用刚果红染色法确定了沪酿3.042成曲粗酶液中含有4种内切型纤维素酶,分别称为Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ和Cx酶Ⅳ.经DEAE-Cellulose-52离子交换层析,0.15,0.20,0.25,0.30 mol/L NaCl洗脱峰均测得内切型纤维素酶活性,制备电泳纯化得到4个内切型纤维素酶组分,SDS-PAGE结果显示,Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ为单体酶,分子质量分别为31 800,34 000,26 000 u,Cx酶jV含有4个亚基,分子质量分别为14 000,23 600,26 000,33 500 u.粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为4.0.【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(032)001【总页数】7页(P68-74)【关键词】米曲霉;内切型纤维素酶;刚果红染色;离子交换层析;制备电泳【作者】武金霞;常淑英;孙鹏;张永阔;张贺迎【作者单位】河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生物技术研究中心,河北保定071002【正文语种】中文【中图分类】Q814.1;Q556.2米曲霉是一种丝状真菌，因其生长过程中能够产生丰富的水解酶系，被广泛应用于食品、饲料、酿酒等行业[1].米曲霉沪酿3.042是应用于国内酱油酿造行业的主要菌株之一，其生长环境粗放，适应性强，生产纤维素酶产量高，稳定性好，而且其产生的纤维素酶是胞外酶，发酵完成后，纤维素酶容易与菌体分离纯化得到所需的酶.纤维素酶(cellulase)是分解纤维素的一类酶, 包括内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21)[2-3]，这些酶组分协同作用将纤维素分解为葡萄糖.在酿造过程中纤维素酶可以分解物料细胞壁,增加细胞内含物的溶出，有利于蛋白酶充分作用于大豆蛋白，从而提高原料的利用率和氨基酸态氮生成率[4].有报道酱油生产中添加纤维素酶或提高菌株的纤维素酶活力，有利于提高酱油质量和出油率[5].本实验室曾初步以刚果红染色法检测出米曲霉3.042含有2种内切型纤维素酶组分[6]，本研究拟进一步鉴定并纯化米曲霉沪酿3.042菌株的内切型纤维素酶组分，研究其酶学性质，为进一步了解纤维素酶在酿造过程中的具体作用，以及与其他酶的协同机制提供理论基础.1.1 材料1.1.1 菌种米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042(本实验室保藏).1.1.2 培养基m(豆粕)∶m(麸皮)∶m(水)=6∶4∶10.1.1.3 主要实验仪器HWS型智能恒温恒湿箱(宁波东南仪器有限公司)，SH-5磁力搅拌器(BeiDe)，GL 20A高速冷冻离心机(中国湘西仪器厂)，数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)，BG-Power 600电泳仪(BAYGENE)， 721型分光光度计(上海第三分析仪器厂).1.2 方法1.2.1 米曲霉纤维素酶粗酶液的制备称取5 g成曲，充分研磨后加20 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)，磁力搅拌15 min，4 ℃ ，10 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液，分装后放置于-20 ℃冰箱备用.1.2.2 葡萄糖标准曲线制作采用DNS法[7]制作葡萄糖标准曲线.1.2.3 粗酶液纤维素酶的酶活测定1.2.3.1 内切型纤维素酶活力测定将粗酶液稀释10倍，取3支刻度试管，分别加入0.1 mL稀释酶液，再分别吸取1.9 mL 10 g/L的羧甲基纤维素钠(CMC)(pH 5.0，0.05 mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)溶液，50 ℃水浴保温30 min；空白样用煮沸灭活的稀释酶液 0.1 mL 代替样品，同样50 ℃水浴保温30 min.再吸取DNS试剂2 mL，充分摇匀后具塞，沸水浴反应10 min,冷却至室温后用去离子水定容至15 mL，上下摇匀，用空白调零点，于550 nm 下测定OD值.根据标准曲线求出对应葡萄糖产量，计算出粗酶液中内切型纤维素酶活力(U/mL).