γ干扰素释放试验指南
r干扰素释放试验检测方法培训-2015.11.27
第四步：计数细胞
• 计算公式：
需要的细胞悬液量(ml)=每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000)×需要使用 的细胞稀释液量 (ml)/ 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)。
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
阳性抗原PHA
抗体、显色液
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用） 1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌 双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌） 细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液 台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
尿沉渣板进行 死细胞不能区分 血细胞计数时应该 计数 用0.4%台酚蓝进行 活细胞的染色 3ml淋巴细胞 PBMCs层分离不 分离液,全血 好 进行1:11640 稀释后注入 3ml淋巴细胞分离 液,全血进行 1:11640 稀释后注入 洗板后加显色液
步骤
加入淋巴细胞分离 液的量在6ml,而且 直接将全血注到淋 巴细胞分离液液面
γ-干扰素释放试验（T-SPOT.TB方法）
技术培训
培训内容
T-SPOT.TB 技术原理
1
2 3 4
T-SPOT.TB 检测试剂、组份
T-SPOT.TB技术操作流程（SOP） T-SPOT.TB操作常见问题
γ-干扰素释放试验（IGRAs）
两种IGRAs用于商业诊断：
T-SPOT®.TB
(ELISPOT-based IGRA) Gold (ELISA-based IGRA)
γ干扰素释放实验的原理
γ干扰素释放实验的原理γ干扰素（Interferon gamma，IFN-γ）是一种由免疫细胞产生的重要分子信号物质，对机体的免疫反应起着重要的调节作用。
γ干扰素释放实验是一种评估机体免疫功能的常用方法之一，可以检测特定细胞（通常是T细胞）对某种刺激物质引起的γ干扰素分泌反应。
γ干扰素释放实验的原理主要涉及以下几个方面：1. 细胞样本的准备：γ干扰素释放实验通常使用外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）或组织细胞作为细胞样本。
这些细胞样本可以通过静脉采集外周血或组织活检等方式获取。
在实验前，需要对细胞进行处理，如离心、洗涤和培养，以确保细胞的状态良好并有足够的数量。
2. 刺激物质的选择：γ干扰素释放实验中常用的刺激物质主要包括抗原、药物或其他具有免疫刺激性的物质。
抗原可以是病原体的特异性成分，如细菌、病毒或其他微生物产生的蛋白质或多肽。
药物刺激物可以是某些药物对机体免疫系统的直接或间接作用引起的免疫反应。
刺激物质的选择应该与样本来源和实验目的相匹配。
3. 实验方法的选择：γ干扰素释放实验可以通过多种方法进行，如ELISA（酶联免疫吸附测定法），ELISPOT（酶联免疫斑点法），流式细胞术等。
这些方法的选择取决于实验的需要和可用设备的条件。
比较常用的方法是ELISPOT法，该方法可以评估单个细胞生产γ干扰素的能力，形成的斑点数量与细胞产生的γ干扰素水平成正比。
4. 数据分析：γ干扰素释放实验得到的数据需要进行合理的分析和解释。
通常，根据刺激物质和实验目的的不同，可以采用差异分析、统计学方法等对数据进行处理。
数据的分析和解释可以为研究者提供了解细胞免疫功能的信息。
通过γ干扰素释放实验，我们可以了解机体对刺激物质的免疫反应程度和免疫调节功能。
这对于疾病的诊断、药物研发和免疫治疗等方面具有重要意义。
总结回顾：γ干扰素释放实验是一种评估机体免疫功能的方法，通过检测特定细胞对刺激物质引起的γ干扰素分泌反应来评估免疫反应的程度和调节能力。
《结核菌素皮肤试验-y干扰素释放试验两步法的操作技术规范》解读
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家规范和标准的基础上!共同编制了'结核菌素皮肤 性肺结核患者有密切接触的9岁以下儿童!H"H硬
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γ干扰素释放实验的原理
γ干扰素释放实验的原理γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）是一种重要的细胞因子，是T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和淋巴细胞等免疫细胞产生的，对免疫应答和抗病毒、抗肿瘤等方面具有重要的生物学功能。
