干扰素释放试验
干扰素释放试验(共28张PPT)
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
30
IGRAs的结核特异免疫抗原
• SAT-6和CFP一10主要存在于MTB复合群，而在卡介苗和大多数 NTM中缺失，因此IGRAs的特异度较好。
• 但ESAT-6和CFP—10也存在于少数几种NTM中，如堪萨斯分枝杆
菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和胃分枝杆，
IGRAs可发挥其辅助作用
• 应用于活动性结核病的辅助诊断
• 应用于LTBI诊断中
IGRAs用于体液或组织标本？
近几年来国内有IGRAs(仅限于ELISPOT方法)辅助诊断结核性胸膜 炎和结核性腹膜炎等肺外结核的报道，其中采用胸腔积液和 腹水等体液或组织标本检测的IGRAs的敏感度和特异度高达
90％以上，采用血液标本检测时IGRAs则并未显示出优势。 此类研究报道数量不多，病例数也不足，
筛查LTBI。
• 除HIV感染者外，类风湿关节炎等自身免疫性疾病、器官移植等免疫功能受 损患者及糖尿病等特殊患者，因其自身原因，或接受糖皮质激素或肿瘤坏死 因子 TNF拮抗剂等免疫抑制药物治疗导致免疫功能缺陷，这类患者是LTBI发 展为结核病的高风险人群，对这类患者也有必要进行LTBI筛查。
应行IGRAs和PPD检测的6种情况（WHO 2015）
阳性者进一步采用IGRAs帮助确认；
(2)不宜采用IGRAs对大范围人群进行LTBI筛查；
(3)PPD试验仍是在健康人群中动态筛查LTBI的首选。
• (1)对HIV感染人群进行LTBI筛查，单用PPD试验的敏感度不高，
应单用IGRAs或联合使用PPD试验，在方法选择上优先考虑细胞
检测技术。
• (2)自身免疫性疾病和器官移植患者在接受糖皮质激素或 TNF-拮抗剂治疗前，应单用IGRAs或联合使用PPD试验
r干扰素释放试验检测方法培训-2015.11.27
第四步：计数细胞
• 计算公式：
需要的细胞悬液量(ml)=每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000)×需要使用 的细胞稀释液量 (ml)/ 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)。
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
阳性抗原PHA
抗体、显色液
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用） 1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌 双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌） 细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液 台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
尿沉渣板进行 死细胞不能区分 血细胞计数时应该 计数 用0.4%台酚蓝进行 活细胞的染色 3ml淋巴细胞 PBMCs层分离不 分离液,全血 好 进行1:11640 稀释后注入 3ml淋巴细胞分离 液,全血进行 1:11640 稀释后注入 洗板后加显色液
步骤
加入淋巴细胞分离 液的量在6ml,而且 直接将全血注到淋 巴细胞分离液液面
γ-干扰素释放试验（T-SPOT.TB方法）
技术培训
培训内容
T-SPOT.TB 技术原理
1
2 3 4
T-SPOT.TB 检测试剂、组份
T-SPOT.TB技术操作流程（SOP） T-SPOT.TB操作常见问题
γ-干扰素释放试验（IGRAs）
两种IGRAs用于商业诊断：
T-SPOT®.TB
(ELISPOT-based IGRA) Gold (ELISA-based IGRA)
γ干扰素释放实验的原理
γ干扰素释放实验的原理γ干扰素（Interferon gamma，IFN-γ）是一种由免疫细胞产生的重要分子信号物质，对机体的免疫反应起着重要的调节作用。
γ干扰素释放实验是一种评估机体免疫功能的常用方法之一，可以检测特定细胞（通常是T细胞）对某种刺激物质引起的γ干扰素分泌反应。
γ干扰素释放实验的原理主要涉及以下几个方面：1. 细胞样本的准备：γ干扰素释放实验通常使用外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）或组织细胞作为细胞样本。
这些细胞样本可以通过静脉采集外周血或组织活检等方式获取。
在实验前，需要对细胞进行处理，如离心、洗涤和培养，以确保细胞的状态良好并有足够的数量。
2. 刺激物质的选择：γ干扰素释放实验中常用的刺激物质主要包括抗原、药物或其他具有免疫刺激性的物质。
抗原可以是病原体的特异性成分，如细菌、病毒或其他微生物产生的蛋白质或多肽。
药物刺激物可以是某些药物对机体免疫系统的直接或间接作用引起的免疫反应。
刺激物质的选择应该与样本来源和实验目的相匹配。
3. 实验方法的选择：γ干扰素释放实验可以通过多种方法进行，如ELISA（酶联免疫吸附测定法），ELISPOT（酶联免疫斑点法），流式细胞术等。
这些方法的选择取决于实验的需要和可用设备的条件。
比较常用的方法是ELISPOT法，该方法可以评估单个细胞生产γ干扰素的能力，形成的斑点数量与细胞产生的γ干扰素水平成正比。