每小时由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(U).计算公式：A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)；D:酶液的稀释倍数；t:反应时间(min).1.2.3.2 外切型纤维素酶活力测定采用DNS法，以脱脂棉为底物[8].1.2.3.3 β-葡萄糖苷酶活力测定采用DNS法，以水杨素为底物[9].1.2.4 蛋白质含量测定采用Folin-酚法[10]测定蛋白质含量，以标准酪蛋白溶液做标准曲线.1.2.5 PAGE检测粗酶液中蛋白质组成浓缩胶质量浓度为45 g/L，分离胶质量浓度为100 g/L，浓缩胶电压120 V，分离胶电压150 V，室温电泳结束后考马斯亮蓝染色15 min，用体积分数为7.0%的冰乙酸脱色至条带清晰.1.2.6 CMC-PAGE检测粗酶液中内切型纤维素酶组分参照文献[6]稍做改进.配制质量浓度为100 g/L的PAGE分离胶，加入1 g/LCMC溶液(pH 5.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)0.4 mL，再配制质量浓度为45 g/L的浓缩胶，用不同浓度粗酶液点样，浓缩胶120 V，分离胶150 V，4 ℃低温电泳.电泳结束后，将胶切成2部分，一部分考马斯亮蓝染色，另一部分置于50 ℃预热的0.1 g/L刚果红染色液(用0.05 mol/L pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)中，50 ℃恒温水浴3 h后移至1 mol/L NaCl脱色液中，常温脱色至条带清晰.1.2.7 DEAE-Cellulose-52离子交换层析初步分离内切型纤维素酶将DEAE-Cellulose-52离子交换柱用pH 7.2，0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡后，取10 mL粗酶液上样，然后以NaCl浓度依次为0.10，0.15，0.20，0.25，0.30,0.35,0.40，0.60 mol/L的pH 7.2，0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液进行分步洗脱(3.5 mL/min).收集各洗脱峰，将各洗脱峰透析、浓缩后以天然-PAGE电泳检测蛋白组分[11].1.2.8 制备电泳分离纯化内切型纤维素酶组分参照刚果红染色图谱切胶，95 W,30 V,25 mA进行回收电泳[12].将所得的酶组分进行酶活力和分子质量测定.酶活力测定过程中，将回收的纯酶冻干浓缩成酶粉后加入100 μL蒸馏水溶解，作为稀释酶液，空白样加入蒸馏水，其余操作同1.2.3.1.1.2.9 粗酶液中内切型纤维素酶最适反应温度和最适反应pH值的测定配制含有10 g/L CMC的0.05 mol/L，pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，测定20～80 ℃内切型纤维素酶的最适反应温度；配制含有10 g/L CMC的0.05 mol/L，pH 3.0～8.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，测定50 ℃时内切型纤维素酶的最适反应pH值[8].2.1 米曲霉3.042纤维素酶分泌曲线图1显示，制曲时间为35 h时内切型纤维素酶酶活最高，此时粗酶液蛋白质质量浓度为19.26 mg/mL,纤维素酶系中不同酶组分的酶活力如表1.2.2 刚果红染色法鉴定内切型纤维素酶组分配制PAGE分离胶时加入内切型纤维素酶的底物CMC，使其均匀分布在胶内，电泳结束后经过水浴，如果样品液中含有内切型纤维素酶则会将CMC长链的纤维素分子降解为纤维寡糖, 刚果红能将长链的纤维素分子染成红色,却不能将纤维寡糖染色，因此水浴后的凝胶经刚果红染色后未着色的透明区域即为内切型纤维素酶的位置.由图2 a和图2 b可知，分离胶内添加一定质量的CMC，会造成各个蛋白条带的相对迁移率都减小，但各个条带的相对位置不变.由图2 c 可知，米曲霉沪酿3.042成曲浸提液含有4个内切型纤维素酶组分，分别称为Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ 和Cx酶Ⅳ，从透明区带的范围初步认为Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ具有较高的活力，而Cx酶Ⅰ和Cx酶Ⅳ活力较低.2.3 DEAE-Cellulose-52离子交换层析用DEAE-Cellulose-52离子交换层析初步分离米曲霉粗酶液，280 nm下核酸蛋白检测仪测得不同NaCl浓度的pH 7.2，0.01 mol/L的 Tris-HCl缓冲液各洗脱下一个蛋白峰(图 3).