γ干扰素的释放实验可以用来检测患者免疫系统的功能状态，也可以用来评价特定病原体感染、免疫细胞功能、自身免疫疾病等的发生发展和治疗反应。
1. 细胞治疗法的原理：γ干扰素释放实验主要是通过采集患者的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs），然后经过体外培养处理，刺激其释放γ干扰素。
在培养过程中，添加特定的激活剂（如病毒、细菌成分或特定抗原）刺激PBMCs。
刺激后，PBMCs 中的T细胞被激活并释放γ干扰素。
通过检测细胞培养液中γ干扰素的浓度，可以间接反映患者免疫系统对刺激剂的反应能力。
2.γ干扰素的检测原理：γ干扰素的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、流式细胞术和放射免疫测定法（RIA）等。
其中，ELISA是最常用的检测方法。
ELISA方法利用特异性抗体对γ干扰素进行捕获和检测，可以测定培养液中γ干扰素的浓度。
流式细胞术可以利用荧光修饰的特异性抗体直接检测PBMCs中γ干扰素的表达；RIA方法则利用放射性同位素标记的特异性抗体鉴定γ干扰素。
3.激活剂的选择：γ干扰素释放实验中的激活剂选择对实验结果至关重要。
常用的激活剂包括病毒成分（如病毒感染的细胞裂解液）、特定抗原（如结核分枝杆菌抗原）、细菌成分（如脂多糖）等。
选择合适的激活剂可以最大程度地激活免疫细胞，并促使其释放γ干扰素。
4. 结果判读：γ干扰素的释放实验结果一般用γ干扰素的水平来表示，通常以累积浓度（pg/mL）作为评估指标。
通过对照组（如正常人群）和患者组进行对比，可以评估患者的免疫功能状态。
比如，如果患者的γ干扰素水平显著低于正常人群，可以提示免疫功能受损；而如果γ干扰素水平显著高于正常人群，则可能存在其中一种免疫反应异常。
γ干扰素释放试验标准操作流程
γ干扰素释放试验标准操作流程γ干扰素释放试验标准操作流程概述•γ干扰素释放试验（gamma interferon release assay）是一种用于检测某些感染病原体引起的细胞免疫反应的方法。
•本文将详细说明γ干扰素释放试验的标准操作流程，包括前期准备、实验步骤、数据分析等内容。
前期准备1.确保实验室拥有所需设备和试剂。
2.准备受试者血样（采用血液抽取方法）。
3.验证实验室的操作人员已经接受相关培训，熟悉操作步骤和安全注意事项。
实验步骤1.血样准备–将采集的血样转移到合适的试验管中，确保血样完整且无凝块。
–使用离心机离心血样，将血细胞和血浆分离开来。
2.细胞培养–取得合适的细胞培养板，加入培养基。
–将离心后的血细胞加入培养基中，控制细胞密度在合适范围内。
–孵育细胞，保持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3.刺激试剂添加–在培养的细胞上加入激发剂，如特定抗原。
–同时设置阴性对照（如未加刺激剂的细胞）和阳性对照（如已知患者血样）。
4.孵育试验–将细胞培养板放入恒温箱中，保持合适的孵育时间和条件。
–注意观察培养过程中的任何异常变化，记录相关信息。
5.液相检测–采用合适的方法（如ELISA等）检测培养液中的γ干扰素水平。
–按照厂家指南操作试剂盒，记录结果并进行质量控制的数据分析。
1.收集所有实验数据，包括阳性对照、阴性对照和受试者样本的γ干扰素水平测定结果。
2.进行质量控制分析–首先，检查实验数据是否符合预期的范围。
–其次，对比阳性对照和阴性对照的水平，确保实验结果可靠。
3.数据解释–根据实验结果判定受试者是否对特定抗原产生γ干扰素反应。
–结合临床资料和相关标准，进行结果的解读和诊断。
结论•本文提供了γ干扰素释放试验标准操作流程的详细说明，以帮助实验室完成该项实验。
•严格按照操作流程进行实验可提高实验的可重复性和结果的准确性。
•数据分析部分应根据实验目的和临床背景进行合理解读，以辅助疾病的诊断和研究。
牛γ-干扰素ELISA试验操作规程 2-百度
牛结核γ-干扰素ELISA试验操作规程SOP序号：REAL-011编制人员：曹瑞青岛瑞尔生物技术有限公司2014-01-01牛结核γ-干扰素ELISA试验操作规程1.简介1.1适用范围本试验用于检测牛全血培养上清中的牛γ-干扰素，根据检测牛PPD、禽PPD 和PBS刺激全血后上清中γ-干扰素量的不同，从而判断牛结核的感染情况。
1.2试验背景牛γ-干扰素试验是以刺激培养全血为基础，检测牛结核病的一种试验方法。
通常，感染分支杆菌的牛，其血液中的淋巴细胞能识别特异的分支杆菌抗原（包括结核菌素PPD），淋巴细胞识别分支杆菌抗原的过程涉及细胞因子的产生和释放，γ-干扰素就是其中最重要的一种。
用结核菌素(PPD)刺激培养牛全血，全血中的T淋巴细胞就会识别PPD，发生细胞免疫反应，其中一个直接的表现就是产生并释放γ-干扰素。
γ-干扰素可用γ-干扰素特异的单克隆抗体夹心法检测。
其它资料背景参考《牛γ-干扰素ELISA检测试剂盒》的说明书。
2.安全性2.1所有操作步骤都应符合当地的“危险物质控制规范”2.2此试验存在一定风险，尽管风险比较小。
