γ-干扰素体外释放试验43页PPT
基因工程药物——干扰素的制备PPT课件
病毒的克星——干扰素！
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
动物无限细胞系培养生产工艺： 上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：细胞培养，分泌表达 缺点：产量低，成本高,过程严格
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
我们生活的环境是被微生物包围着的，时时刻刻都要接触到许多 微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科学家猜测，人的血液细 胞里本身就存在干扰素。后来研究证明，这种猜测是有道理的， 通过精密的血液分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。 人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜，干扰素在 血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干扰 素，这种生产方式产量低得可怜，自然价格也就十分昂贵。治疗 一个病人的费用高达几万美元，一般百姓只能望“药”兴叹，是 名副其实的“贵族药”，干扰素无法得到普及、推广。 既然蛋白质是干扰素的本质，那么把制造成这种蛋白质的遗 传基因找出来，转入大肠杆菌体内，让它们代劳进行大量生产， 也许能行。经过科学家的试验，干扰素的批量生产便成为可能。 1980年，终于实现了干扰素的批量生产，这是美国科学家的杰作， 他们利用DNA重组技术构建了生产干扰素的基因工程。 如今，运用基因工程技术的国家有：美国、日本、法国、比 利时、德国、英国以及中国等。通过DNA重组、大肠杆菌发酵等方 法，大量获取各种干扰素。经过试验明，这样制得的干扰素对乙 型肝炎、狂犬病、呼吸道发炎、脑炎等多种传染病的病毒都有一 定疗效。干扰素能减缓癌细胞的生长，是很有希望的防癌治癌药 物，具有非常诱人的前影。
干扰素生产工艺(共45张PPT)
第二十八页，共45页。
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
第二十九页，共45页。
4 干扰素的别离纯化工艺过程
4.1、干扰素别离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程
第十页，共45页。
免疫调节活性机制
对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
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〔4〕初级别离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
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4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装
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1.5.干扰素生产工艺路线〔1〕
γ干扰素释放试验标准操作流程
γ干扰素释放试验标准操作流程γ干扰素释放试验标准操作流程概述•γ干扰素释放试验（gamma interferon release assay）是一种用于检测某些感染病原体引起的细胞免疫反应的方法。
•本文将详细说明γ干扰素释放试验的标准操作流程，包括前期准备、实验步骤、数据分析等内容。
前期准备1.确保实验室拥有所需设备和试剂。
2.准备受试者血样（采用血液抽取方法）。
3.验证实验室的操作人员已经接受相关培训，熟悉操作步骤和安全注意事项。
实验步骤1.血样准备–将采集的血样转移到合适的试验管中，确保血样完整且无凝块。
–使用离心机离心血样，将血细胞和血浆分离开来。
2.细胞培养–取得合适的细胞培养板，加入培养基。
–将离心后的血细胞加入培养基中，控制细胞密度在合适范围内。
–孵育细胞，保持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3.刺激试剂添加–在培养的细胞上加入激发剂，如特定抗原。
–同时设置阴性对照（如未加刺激剂的细胞）和阳性对照（如已知患者血样）。
4.孵育试验–将细胞培养板放入恒温箱中，保持合适的孵育时间和条件。
–注意观察培养过程中的任何异常变化，记录相关信息。
5.液相检测–采用合适的方法（如ELISA等）检测培养液中的γ干扰素水平。