经DNS法测定酶活和天然-PAGE电泳检测可知，0.15，0.20，0.25和0.30 mol/L NaCl洗脱下的蛋白峰含有内切型纤维素酶组分(图4 ).其中0.15 mol/L NaCl的洗脱峰含有Cx酶Ⅲ，虽然杂蛋白较多，但迁移率与Cx酶Ⅲ相差较大.0.2 mol/L NaCl浓度下的洗脱峰含有Cx酶Ⅰ，但杂蛋白含量较多.0.25 mol/L NaCl 洗脱峰含有Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅳ3个目标组分，且杂蛋白较少.0.3 mol/L NaCl洗脱峰含有Cx酶Ⅳ，杂蛋白也相对较少.米曲霉粗酶液中蛋白质组分较多，由于一些蛋白质的荷电性质及分子质量相近，导致多条目标条带和其他杂蛋白混杂在一起，仅采用离子交换层析不能有效地将单个纤维素酶组分纯化.因此分别将上述不同NaCl浓度洗脱液冻干浓缩，以制备电泳切胶回收4个内切型纤维素酶组分.2.4 制备电泳分离纯化内切型纤维素酶组分及分子质量测定图5 a和图5 b显示制备电泳纯化的Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ 和Cx酶Ⅳ4个组分，DNS法测定其酶活分别为61.77，6.11，44.93，72.03 U/mL，因此可以确定纯化到的酶组分为目标组分，后经SDS-PAGE 电泳测得Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ的分子质量分别是31 800，34 000 u(图5 c)和26 000 u(图5 d)；Cx酶Ⅳ含有4个亚基，分子质量分别为14 000，23 600，26 000，33 500 u(图5 d).2.5 粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度和最适反应pH值米曲霉(A.oryzae)沪酿3.042成曲粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度为50 ℃(图6)，最适反应pH值为4.0(图 7).米曲霉固体发酵产纤维素酶的最佳收获期是35 h,其纤维素酶系中包含有外切型和内切型纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶.经离子交换层析、制备电泳纯化到4个内切型纤维素酶组分.SDS-PAGE结果表明，Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ为单体酶，Cx酶Ⅳ为多亚基酶，这种现象可能与不同种类内切纤维素酶的分子组成有关：纤维素酶的各组分大多是糖蛋白，含糖的比例各不相同；糖和蛋白质之间的结合方式也不同，有的是通过共价键连接，有的是可解离的复合物[13-14].在酱醅发酵中，纤维素酶能起到崩溃豆饼、小麦、麸皮中的纤维素及将其分解成糖的作用，我国酱油酿造中多采用低盐固态发酵工艺，发酵温度较高(一般控制在40～45 ℃)，酱醅pH值较低，米曲霉产纤维素酶的最适温度和pH值分别为50 ℃和4.0，这一特性与酱醅发酵条件一致.因此，在酱油制备过程中米曲霉纤维素酶能发挥其最大作用，提高物料的利用率.【相关文献】[1] LIANG Yanchang, 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[教材]米曲霉
![[教材]米曲霉](https://img.taocdn.com/s3/m/6eb005e8f605cc1755270722192e453610665b29.png)
米曲霉|酱油曲精|酿造菌种|沪酿3.042|中科3.951一、米曲霉产品概述: 半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。
米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。
米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。
米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病提供了线索。
二、米曲霉（酱油曲精）公司产品介绍：酱油曲精以CICC2339（沪酿3.042）米曲霉菌株为主，外增产蛋白酶的黑曲霉等多菌种，通过纯种培养、复配精制而成。
