转基因动物1
疯牛病与转基因动物研究(1)
疯牛病与转基因动物研究生命科学学院动物科学专业2011084611 张敏摘要：随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展, 人们对动物疫病的控制和预防越来越倾向于转基因技术。
近年来, 疯牛病在欧洲和美国的暴发与蔓延, 它是宿主自体朊蛋白的一种构象病, 不能进行免疫识别, 而对该病的发病机理的研究仍待深入, 目前人们对该病的预防仅限于防, 而不能治, 因此, 转基因动物的培育, 将会给此类疫病的防治带来福音。
关键字：疯牛病、转基因在进行动物传染病防治时, 我们采用多种方法,包括免疫接种、卫生管理和科学治疗等, 尽管许多科学方法对疾病的控制起到了一定作用,如动物试验、分子生物学研究和基础病理研究等, 但是许多传染病还是困扰着我们, 然而对于传染病的控制最好的途径就是选育良好的具有抗病能力的动物来阻止疾病的发生。
这就涉及到转基因动物的研究,需要人们进行深入的研究。
疯牛病一直是困扰人类的一种烈性传染病, 由朊病毒蛋白( Prion Protein , PrP) 引起的以潜伏期长、精神失常、共济失调、后肢瘫痪和狂暴不安的神经症状为特征的危害人类的传染病。
近期研究发现朊蛋白结构变化, 由α螺旋转化为β折叠而引发疯牛病, 而且人的克雅氏综合症、绵羊痒病等都是由朊病毒蛋白有关的疾病, 是动物传染性海绵样脑病( TSE) 中的一种,BSE首先于1986 年在英国发现, 随后波及欧洲许多国家和地区, 给英国和欧洲的养牛业造成了巨大损失。
近几年因BSE 的流行, 随着由同一致病因子PrP 引起人的变异型克雅氏症(vCJD) 的出现, 导致了全世界对疯牛病的恐慌, 它引起了大量的经济损失和危害人类健康, 越来越受到人类的关注。
从疯牛病的发生与发展来看,人类需要加大科学研究力度, 作好预防工作, 正因为疯牛病目前还不可治, 所以在最有效的措施应该作好品种选育工作, 如果进行转基因选育出具有抗PrPSC 构型转变基因的牛, 将会在很大程度上阻止疯牛病的发生, 目前在日本已经有过此类转基因牛的选育,获得了成功,从而提高了动物的抗病力, 为人类控制疾病带来福音。
遗传工程动物
▪ 2000年6月22日晚8时整，生物胚胎工程专家张 涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一 只雌性体细胞克隆山羊阳阳。
▪ 2001 年英国PPL 公司宣布获得世界首例转基因 克隆猪诞生。
• 通过PCR反应克隆目的基因
▪ 3、基因构建
现代转基因技术中的“基 因”不是仅仅是目的蛋白编码序列 (coding sequence)的DNA片断，而 是包括基因表达的一整套顺式作用 元件(cis-acting elements)。
▪ ① 、启动子（promotor）
启动子位于基因转录
起始位点上游不远处， 往往含有TATA框以及一 些短的调控序列，也有 一些启动子不含TATA框 而还有Inr序列。启动子 序列是构建转基因表达 载体时首先要具备的生 物元件。
▪ 组织特异性启动子(tissue-specific)
▪ 在动物体中，除了那些担负基本生命功能 的持家基因(House-keeping gene)以外， 绝大多数基因呈组织特异性表达。要使转 入的外源基因在特定的组织中表达，就要 使用组织特异性启动子。
得到组织特异性表达启动子
▪ 对大多数基因来讲， 我们还只能分离它近5’ 端的启动子。及近5’ 端和近3‘端的增强子， 有时还要将一个或几 个内含子包括在内， 即便如此，往往还是
2000年6月，张涌教授培育成功世界首批体细胞克隆山羊“元元”、“阳 阳”。图为利用体细胞克隆的山羊“阳阳”（左）和它的克隆体山羊。
▪ 2006.12.３头口、蹄及舌头呈现出绿色荧光的转基因克隆 小猪日前在东北农业大学顺利降生。这是中国培育出的首
转基因动物
1、转基因超级鼠：向生物体的基因组转移（或植入）外源基因的过程，叫转基因。
一般都认为，成功的转基因工作是从1981年开始的。
1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章，两个美国实验小组共同研制出转基因超级鼠。
2、转基因鲤鱼：中科院水生生物研究所鱼类转基因工程组的科学家们，在朱作言院士的领导下，将草鱼的生长激素基因注入鲤鱼的受精卵，培育出一种带有草鱼生长激素基因的转基因鲤鱼F1代和另一种具有草鱼生长激素基因的转基因三倍体鲤鱼“吉鲤”。
3、转基因山羊：中国首例转基因山羊“连连”、“田田”和“云云”于2000年12月25日精彩亮相，为外人所知。
它们的身上都转有人的od-抗胰蛋白酶基因。
它们产出的羊奶可以提取出al-抗胰蛋白酶。
4、转基因奶牛：它是一种转基因动物，是科学家通过转基因技术对奶牛胚胎进行基因改造，从而达到预期效果的奶牛品种。
转基因动物(Transgenic animals )
染色体较短，基因种类丰富，最活跃致病染色体（基 因密度在17、19、22号染色体上最高）。
其基因变异与免疫反应、精神分裂、心脏病、弱 智、白血病以及多种癌症相关。人体全部遗传密码图 谱绘制完毕，大量关于人类生长、发育、衰老、遗传 病变秘密随之揭开。
今后100年—200年生命科学奠定基础。随着对人 体致病基因展开全面搜索——了解各种基因功能及基 因之间相互作用。
Transgenic animals （转基因动物）
Clone animals (克隆动物)
博、硕士研究生
本次课所掌握内容
• 基因病的分类 • 基因在医学领域的用途 • 反求生物学 • 转基因动物及实施细则 • 转基因动物的应用 • 克隆动物的概念和技术过程
日本科学家培了一种新的基因改老鼠，它们不具备 感知危险气味的能力，对其“死对手”猫一点都不 觉得害怕，相反还大胆地在猫身上爬来爬去，甚至 依偎在猫身边。此研究发表《自然》杂志上。
这种鼠通过基因改造，失去其鼻腔特殊感受器， 是专门嗅知食物或捕食者气味的器官。科学家此做 是为更加了解嗅觉的机理。老鼠可以通过其它嗅觉 细胞来探知气味，可惜没有关键路线来触发大脑产 生恐惧感，当“死对手”猫或酸性化学物或其它凶 险化合物在场时，它们也不感到害怕。
为证实这一点，科学家将这种鼠放在猫身上，只见 它又闻又吻，还与猫玩耍起来。为进一步探测这些 老鼠对危险的感知能力，研究人员还将老鼠放在一 个能产生疼痛感的旋转平台上，还放些捕食动物如 雪豹和狐狸的尿液让它们闻，看老鼠是否害怕。结 果发现，这些老鼠开始小心翼翼，之后很好奇，没 有一点害怕的表现。