阳性反应的上清中可能会含有分支杆菌，因此所有操作步骤都应遵循下面的操作规程。
3.材料3.1试剂牛γ-干扰素ELISA检测试剂盒(青岛瑞尔生物技术有限公司提供)，灭菌的去离子水（溶解试剂盒内物质）。
3.2试验耗材1ml与200µl吸头（无菌）、生物安全口罩、高压灭菌袋、乳胶手套、消毒剂、记号笔、吸水纸、便签纸。
3.3仪器设备酶标仪（含450nm）、单道移液器（0-1000µl，0-200µl）、8-12多道移液器、移液槽、振荡器、计时器。
4.操作程序4.1试剂准备4.1.1ELISA板未开封前，在室温平衡至少1小时。
4.1.2阴阳性对照用无菌蒸馏水或去离子水溶解，确保完全溶解，溶解后的阴阳性对照可在2-8°C保存3个月。
使用前恢复至室温，并充分混匀。
γ干扰素释放试验指南
γ干扰素释放试验在中国应用的建议γ—干扰素释放试验（interferon—γ release assays，IGRAs)是检测结核分枝杆菌(MTB）特异性抗原刺激T 细胞产生的γ—干扰素，以判断是否存在MTB 的感染。
IGRAs 可弥补PPD 试验的不足，目前多个国家已将其用于诊断MTB 潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI），我国部分医院也已常规开展此项检测，且多家IGRAs 试剂已经或即将进入临床应用。
LTBI 是宿主感染MTB 后的一种特殊状态，感染者体内的MTB 处于持留状态，不能诊断为活动性结核病,但具有发展为活动性结核病的风险.对LTBI 的高危人群进行早期诊断和适当干预，在结核病控制中具有积极意义.PPD 试验作为诊断MTB 感染的传统方法，具有操作简便、成本低廉的特点，至今仍广泛使用，但该方法使用的PPD 抗原成分复杂，易受卡介苗接种和非结核分枝杆菌(nontuberculosismycobacterium，NTM）的影响，特异度较低，且对人免疫缺陷病毒（HIV）感染及重症疾病患者等免疫功能受损人群的敏感度不足。
研究结果提示，IGRAs 诊断MTB 感染的特异度高于PPD 试验，但也有文献报道,特别是在中、低收入国家，IGRAs 与PPD 试验相比并没有足够的优势。
IGRAs 技术要求高，操作程序复杂，样本检测时限短,难以实现高通量，价格昂贵。
由于缺乏严谨、大规模和前瞻性的人群研究数据,故IGRAs 的应用范围及结果解读存在较大争议。
为了指导IGRAs 在我国的合理应用,中华医学会结核病学分会与《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织有关专家经过长时间的反复研讨,在借鉴世界卫生组织（WHO）关于中低收入国家IGRAs 应用说明的基础上,结合我国IGRAs 应用现状，提出以下建议。
一、IGRAs 简介但在实际使用中发现，IGRAs 在不同地区、不同人群中的特异度和敏感度均存在较大差异，在某些人群中并未显示其敏感度和特异度优于PPD 试验。
r干扰素释放试验检测方法培训PPT精选文档
AID
20
T-SPOT.TB 结果判读
A B C D
< 10 斑点相减
> 20
通常正常结果，空白对照孔没有或很少斑点（<10个），阳性质控对照孔斑点数 >20个。
21
T-SPOT.TB 结果判读
N孔斑点数 >10 ≤5
6≤N≤10
P孔斑点数 任何值 ≥20 ≤19 ≥20 ≤19
T孔-N孔斑点数 任何值
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
6
IGRA中特异结核抗原
结核杆菌RD区特异抗原：
• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原
• CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10) Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
8
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用）
1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌
双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌）
细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液
台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
16
第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
25万个细胞/孔 （100ul）
细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜）
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。