产品优势：1.用于制曲提高产量，氨基酸转化率高于同类产品的5%--10%。
2.增香，酶系中含有NSP分解酶系，鸟苷酸等呈味物质成率较高，能给产品带来特有的鲜香味。
3.缩短制曲、发酵周期，更加便于提高生产连续性及设备利用率。
产品配方：麦片，豆皮，微量元素，CICC2339（沪酿3.042），ACCC30467（沪酿336-2），ACCC30368（AS3.350）等。
产品用途：酱油原料制曲，广泛用于豆瓣酱、豆酱、豆豉等的发酵。
接种量：万分之三至五，按混合干料计。
使用方法：取曲精30倍干面粉稀释混匀，均匀的接入料中温度要求：小于等于40℃接种，入池后温度在34-36℃。
（夏低冬高）制曲时间要求：24-28小时成熟。
（制曲一般不超过28小时）保存方法：25℃以下阴凉干燥保存。
（建议冰箱保存）注意事项：（1）本产品为符合菌种，在生产前期比单一的生长速度可能有所慢，属于正常现象，不会影响生产。
α-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
【生物工程专业】【毕业设计文献综述开题报告】产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备(可编辑)
【生物工程专业】【毕业设计文献综述开题报告】产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备（可编辑）【生物工程专业】【毕业设计+文献综述+开题报告】产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备(20届)毕业论文摘要: 从中分离得到一株产菌株，根据菌落形态和常规生理生化鉴定方法对菌株进行鉴定，为了确定该菌株在分类学上的位置，对这一菌株进行16S RNA分子鉴定。
主要是通过16S rNA测序与GenBank中已有的序列比对来鉴定菌种序列比对Bacillusamyloliquefaciens有99%的相似度。
该酶的最适反应温度为60，最适反应pH值为6.0。
关键词: ;;Abstract: A strain of amylase producing was isolated from nature. The strain was identified by the shape and general physiological and biochemical properties. In order to confirm the location in taxonomy,16S rDNA sequence of the strain was sequenced and it had the similarity of 99, with that of theBacius amyloliquefaciens. Amylase which is extracellular in incubation period of the strain can be purified by salt out. The optimum temperature of amylase is 60? and the optimum pHis 6.0.Keywords: amylase; strain identification; preparations ofenzymes目录摘要…………………………………………………………………………………………………… ? Abstract……………………………………………………………………………………………… ?1 绪论 11.1 高产淀粉酶的来源 11.2 菌种鉴定的方法概况 11.3 α-淀粉酶的研究 21.3.1 α-淀粉酶分离纯化方法的研究 21.3.2 α-淀粉酶活力测定方法的研究 31.4 淀粉酶的应用 31.4.1 在食品工业中的应用 31.4.2 在造纸业中的应用 31.4.3 在清洁剂生产中的应用 31.4.4 在医药行业中的应用 32 实验方法 42.1 材料、试剂和仪器 42.1.1 生物材料 42.1.2 主要试剂 42.1.3 培养基配方 42.1.4 主要仪器和设备 42.2 实验方法 52.2.1 菌种活化和培养 52.2.2 菌落及生理生化特性鉴定 5 2.2.3 菌种的分子鉴定 52.2.4 菌种的发酵 62.2.5 淀粉酶活力测定 62.2.6 蛋白质含量的测定 6 2.2.7 酶的制备 62.2.8 酶学性质研究 73 结果与分析 93.1 菌落生理生化特性鉴定 9 3.2 菌株分子鉴定结果 93.3 淀粉酶分离纯化结果 10 3.4 淀粉酶酶学性质的研究结果 11 3.4.1 酶反应的最适温度和酶的热稳定性研究 113.4.2 酶反应的最适pH值和酸稳定性 124 结论 14参考文献 15致谢 171 绪论β-淀粉酶。