–按照厂家指南操作试剂盒，记录结果并进行质量控制的数据分析。
1.收集所有实验数据，包括阳性对照、阴性对照和受试者样本的γ干扰素水平测定结果。
2.进行质量控制分析–首先，检查实验数据是否符合预期的范围。
–其次，对比阳性对照和阴性对照的水平，确保实验结果可靠。
3.数据解释–根据实验结果判定受试者是否对特定抗原产生γ干扰素反应。
–结合临床资料和相关标准，进行结果的解读和诊断。
结论•本文提供了γ干扰素释放试验标准操作流程的详细说明，以帮助实验室完成该项实验。
•严格按照操作流程进行实验可提高实验的可重复性和结果的准确性。
•数据分析部分应根据实验目的和临床背景进行合理解读，以辅助疾病的诊断和研究。
乙肝指南中干扰素应用ppt课件
12 24 36 48 60 72 84 月
IFN治疗获得HBeAg 清除 IFN治疗未获得HBeAg清除
*According to the proportional hazards model
-
26
Niederau et al. N Eng J Med 1996
HBeAg转换 HBsAg消失/血清转换
antiviral state
antiviral state
antiviral state
-
20
干扰素的作用机制
转录 翻译
抑制蛋白糖基化
糖基转移酶
抑制病毒成熟
-
21
HBV感染的免疫应答和干扰素的作用
直接抗病毒作用
• 诱导2‘,5‘-寡聚腺苷合成酶 • 激活核酸内切酶 • 提高蛋白酶活性
干扰素α
NK/NKT
-
17
IFN作用于RNA水平 可使HBeAg和HBV DNA同时阴转
在病毒聚合酶的作 用下, 前基因组 RNA转换为部分ds
DNA
HBV 病毒体
部分dsDNA
细胞质
就会
负链 DNA 包裹了
前基因组的 mRNA
亚病毒颗粒
内质网
HBsAg HBcAg
HBeAg
IFN
cccDNA
mRNA
细胞核
肝细胞
前核心蛋白/核心蛋白
1992
Landmark study: antiviral therapy slows disease progression in CHB4
1998
2003 2005 2006 2008
2004
2007
Interferons approved for CHB treatment1
γ干扰素释放试验指南
γ干扰素释放试验在中国应用的建议γ—干扰素释放试验（interferon—γ release assays，IGRAs)是检测结核分枝杆菌(MTB）特异性抗原刺激T 细胞产生的γ—干扰素，以判断是否存在MTB 的感染。
IGRAs 可弥补PPD 试验的不足，目前多个国家已将其用于诊断MTB 潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI），我国部分医院也已常规开展此项检测，且多家IGRAs 试剂已经或即将进入临床应用。
LTBI 是宿主感染MTB 后的一种特殊状态，感染者体内的MTB 处于持留状态，不能诊断为活动性结核病,但具有发展为活动性结核病的风险.对LTBI 的高危人群进行早期诊断和适当干预，在结核病控制中具有积极意义.PPD 试验作为诊断MTB 感染的传统方法，具有操作简便、成本低廉的特点，至今仍广泛使用，但该方法使用的PPD 抗原成分复杂，易受卡介苗接种和非结核分枝杆菌(nontuberculosismycobacterium，NTM）的影响，特异度较低，且对人免疫缺陷病毒（HIV）感染及重症疾病患者等免疫功能受损人群的敏感度不足。
研究结果提示，IGRAs 诊断MTB 感染的特异度高于PPD 试验，但也有文献报道,特别是在中、低收入国家，IGRAs 与PPD 试验相比并没有足够的优势。
IGRAs 技术要求高，操作程序复杂，样本检测时限短,难以实现高通量，价格昂贵。
由于缺乏严谨、大规模和前瞻性的人群研究数据,故IGRAs 的应用范围及结果解读存在较大争议。
为了指导IGRAs 在我国的合理应用,中华医学会结核病学分会与《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织有关专家经过长时间的反复研讨,在借鉴世界卫生组织（WHO）关于中低收入国家IGRAs 应用说明的基础上,结合我国IGRAs 应用现状，提出以下建议。
一、IGRAs 简介但在实际使用中发现，IGRAs 在不同地区、不同人群中的特异度和敏感度均存在较大差异，在某些人群中并未显示其敏感度和特异度优于PPD 试验。
干扰素综述ppt课件
Company
已经批准上市的抗菌肽产品
Peptide
Clinical indication
Stage of development
Magainin Pharmaceuticals
MSI-78(αhelical)
Impetigo
Abandoned after phase Ⅲ (1997)
MSI-78