转基因动物关键技术
转基因动物关键技术
转基因动物技术是一种把外源基因或基因片段转入动物体内的古老技术，其关键技术主要有以下几项：
1.转基因技术的前期研究：包括外源基因的设计、合成、检测、表达调控等；
2.载体的构建：克隆基因片段、构建载体、载体的标记等；
3.转移基因：有不同的转基因方法，主要有腺病毒转移、质粒转移、细胞融合等；
4.遗传变异：了解转基因动物的基因组变化情况，建立有效的关系；
5.表达稳定性：确定外源基因的表达稳定性，进行表达水平的调控；
6.应用研究：利用转基因动物模型进行生物学、医学等研究，充分发挥转基因动物的功能。
转基因动物与动物生物反应器ppt课件
Gordon等首次成功地将含有HSV和SV40 DNA 片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精 卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序小 鼠。
1982年，Palmiter等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、 兔、牛等等大小动物。
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动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源 基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。
一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的 第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射 法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合 体动物。
当外源基因在转基因动物体内表达，并培育出其 表型与人类疾病症状相似的动物模型，则称其为 转基因动物模型。
目前, 已经培育出了动脉粥样硬化、镰刀形红细胞 贫血症、痴呆症、自身免疫病、淋巴系统病、真 皮炎及前列腺癌等多种疾病的模型动物,为这类疾 病的研究提供了方便。
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（3）动物品种改良
通过外源基因的导入，改造动物的基因组,可 达到使家畜、家禽的生长速度加快，肉、蛋或奶 产量及品质提高，饲料利用率提高、抗病力加强 的目的。 目前应用最广的是，通过此技术改变牛奶的品质 和成份。在我国已获得转人乳清白蛋白、人乳铁 蛋白等转基因牛奶，为我国的“人源化牛奶”产 业化定了重要的基础。
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转基因动物（transgenic animal）的概念
指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染 色体内，外源基因与动物基因整合后，随细胞的 分裂而扩增，在体内表达，并能稳定的遗传给后 代的动物。
即指基因组中整合有外源基因的一类动物。 整入动物基因组的外源基因被称为转基因
(transgene)。
类具有较多的相似性。 因而猪在提供人类移植所用的器官方面成为
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十大转基因动物
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本文概述：通过转基因技术，将其他动物的基因注入某种动物的DNA之内，各种神奇古怪的动物便纷纷涌现。
科学家创造出所谓的“转基因动物”来研究疾病治疗、制造自然物质和拓展科研领域。
那么十大转基因动物是什么呢？小编会告诉您答案。
科学家创造出所谓的“转基因动物”来研究疾病治疗、制造自然物质和拓展科研领域。
那么十大转基因动物是什么呢?动物转基因有害吗?小编会告诉您答案。
十大转基因动物是：荧光鼠、蜘蛛羊、抗癌老鼠、翡翠海参、荧光鱼、转基因蚊子、超级老鼠、产药的小鸡、无所畏惧的老鼠、有利于改善环境的基因猪。
下面我将转基因动物可能存在的危害分两个方面概括：1.转基因动物对人体的危害;2.转基因动物对生态环境的危害。
转基因动物对人体的危害包括以下四个方面：
一、毒性问题
基因化食品能产生不可预见的生物突变，会在食品中产生较高水平和新的毒素。
Losey,J.E.等报道，在一种植物马利筋叶片上撒有转基因Bt玉米花粉后，普累克西普斑蝶食用叶片就少，长得慢，4天的幼虫的死亡率44%。
而对照组(饲喂不撒。
转基因动物技术
优点：
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎 存活率高
缺点：
潜在的致癌性 载体构建较复杂 容纳大小有限 整合率不高 重组逆转录病毒不稳定，可能干扰外 源基因的表达 胚胎的自我保护机制对其有抗性
方式 显微注射法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过 体外培养建立起来的多潜能细胞系。
将携带有外源基因的ES细胞注入到 动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转 基因动物。
它本身是二倍体，能在体外培养， 具有高度的全能性，可以形成包括生殖 细胞在内的所有组织，并且在不同的培 养条件下表现出不同的功能状态。
在ES细胞上的基因操作：
许多转基因的表达水平受到宿主染 色体上整合位点的影响，往往出现异位 表达，影响转基因的表达能力，从而使 大部分转基因表达水平较低,极少部分表 达水平过高。
转基因动物技术在生物医学研究中的应用
1 在肿瘤学研究中的应用 1.1肿瘤转基因动物模型 1.2癌基因的研究 1.3肿瘤病因、发病机理研究 2 在免疫学中的研究应用 2.1免疫机制研究 2.2免疫相关疾病的研究 2.3异种移植中转基因动物技术的应用
Screening Strategies