一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析
一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析1 引言米曲霉耐盐蛋白酶（Salt tolerant Protease）是一种特殊的耐盐蛋白酶，它可以在比较高的盐浓度下表现良好的活性和稳定性，其在蛋白质分解、脱落酸合成有着广泛应用。
本文主要介绍了米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析。
2 纯化1. 菌种的鉴定：菌株分离药物米曲霉的菌种用Gram染色法和生化鉴定法进行鉴定，确定菌种。
2. 生物培养：采用葡萄糖为唯一碳源，用1.5%酵母发酵液制备新酵母混合物，随后添加1%尿素作为氮源，并滴入0.5％KCl罗丹明B缓冲液，经37℃孵育48h，浓缩液筛除杂质，经0-4℃冷冻保存。
3. 生物活性筛选：用耐盐活性、pH值等属性进行筛选，分离出最优菌株。
4. 初级纯化：将活的产酶菌种经冻干保存，再提取细菌内的活蛋白。
将生物取材物放置4℃，经20%混合醇沉淀及后续步骤，实现米曲霉耐盐蛋白酶的初级纯化。
5. 遗传改造及二次纯化：运用遗传改造技术，在紫外和透射电镜监测活性下，调节米曲霉耐盐蛋白酶的活性的影响因素，最终加强蛋白的活性，实现二次纯化。
3 酶学性质分析1. 蛋白酶的活性：用尿素酶作为参照检测蛋白酶的活性，测定其特定的滴度和速度系数以及产物，可以用吸光度来估算所测蛋白酶的活性，以了解其活性情况。
2. 稳定性：为了衡量蛋白酶在变温状态下的稳定性，运用temperature/time曲线模型对它进行研究，观察蛋白酶在不同温度下的活性是否会发生变化。
3. 耐盐性：以里士顿吸光法检测米曲霉耐盐蛋白酶的活性，以NaCl分别从0-4mol/L不断加倍，观察从0-4mol/L不同NaCl浓度下，米曲霉耐盐蛋白酶的活性是否会降低，以确定其耐盐性程度。
4. pH值：用里士顿吸光法检测蛋白酶的活性，以不同pH值（3.0-10.0）下蛋白酶的活性，观察其最适催化pH值，推断其最佳pH 值下蛋白酶的最佳活性。
4 结论经纯化及酶学性质分析，证明米曲霉耐盐蛋白酶具有较高的活性、稳定性及耐盐性，因此具有广泛的应用前景，为蛋白质和脱落酸研究及大规模用于工业生产提供了可行的方案。
米曲霉菌种种曲杂菌的鉴定方法
米曲霉菌种种曲杂菌的鉴定方法
米曲霉菌属是一种常见的真菌，包括多种曲杂菌。
鉴定米曲霉菌种类和曲杂菌的方法主要包括以下几种：
1. 外部形态观察：观察菌落的形态特征，包括颜色、形状、大小和表面纹理等。
不同菌种的菌落形态差异较大，可以帮助鉴定种类。
2. 微观形态观察：通过显微镜观察菌丝的形态特征，包括菌丝的直径、分枝情况、孢子形态和孢子产生的结构等。
不同菌种的孢子形态和产生结构有所不同，是鉴定的重要依据。
3. 生理和生化特性：通过菌落的生长特性、产生的酶活性、代谢产物和化合物分析等，来判断菌株的代谢类型和产物特征。
例如，一些曲杂菌能够产生青霉素，可以通过鉴定其生理特性来确定菌种。
4. 分子生物学方法：使用分子生物学技术，如PCR、DNA测
序和分子标记等，对米曲霉菌的特异基因序列进行分析和比对，从而精确鉴定种类和亲缘关系。
以上是常用的米曲霉菌种种曲杂菌的鉴定方法，不同的方法可以结合使用，以提高准确性。
浙江师范大学微生物实验报告 产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定吴月婷摘要：从土壤中分离得到一株产淀粉酶的芽孢杆菌X-1，对其进行形态学鉴定和生理生化特性分析，包括菌落形态、菌体形态、糖利用情况、生长pH范围、耐盐范围、明胶液化和酪素的水解等，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus lentus）。
关键词：产淀粉酶；芽孢杆菌；分离；初步鉴定淀粉酶(Amylase)是指能分解淀粉糖苷键的一类酶，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等，在生物体的糖类代谢中起重要的作用。
其中α-淀粉酶（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase）能水解淀粉大分子的α-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等水解产物[1]。