cecropinA蛋白1-12AA的两亲性螺旋轮
在这里我们可以看到V、 M、I、L等疏水性氨基 酸在螺旋的一侧，K、 R分布于螺旋的另一侧， 具有较好的两亲性。这 为抗菌肽的优化改造提 供了理论参考和分析平 台
抗菌肽的来源
▪ 天然资源提取 ▪ 固相合成 ▪ 基因工程生产
成本高、得率低、工序繁琐
相当昂贵，难于应用于实际
试剂盒组成
▪ ELISA板条。 ▪ 20×洗涤液（W） 。 ▪ 20×血清稀释液（D） 。 ▪ 酶标二抗反应液（E） 。 ▪ 显色液（A） 。 ▪ 双氧水（H2O2） 。 ▪ 2 mol/L硫酸终止液（S） 。 ▪ PRRSV标准阳性血清（P） 。 ▪ PRRSV标准阴性血清（N）。
使用步骤
▪ 用蒸馏水依次将W液和D液稀释好后备用。 ▪ 用D液将待检血清1：40稀释后依次加入96孔ELISA板条1~93孔，每孔
100mL 。 ▪ 在最后3孔依次加入P、N和D各100mL 。 ▪ 37℃孵育1小时。 ▪ 洗板：每孔加入300mL W液，静置5分钟后弃去。再重复3次后板条在吸水
纸上拍干。 ▪ ELISA板上1~95孔各加入E液100mL，第96孔加D液100mL ▪ 37℃孵育1小时。 ▪ 洗板：每孔加入300mL W液，静置5分钟后弃去。再重复3次后板条在吸水
病毒的干扰现象和干扰素.pptx
干扰素的实践意义
➢ 干扰素的实践意义
在接种疫苗时，应减小或避免干扰现象对免疫效 果的影响。（注意间隔时间）
干扰素的临床应用（兽医）：可用于某些病毒病 的预防和治疗。
执兽真题
1、成纤维细胞分泌的具有直接抗病毒作用 的细胞因子是（ ）。 2017年真题
抑制生 物合成
刺激正常细胞产 生抗病毒蛋白， 从而抑制病毒的 生物合成
干扰素抗病毒对机体
的意义
干扰素
抗病毒蛋白 激活干扰基素因活化
基因
早期抗病毒
病毒诱导细胞产生干扰素
具有种属特异性
干扰素的作用机制
干扰素的作用机制不像抗病毒那样直接灭活病毒。干扰 素对病毒本身没有作用，既不能直接阻止其吸附或穿入，也 不能阻断释放，而是作用于宿主细胞，使其产生抗病毒蛋白 质，这种蛋白质附于细胞的核蛋白体上，选择性地抑制病毒 mRNA翻译为病毒蛋白质，从而影响病毒结构蛋白和酶类的 合成，使复制受到抑制而呈现出抗病毒作用。
干扰现象和干扰素
病毒的干扰现象
干扰现象的概念：
当两种病毒感染同一种细胞时，可发生一种病毒抑制 另一种病毒复制的现象，称为病毒的干扰现象。前者称为 干扰病毒，后者称为被干扰病毒。
干扰现象的类型
➢ 异种干扰：最常见 ➢ 同种干扰：不同型、珠 ➢ 自身干扰：复制
病毒的干扰现象
干扰现象发生的原因
➢ 占据或破坏宿主细胞受体：两种病毒都需要细胞表面上同 一受体，一种病毒感染后，另一种病毒就不能感染，常见 于自身干扰。
Thank you！
➢ 争夺酶系统、生物合成原料及场所 ➢ 干扰素的产生：某个细胞受病毒干扰后，可产生干扰素，
内科学_各论_疾病：小儿干扰素-γ受体缺陷病_课件模板
内科学疾病部分：小儿干扰素-γ受体缺陷病>>>
病因： 制发生障碍，因而发生严重的NTM感染或 播散性BCG。
内科学疾病部分：小儿干扰素-γ受体缺陷病>>>
症状及病史：
小儿干扰素-γ受体缺陷病症状_小儿干扰 素-γ受体缺陷病有什么症状
若出生1月时接种BCG，则3月时可发 生播散性BCG;分枝杆菌自然感染的发病年 龄为生后2个月～3岁。也可发生毒性低的 非伤寒沙门菌属感染。临床表现为发热、 盗汗、淋巴结肿大、肝脾肿大。感染可扩 散到全身，包括皮肤、软
内科学疾病部分：小儿干扰素-γ受体缺陷病>>>
症状及病史：
组织、骨髓和脑膜。接种BCG所致者，开 始时为附近淋巴结肿大和溃疡，继之发生 全身性扩散，与自然非结核分枝杆菌感染 过程相似。多数患儿于数年内死亡。
患儿对病毒感染的敏感性并不增高。 其他表现为过敏体质和哮喘，免疫复合物 性肾小球肾炎和血管炎。
谢谢！
西医治疗 应尽可能避免接触结核、伤寒等细胞 内感染的病人。禁用冻干卡介苗（BCG）， 但可接种其他疫苗。应预防性给予抗分枝 杆菌药物。一旦发病，治疗原则为至少4 种敏感的抗分枝杆菌药物同时使用。原则 上宜进行终身
内科学疾病部分：小儿干扰素-γቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ体缺陷病>>>
治疗：
治疗。IFN-γ治疗的效果不肯定，其他细 胞因子如IL-12、IL-18和IFN-α也可试用 于抗分枝杆菌药物治疗无效的病例。
内科学疾病部分：小儿干扰素-γ受体缺陷病>>>
诊断：
小儿干扰素-γ受体缺陷病鉴别诊断_如何 诊断小儿干扰素-γ受体缺陷病
诊断 自然NTM感染的病例，临床表现相似 于一般炎症性疾病，反复分枝杆菌培养结 果常为阴性，病变组织学检查为非特异性， 结核菌素或NTM皮肤试验结果不一，因而 诊断极为困难。凡不明原因的发热、肝脾 及淋巴结肿大者