Southerns, Induction/Loss of Restriction
sites, PCR RT-PCR 测定表达产物活性:ELISA,RIA
其成功率的高低主要取决于受精 卵和胚胎发育的时间。
基因的整合是随机的，多数插入 单一染色体位点中。外源基因的插入 会引起宿主基因的DNA序列重排，缺失， 重复或易位。
Retrieval of Blastocysts
转基因动物的技术方法
转基因动物的技术方法根据外源基因导入的方法和对象的不同，转基因动物的技术方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）法、电脉冲法、精子载体导入法等。
1、显微注射是最常用且成功率较高的方法。
基因显微注射法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达lOOkb（10万个碱基对）。
它可直接获得纯系，所以实验周期短。
但需要贵重精密仪器，技术操作难度大，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。
2、反转录病毒感染法该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。
由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响活性和稳定。
此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达。
3、胚胎干细胞法胚胎干细胞（ES细胞）指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育全能性，能进行体外培养；扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。
本法外源基因整合率高，植入囊胚前筛选合适的转化的ES细胞，克服了以前只能在子代选择的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是很有前途的技术。
缺点是不易建立ES细胞系。
并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。
4、电脉冲法电脉冲法（electroporation）又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜进入细胞，运送到细胞核。
5、精子导入法利用精子作为外源基因载体，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中，称之为精子载体导入法，是构建转基因动物的一种新尝试。
该法简单、方便，依靠生理受带过程，免去了对原核的损伤。
但在实践中成功率较低，对于精子是否可作为外源DNA 载体也存在争论。
转基因动物实例
转基因动物实例1，透明的金鱼鱼有许多不同的类型和种类，每一种鱼可能都有其独特之处，但只有极少数的鱼，通过自然进化，可以看到它们透明的形态。
在我们的印象中，金鱼是一种美丽而又神秘的生物，它拥有迷人的外形，鲜艳的色彩以及令人着迷的身体结构。
因此，人们对其进行着各种研究。
金鱼就是其中之一。
但这种鱼并没有将金鱼种类列入其中。
为此，日本科学家想到了制作金鱼透视的方法，并取得了成功。
日本三重大学和名古屋大学制作了这些透明金鱼。
肉眼观察，由于鳞片和皮肤没有色素，可以直接看到金鱼的心脏等器官。
2.环保猪从外在的角度看，猪为地球人类所做的肉类是吃得最多的，显得过于平凡，根本无法造成危害。
但事实上，猪并不是一个简单的生物个体，它也有一些特殊之处：例如，它们可以利用粪便来进行发电；而且它们还能通过排泄粪便中的某些物质来获得能量。
但是这种认识并不正确，特别是由于其体内存在一种潜在的危险化学物质——磷。
这种反应是猪消化食物后自然产生的，在排便后释放到世界各地。
如果植物中的营养成分过多，就会成为污染物，多余的就可能流入溪流和湖泊。
而如果这些营养物质被动物吸收后再用来喂养牲畜，那么就有可能导致严重的后果。
目前，人类面临着这样一个难题：如何让动物吃到更多营养丰富的食物呢？因此，科学家们不得不为这一问题而努力，而环保猪正是为此而培养起来的。
经过特殊培育后，环保猪排粪含磷量明显降低。
3，转基因荧光鱼转基因荧光鱼的产生并非偶然。
科学家们希望鱼能发出特殊色彩的光，并从种类角度出发，利用水母中提取的荧光蛋白使斑马鱼发光，于是转基因荧光鱼应运而生。
按照计划，它们的确闪烁着许多色彩。
比如蓝色、红色和黄色等等。
这些颜色看起来都非常可爱，而且很有创意，让人爱不释手。
这也是为什么很多人愿意购买一些颜色鲜艳的鱼的原因所在。
但是，这样的人类造物不适合在自然环境下生存，鲜艳的色彩使其更容易被掠食者杀死。
因为，这些东西是买给宠物的。
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4、“超级鼠” 1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生 长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组 小鼠2倍的“超级鼠”，首先证明外源基因可在受体中 表达，并且表达产物具有生物活性。
5、转基因家畜的产生
转基因家兔、绵羊和猪(Hammer等，1985)、牛 (Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相继出 世。
2 DNA注射 （1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过 的液体硅烷油或石蜡（厚约5mm）； （2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液， 以100l为单元的小滴数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而 定)； （3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入 培养液小滴中； （4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇 漂洗后，真空中干燥， 重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)， 使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml； （5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次 (1200rpm，10分钟)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口； （6）把待注射用的DNA装入注射管中；