α-淀粉酶在植物、动物和微生物中都广泛存在，常见的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、红曲霉和根霉等[2-7]。
芽孢杆菌属(Bacillus)是一类能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较强的抵抗不良环境的能力，如耐酸碱、耐高温的能力较强。
芽孢杆菌中较多菌种具有高淀粉酶、蛋白酶活性，近年来被广泛地用于动物饲料业，特别是作为水产饲料的添加剂。
例如在银鲫饲料中添加了0.1%的芽孢杆菌后，银鲫肠道和肝胰脏的淀粉酶活性提高了3.7%和129.5%[8]，能够有效帮助动物对饲料的消化吸收，同时作为一种良好的免疫激活剂，能增强动物的免疫力和抗病力[9]。
此外，利用芽孢杆菌产生α-淀粉酶，在食品生产中也有广泛应用。
笔者从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌，进行种属的初步鉴定，以期为芽孢杆菌在动物饲料业和食品生产中的发开应用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料土壤材料采集于浙江师范大学取杏园食堂草坪土壤表层5~10厘米下的肥土。
1.2 培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨l%、葡萄糖0.5%、Nacl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%。
米曲霉蛋白酶菌株分离[1]
酱油曲中米曲霉蛋白酶菌株的分离及初步鉴定实验原理米曲霉是一种好氧微生物，具有很强的蛋白质的能力，米曲霉系对原料成分分解的能力取决于这类酶的活性。
酱油酿造过程就是利用曲培养米曲霉，使其大量繁殖，分泌多种酶，其中最主要的是蛋白酶。
米曲霉具有酶系丰富,产蛋白酶的酶活高,生长快,适应能力强,不产毒素等特点,因而广泛用于酱油生产中以形成独特的色,香,味,体。
所以酱油曲中有大量米曲霉，可从酱油中筛选出目的米曲霉。
米曲霉菌落生长快，10d直径达5~6cm,质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。
背面无色。
分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。
分生孢子梗2mm左右。
近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。
顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50 μm。
小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。
分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，老后大多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。
米曲霉产生的蛋白酶会分解酪蛋白。
由于酪蛋白在培养基中呈浑浊状，在培养基中将会在形成一圈透明光圈，得到产蛋白酶的菌株。
测定透明圈及菌落直径大小，根据HC（HC=透明圈直径/菌落直径）大小，筛选出高产蛋白酶的菌株。
实验器材酱油曲曲药5g 无菌水、无菌培养皿、无菌移液管、无菌试管、三角瓶等乳酸石碳酸棉兰染色液接种针、涂布波棒、酒精灯、擦镜纸、载玻片、盖玻片、显微镜酪蛋白培养基:Na2HPO4·12H2O 1.07 g,干酪素4 g,KH2PO43 g,葡萄糖20g、琼脂20 g,自然PH，加热溶解再用蒸馏水定容到1000 mL, 121℃灭菌20 min。
实验步骤1.配制酪蛋白培养基，灭菌，倒平板备用（七个平板）：将50℃左右的灭菌酪蛋白培养基倒入无菌培养皿中（制备七只平板），平置，凝固后，分别编号为空白（一只），10（-7）10（-8）、10（-9）分别两皿。
2.稀释样品：将酱油曲曲药用无菌水45 ml制成均匀浊液，取9只加有无菌水的试管（每管9ml）, 依次编号10（-1）、10（-2）、…10（-8）、10（-9），用2ml无菌移液管取浑浊菌液1ml加进10(-1)的试管中混匀。
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２． 淀粉 酶酶 促 动力 学分 析 ３
Ｊ Ｐ－１ ２ 础 培 养 基 固体 发 酵 产 淀粉 ＬＳ ４ 酶， 酶活为９ ９ 其 ４． Ｕ／ｍｇ。 倒数 作 图求 得 双
力单位 （ 定 义为 ： 最适 反应条件 下 ， ｕ） 在 以
