过氧化氢酶活性测定

过氧化氢酶活性测定

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

紫外吸收法

一、原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与设备与试剂】

1、材料

小麦叶片等。

2、仪器设备

研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；

3、试剂

L 磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

L H2O2（用L高锰酸钾标定）。

【方法】

1.酶液提取：

称取新鲜小麦叶片或其它植物组织置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.酶活性测定

取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。

表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表

将S0号管在沸水浴煮1min 以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入 L 的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3.结果计算：

以每分钟A 240减少的酶量为1个酶活单位（U ）。

过氧化氢酶活性U/=W

t V V A S T ⨯⨯⨯⨯∆1.0240 ∆A 240= A S0－2

)(21S S A A + 式中 A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；

A S1, A S2—样品管吸光值；

Vt —粗酶提取液总体积（ml ）；

V 1—测定用粗酶液体积（ml ）；

FW —样品鲜重（g ）；

—A 240每下降为1个酶活单位（u ）；

t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。

【注】 所用H2O2溶液及KMnO 4一溶液临用前需重新标定。

【注意事项】

凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。

高锰酸钾滴定法

一、原理

过氧化氢酶（catalase ）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H 2O 2的量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料

小麦叶片

（二）仪器设备

1. 研钵；

2. 三角瓶；

3. 酸式滴定管；

4. 恒温水浴；

5. 容量瓶。

（三）试剂：

1. 10%H 2SO 4。

2. mol/L 磷酸缓冲液。

3. L 高锰酸钾标准液 取KMnO 4（AR ），用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，再用L 草酸溶液标定。

4. 取30%H 2O 2溶液，稀释至1000ml ，用标准L KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定。

5. L 草酸：称取优级纯 ，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。

三、实验步骤

（一）酶液提取

取小麦叶片加入的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

（二）取50ml 三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液，对照加煮死酶液，再加入 L H 2O 2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min ，立即加入10%。

（三）、用L KMnO 4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min 内不消失）为终点。

四、结果计算

酶活性用每g 鲜重样品1min 内分解H 2O 2的mg 数表示：

过氧化氢酶活性（mg/＝（A －B ）×t

W V V B A S T ⨯⨯⨯

-7.1)( 式中：A 对照KMnO 4滴定ml 数；B 酶反应后KMnO 4滴定ml 数；VT 提取酶液总量（ml ）；

VS 反应时所用酶液量（ml ）；W 样品鲜重（g ）；t 反应时间（min ）；

为L KMnO 41ml 相当于。