（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分
开；待注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种； （10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。
A :准备注射的原核清 晰的卵母细胞 B:注射过程
C: 注射后的卵母细胞
D: 吸取基因注射液
体内接种
（1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌 鼠备用； （2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许 培养液，排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔 内成串)； 最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并 利于识别；
整合和毒性整合。
形式：单拷贝单一位点整合、多拷贝串联单一位点整合和多拷 贝R（TAIL-PCR）法等。
四 转基因动物的制备方法
受精卵显微注射法 胚胎干细胞（ES细胞）法
逆转录病毒感染法
体细胞核移植法
第四章 转基因动物
一、概念
转基因：
1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组 中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗 传的修饰，称之为转基因技术。
2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些 生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质， 使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质 等方面向人类需要的目标转变。
有厚8mm硅烷油或液体石蜡层(Fisher产，研究用)，硅烷油和
石蜡巳预先在5%CO2中置37℃1时做平衡处理，覆硅烷油或石 蜡层的目的是为防止培养液蒸发、散热和pH改变；
(5)向含卵团表玻皿的分离液中加5 l新制备的透明质 酸酶(透明质酸酶10mg／1ml分离液，Sigma产)，把 胚卵团消化分散开； (6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转 移入培养皿中，通过硅油层接种入任一培养液小滴中)， 以清除酶的继续作用； (7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和 摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)， 此时的卵己可用作 DNA注射之用。
显微注射转基因技术
（4）超声波法（sonoporation）：超声波增 强基因转染的主要机制是声波的空化效应导 致细胞的通透性增加，而通过添加超声造影 剂能够降低空化阈值，增强空化效应，促进 外源基因进入细胞，提高基因的转染效果。
化学方法
（5）磷酸钙—DNA共沉淀法：将外 源DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入 氯化钙后，DNA片段与磷酸钙共沉 淀并形成大颗粒，将此颗粒悬浮液 加入到贴壁培养的细胞中，外源 DNA就被靶细胞吸附，实现转基因。
（2）基因枪法：其基本原理是将要转染的外源DNA 吸附到高黏度的金属（钙或金粉颗粒）上，在一种 加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组 织内，达到转基因的目的。
（3）显微注射法：是在显微 镜操作系统的辅助下，通过 玻璃微管直接将外源DNA注 入哺乳动物的受精卵核内， 外源DNA随机整合到基因组 上。此法转入基因长度可达 数百kb；并能随机地整合在 受体细胞染色体DNA上，因 此应用范围广。但是这种整 合有时会导致转基因动物基 因组的重排、易位、缺失或 定点突变。
⑴载体DNA制备
ａ受精卵准备
⑵胚胎操作过程
ｂ显微注射 ｃ假孕母鼠准备(养母) ｄ胚胎移植
⑶对幼鼠鉴定
DNA显微注射法的基本程序
通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注
射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超 数排卵为35个；
与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵； 将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内 ； 将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ； 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ； 从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位
精子载体法
YAC法
4.1 受精卵显微注射
显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操
作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细
胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射
DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，
成为转基因动物。
这一方法的实验程序如下：
（3） 麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)； （4） 剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒； （5） 使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm； （6） 轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可 见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入输 卵管内；
电穿孔法 基因枪法 显微注射法 超声波法 磷酸钙—DNA共沉淀法 脂质载体包埋法 原生质体融合法
病毒介导的生物学方法
物理方法
（1）电穿孔法（电击法，electroporation）其基 本原理是在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改 变，细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一 定数量的外源DNA从细胞外进入到细胞质和细胞核 内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因的目 的。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的 基因转移。
这种方法是受二价金属离子能促进 细胞吸收外源DNA的启发而发展起 来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉 淀物的形式在时，细胞摄取DNA的 能力显著加强。但转移效率较低， 仅有1%~5%的外源DNA可以进入受 体细胞核中，大约仅有1%的DNA可 以在细胞中稳定表达。
磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术
（6）脂质载体包埋法： 将需要转移的外源DNA或
生物学方法
（8）病毒介导的方法： 将目的基因重组到逆 转录病毒载体上，制成高 滴度病毒颗粒，人为感染 着床前后的胚胎（也可直 接将胚胎与能释放逆转录 病毒的单层培养细胞共同 培养以达到感染目的), 获 得转基因动物的方法。
病毒介导的生物学方法
3.3 目的基因的基因组整合
类型：转基因可分为随机整合型基因和基因敲除（gene knockout）型载体基因。基因敲除（gene knockout）型载体 基因要设计与待剔除基因的同源性的载体基因。 效应：对于随机整合，因整合的位置不同，分有效整合、沉默
DNA显微注射
1 制备持卵管与注射针
持卵管制备：在火焰灯上将微玻璃管拉 成中间较细的约5~10cm长的一段，其 口径约80~120m，用玻璃刀将其在离
颈部2cm处切断，再把切口烧成如图形
状，口径约15 m。将尖部移近火焰喷 灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置，
使变成如图所示角度。
注射针的制备：由拉针器制成，针的口 径应低于1 m。
点；
子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达 。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 鼠的准备与要求
转基因鼠实验所用各类鼠
超排卵与取卵
1 超排卵
孕马血清（PMS）其有效成分为卵泡刺激素（FSH）。
人绒毛膜促性腺激素（hGG）
雌鼠的排卵时间：PM10.00~12.00 雄鼠的排精时间：PM10.00~12.00 受精一般发生在：AM1.00
6、利用转基因生产重组蛋白 1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵 羊的β-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵 羊的乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。目前，已有数十 种蛋白实现了转基因生产。 7、转YAC的转基因小鼠 近10年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YAC） DNA来产生转基因小鼠。
1. 采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因； 2. 通过mRNA合成cDNA； 3. 人工合成的DNA片段；
4. 聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。
目的基因的克隆
• 通过载体在适当的宿主中克隆
选择载体
目的基因与载体的连接
重组体导入受体细胞
• 通过PCR反应克隆目的基因
3.2 目的基因的转移
（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少 量培养液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵， 继之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部； （8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺 入胚卵细胞膜内(小鼠胚卵直径约10m)，进而继续进针再刺入任一原核内 （雄性原 核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞 内进行注射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进 行注射；注射细胞数量越多越好；
2 受精卵的收集
(1)检查阴栓：有白色阴栓的小鼠可用，引颈处死动物： (2)取输卵管：剖开腹腔，取出输卵管，置入含有3ml培养液的