每 １ ｎ 成 １ ｍｏ还 原 糖 （ ｍｉ 生 ｌ 以Ｄ一 萄 糖计 ） 米 曲霉 淀 粉 酶 的 米 氏常 数 （ 葡 Ｋｍ） 最 大 反应 、
剂 品种。
３。 ’热循环 参数 ：４Ｃ预变性 ２ ０ ｎ，４ ９￣ 。ｍｉ ９ ℃变性 ５ ．ｓ ５ ￣ ００ ，０Ｃ变性５ ．ｓ７ ℃延伸２ Ｏ ｎ，（ ０ ０ ，２ ．ｍｉ ３１ 个循 环 ，２Ｃ延ｔ ０ Ｏ ｎ ＰＣ ７￣ ￥１ ．ｍｉ。 Ｒ产物经过 １Ｏ ．％琼脂
明 ，Ｌ Ｐ ４ Ｊ Ｓ －１ 菌株 与 多数 曲霉 属的 真 菌具 有 较 近的亲缘 ， 其中与米曲霉（ ｓｅ ｉ ｓｏｙ ａ） Ａ ｐｒ ｌ ｒ ｚｅ ｇｌ ｕ 的亲缘 关系 最近 ， 相似 性 为１ ０ 构成一 小分 ０ ％， 支， 结合 Ｂ ｏｏ 全 自动 微生物 鉴定仪 的鉴定结 ｉｌｇ 果 ， 确定 Ｊ Ｓ －１ 菌株 为 米 曲霉 。 可 ＬＰ ４
Ａ Ｐ Ｒ ｒ ｄ ｃ ： ２： ｎ ｍｅ Ｃ ｐ ｏ ｕ ｔ Ｇｅ ｏ ｏｆ Ｌ Ｐ ４． Ｊ Ｓ －１ Ｂ
Ｍｉ ｏ ｉｌｇ ， ｉ ｈ ｅ ｉ ｏ／ ］ Ｇ ａ ｃ ｂｏｏ ｙ Ｆ ｔ ｄｔ ｒＪ． ｒ ｆ ｉ Ｍｃ ｒｗ－
Ｈｉｌ ｌ Ｃｏ ｐａ ｅ ２ ｏ ｍ ｎｉｓ． ０ ２．
般 作 用 于 可 溶 性 淀 粉 、 链 淀 粉 、 元 等 直 糖
， ８ ｒ Ｎ 糖苷键。 根据 作用 的 方 式 可 分 为 ａ～淀 粉 酶 １ ３１ Ｓ Ｄ Ａ基 因序 列扩增 及序 列分析 （ Ｃ ． ． ． ） ｐ 淀粉 酶 （ Ｃ ． ． ． ） Ｅ ３ ２ １ １与 一 Ｅ ３ ２ １ ２。
２ ２ １ Ｓ Ｄ Ａ 的序列 测定和 系统发 育分析 ． ８ ｒ Ｎ 以Ｊ Ｓ －１ 基 因 组 为 模板 ， Ｃ ＬＰ ４ Ｐ Ｒ扩 增到 １Ｓ Ｄ Ａ特异性片 段， ８ｒ Ｎ 序列长 度约 １０ ｂ （ ５０ｐ 图 ｌ Ｂ 。 用Ｍｅ ａ ．软件进 行多重 序列比对并 － ） 利 ｇ ４０
ｏ ｘｙ ａ ｓ ａ ｔｖ ｔ ［】 Ａｎ ｌ ｔｃ ｌ ｆ ｌｎａ ｅ ｃｉ ｉｙ Ｊ ． ａ ｙ ｉ ａ
Ｂｉ ｈｅ ｉ ｔ ｙ， ９５ ２： ２７～ ｌ ｏｃ ｍ ｓ ｒ １ ９， １ ３２．
【１Ｐｒ ｓｏ ｔ Ｌ ， ｒｅ Ｊ Ｋｌｉ ＤＡ． ３ ｅｃ ｔ ． Ｍ Ｈａ ｌｙ Ｐ， ｅｎ
科教研 究
Ｃａｄａ （ ｌＨａ ｈ ｕｔ ｎｖ ｌ ｉＩｃ ｎａｎｅｄ ｎ — ｔ 儡 ａａ ｒ
产 淀 粉 酶 米 曲 霉 的 分 离 鉴 定 及 酶 促 动 力 学 分 析
郑 双 杰 刘 明 启 黄 卫 宏 汤 国 娇
（ 中国计 量学 院 生命科 学 学院食 品系 杭 州 ３ Ｏ ） １ １ Ｏ ８
绘 制 系统 发 育 树 （ —Ｂ） 进 化分 析 结 果 表 图ｌ 。
淀 粉 酶 为 内切 型淀 粉 酶 ， 从淀 粉分 子 的
基 ， ０ 培 养７ ｈ 取 约 １０ ｇ 丝体经液 氮冷 近 ３￣ Ｃ ２， ０ｒ 菌 ａ
内部随 机 切开 Ⅸ一 ， Ｎ 苷键 ， 淀 粉分 子迅 １４ 使 增 加 。ｐ ～淀 粉 酶 从 淀粉 分子 的 非 还 原 性 末
统 发育 树 。
本 。 研 究从 不 同 分 离 源 采 取 土 样 ， 淀粉 本 以
为 唯 一碳 源 ， 离 出 高 产 淀 粉 酶 的 菌 株 ， 分 对 其进行 鉴定 。
１ ４ 淀粉 酶 活性 测 定 及动 力学 常 数 ．
淀粉 酶 活 性 测 定 采 用ＤＮＳ法 ， 粉 酶 活 淀
静置 ２ 吸 取上 清 液 ， ｈ， 分别 稀 释到 １ ＿、 ０ ０ ’１ ～、
（ Ｓ 为 标 准 蛋 白 。 大 反应 速 度（ Ｂ Ａ） 最 Ｖｍａ ） ｘ、
米 氏常数（ Ｋｍ） 定 采用 双 倒 数 作 图法 。 测
３结 语
淀粉 酶具 有重 要的 工业 应用价 值 ， 通
２ 结 果 与 分 析
摘 要 ： 不 同分 离 源 采 取 土 样 多份 ，以淀 粉 为 唯 一 碳 源 筛选 到 Ｉ 淀 粉 酶 高 产 真 茵Ｊ Ｐ １ 通 过 茵 落 形 态 观 察 ， 理 生 化 指 标 试 验 和 从 株 ＬＳ － ４； 生 １ Ｓ ＤＮ ８ ｒ Ａ保 守 序 列 分 析 ， 鉴定 Ｊ Ｓ －１ 菌株 为束 曲 霉 。 淀 粉 酶 的Ｋｍ和 Ｖ ｘ 别 为 ５ ７ ｍｇ Ｌ和 ４ ． ｍｏ／ ｎ ＬＰ ４ 该 ． ｍａ 分 ． ／ｍ ２ １３ ｌ ｍｉ／ｍＬ。 关 键 词 ： 曲霉 淀 粉 酶 鉴 定 米 中图分 类号 ： ４ Ｇ６ 文献 标 识 码 ：Ａ 文章编 号 ： ７ －９ ９ （ ０ ０ ０ （） ０ １ ０ １ －７ ５ ２ １ ） ７ ａ－Ｏ ３ － １ ６３
ｍｏ ／ｍｉ ／ ｌ ｎ ｍＬ。
从 杭 州 康 师 傅 方 便 面 厂 区 ， 国 计 量 中 学 院 餐厅 污水 排 放 口， 山 一 面粉 加 工厂 ， 萧 杭州植物 园采取多份土 样， 记， 用。 标 备 １． 淀粉 酶 生产 菌 的分 离 及 菌落 形态 特 征 ２ 采 集 的土样 分别 溶解 到生 理盐 水 中 ，
１材 料 与 方 法
１． １样品采 集
所 需 的 酶 量 作 为 一 个 酶 括 力 单 位 。 白 质 速 度 （ ｍａ ） 别 为 ５ ７ ｍｇ ｍＬ Ｂ １ ３ 蛋 Ｖ ｘ分 ． ２ ／ ： ４ ． ￣
浓 度 的 测定 采 用Ｂｒ ｄ ｏ ｄ ， ａ ｆ ｒ 法 牛血 清 白： 蛋白
２． 产 淀粉 酶 菌株 的 筛 选及 形 态观 察 １
的 菌 株 ７ 株 ， 中细 菌 ７ 株 ， 菌８ 。 菌 ８ 其 ０ 真 株 真
过 筛 选 高 产 菌 种 ， 化 发 酵 条 件 来 提 高 淀 优
粉 酶 产 量 是 降 低 其 工 业 应 用 成本 的有 效 手
从 所 采 集 的土 样 中共 分 离 到 产 淀 粉 酶 段 。 曲 霉 Ｊ Ｐ一１ 为 本 实 验 室 从 杭 州 植 米 ＬＳ ４ 物 园 土 样 中 分 离 并 鉴 定 的 淀 粉 酶 高 产 菌 研 除 米 Ｊ Ｓ －１ 在 筛 选 平板 上 培 养 ７ ｈ， ＬＰ ４ ２ 经过 碘 液 株 。 究 发 现 ， 能 够 产 生 淀 粉 酶 外 ， 曲 状 真菌 ， 丝发 达多分 枝 ， 有隔菌丝（ 菌 为 图 和 木 聚 糖 酶 生 产 性 能 ， 备 作 为 酶 制 剂 生 具 １ Ａ） 在Ｐ Ａ固体 培 养基 上 培 养 １ ０ 菌落 产 菌 的 潜 能 。 一 ， Ｄ ２ ｈ，
淀 粉 酶 是水 解淀 粉 和 糖 原 的 酶 类总 称 ，
一
菌 落 至 液 体 培 养 基 中 培 养 ， 取 淀 粉 酶 活 直 径 可 达 ３ ｃ 质 地 疏 松 ， 为 白色 、 选 ～５ ｍ， 初 黄
性 最 高 的 菌 株 （ＬＳ Ｊ Ｐ－１ ） 进 一 步 鉴 定 。 ４作 色 、 为黄 褐色至淡 绿褐色 ， 不呈绿色 ， 后 但 反 面无 色 ； 养７ ｈ， 部 生 出分 生 孢 子 ， 培 ２ 全 呈
１ 涂 布于 筛 选平 板 上（ ０并 可溶 性 淀粉 １ Ｏ ， ． ｇ
（ ＮＨ４Ｓ ０．ｇ， ） Ｏ４ ２ ＫＨ２ ０．ｇ， Ｓ ‘Ｈ２ ２ ＰＯ４ ２ Ｍｇ Ｏ４７ Ｏ
０ ０ ｇ， ｐ ． ２ 调 Ｈ至 中性 ， 脂 ２． ｇ， 馏 水 染 色 产 生 的透 明 圈 直径 最大 ，Ｌ Ｐ ４ 琼 ０ 蒸 Ｊ Ｓ 一１ 为丝 霉 Ｉ Ｓ －ｌ 固 体 发 酵 也 具 有 良好 的淀 粉 酶 Ｌ Ｐ ４ １Ｏ Ｏ ｍＬ， 灭菌 ）分 别于 ３ ℃ ３ ℃培 养４ ｈ～ ， ０ ７ ８
图 １ Ｌ Ｐ １ 的菌 丝形态 （ 及 １ ＳＤ Ａ Ｐ Ｒ Ｊ Ｓ － ４ Ａ） ８ ｒＮ Ｃ 扩增 产物 （ ） Ｓ ｒ ｄ Ｄ Ａ ｍ ｒ ｒ １ Ｂ Ｍ： ｔ ｎ Ｎ ａ ｅ ； ａ ｋ
中 国科教创 新导刊
Ｃ ｉａ Ｅ ｕ ａ ｉｎ Ｉｎ ｖ ｔ ｎ Ｈ ｒ ｌ ｈｎ ｄ ｃ ｔ ｎ ｏ ａ ｉ ｅ ａｄ ｏ ｏ
一
￣ Ｊ Ｓ －１ 单 菌落 接种 于Ｐ Ａ 体 培养 ｇＬ Ｐ ４ Ｄ 液 冻后 碾磨 ， 采用氯 化苄 法提取 Ｊ Ｓ 一１基 因组 ＬＰ ４
Ｇ ＧＡＡＧＧ ＴＧ ＴＴＴ ＧＧ ＴＡ ＡＴＴ ＡＧ一３ ， ’反向引物
ＥＦ３： 一ＴＣＣＴ ＣＴＡＡＡＴＧＡ ＣＣＡＡ ＧＴＴ ＴＧ－ ５’
黄 绿 色 经 比 较 与 标 准 米 曲霉 菌 落 特 征 较 接
多种 微生物 都具 有 产淀粉 酶能 力 ， 其 关 键 在 于 高 产 菌种 的选 育以 及发 酵 条 件 的
优 化 ， 高 产 酶 性 能 ， 低 其 工 业 应 用 成 提 降
糖凝 胶 电泳检 测 ， 测序 。 所得 序列通 过］ ａ ｔ 将 Ｂ ｓ ｌ 与Ｇ ｎ ａ ｋ ｅ Ｂ ｎ 中核酸 数据进 行比对 分析 ， 建系 构
端 开 始 ， 解 相 间 隔 的 一１ ４ 苷 键 ， 次 水 ，糖 依
速降解 ， 去粘性 ， 失 同时 使 水 解 物 的 还 原 性 作 为 ＰＣＲ扩 增 的 模 板 。 向 引 物 ＥＦ４： ’ 正 ： ～ ５
切 下一 个 麦 芽糖 分 子 。 粉 酶 是 最早 实 现 工 淀
业 生 产并 且 迄今 用 途 最广 ， 量 最 大 的酶 制 产
９ ｈ； 取 经 碘 液 染 色 产 生 较 大 透 明 圈 的单 ６ 挑
参 考 文 献
【】Ｒａ ｉ Ｇ， ａｅｈ １ ｎ Ｐ ｒｓ Ｇ， ｒ ｐｉ ａ ，ｔ ａ ． Ｈａ ａ ｒｙ Ｍ ｅ １