4. 数据分析：γ干扰素释放实验得到的数据需要进行合理的分析和解释。
通常，根据刺激物质和实验目的的不同，可以采用差异分析、统计学方法等对数据进行处理。
数据的分析和解释可以为研究者提供了解细胞免疫功能的信息。
通过γ干扰素释放实验，我们可以了解机体对刺激物质的免疫反应程度和免疫调节功能。
这对于疾病的诊断、药物研发和免疫治疗等方面具有重要意义。
总结回顾：γ干扰素释放实验是一种评估机体免疫功能的方法，通过检测特定细胞对刺激物质引起的γ干扰素分泌反应来评估免疫反应的程度和调节能力。
γ干扰素释放实验的原理
γ干扰素释放实验的原理γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）是一种重要的细胞因子，是T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和淋巴细胞等免疫细胞产生的，对免疫应答和抗病毒、抗肿瘤等方面具有重要的生物学功能。
γ干扰素的释放实验可以用来检测患者免疫系统的功能状态，也可以用来评价特定病原体感染、免疫细胞功能、自身免疫疾病等的发生发展和治疗反应。
1. 细胞治疗法的原理：γ干扰素释放实验主要是通过采集患者的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs），然后经过体外培养处理，刺激其释放γ干扰素。
在培养过程中，添加特定的激活剂（如病毒、细菌成分或特定抗原）刺激PBMCs。
刺激后，PBMCs 中的T细胞被激活并释放γ干扰素。
通过检测细胞培养液中γ干扰素的浓度，可以间接反映患者免疫系统对刺激剂的反应能力。
2.γ干扰素的检测原理：γ干扰素的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、流式细胞术和放射免疫测定法（RIA）等。
其中，ELISA是最常用的检测方法。
ELISA方法利用特异性抗体对γ干扰素进行捕获和检测，可以测定培养液中γ干扰素的浓度。
流式细胞术可以利用荧光修饰的特异性抗体直接检测PBMCs中γ干扰素的表达；RIA方法则利用放射性同位素标记的特异性抗体鉴定γ干扰素。
3.激活剂的选择：γ干扰素释放实验中的激活剂选择对实验结果至关重要。
常用的激活剂包括病毒成分（如病毒感染的细胞裂解液）、特定抗原（如结核分枝杆菌抗原）、细菌成分（如脂多糖）等。
选择合适的激活剂可以最大程度地激活免疫细胞，并促使其释放γ干扰素。
4. 结果判读：γ干扰素的释放实验结果一般用γ干扰素的水平来表示，通常以累积浓度（pg/mL）作为评估指标。
通过对照组（如正常人群）和患者组进行对比，可以评估患者的免疫功能状态。
比如，如果患者的γ干扰素水平显著低于正常人群，可以提示免疫功能受损；而如果γ干扰素水平显著高于正常人群，则可能存在其中一种免疫反应异常。
γ干扰素释放试验标准操作流程
γ干扰素释放试验标准操作流程γ干扰素释放试验标准操作流程概述•γ干扰素释放试验（gamma interferon release assay）是一种用于检测某些感染病原体引起的细胞免疫反应的方法。
•本文将详细说明γ干扰素释放试验的标准操作流程，包括前期准备、实验步骤、数据分析等内容。
前期准备1.确保实验室拥有所需设备和试剂。
2.准备受试者血样（采用血液抽取方法）。
3.验证实验室的操作人员已经接受相关培训，熟悉操作步骤和安全注意事项。
实验步骤1.血样准备–将采集的血样转移到合适的试验管中，确保血样完整且无凝块。
–使用离心机离心血样，将血细胞和血浆分离开来。
2.细胞培养–取得合适的细胞培养板，加入培养基。
–将离心后的血细胞加入培养基中，控制细胞密度在合适范围内。
–孵育细胞，保持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3.刺激试剂添加–在培养的细胞上加入激发剂，如特定抗原。
–同时设置阴性对照（如未加刺激剂的细胞）和阳性对照（如已知患者血样）。
4.孵育试验–将细胞培养板放入恒温箱中，保持合适的孵育时间和条件。
–注意观察培养过程中的任何异常变化，记录相关信息。
5.液相检测–采用合适的方法（如ELISA等）检测培养液中的γ干扰素水平。
–按照厂家指南操作试剂盒，记录结果并进行质量控制的数据分析。
1.收集所有实验数据，包括阳性对照、阴性对照和受试者样本的γ干扰素水平测定结果。
2.进行质量控制分析–首先，检查实验数据是否符合预期的范围。
–其次，对比阳性对照和阴性对照的水平，确保实验结果可靠。
3.数据解释–根据实验结果判定受试者是否对特定抗原产生γ干扰素反应。
–结合临床资料和相关标准，进行结果的解读和诊断。
结论•本文提供了γ干扰素释放试验标准操作流程的详细说明，以帮助实验室完成该项实验。
•严格按照操作流程进行实验可提高实验的可重复性和结果的准确性。
•数据分析部分应根据实验目的和临床背景进行合理解读，以辅助疾病的诊断和研究。
γ干扰素释放试验在检测结核分枝杆菌潜伏感染中的应用
γ干扰素释放试验在检测结核分枝杆菌潜伏感染中的应用引言结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，在全球范围内仍然具有较高的发病率和死亡率。
虽然结核病可以通过药物治疗进行控制，但由于其长期潜伏期和传染性，解决结核病问题依然是全球范围内的重大挑战。
检测结核分枝杆菌潜伏感染的方法成为了目前研究和实践中的重要课题之一。
一、γ干扰素释放试验基本原理γ干扰素释放试验是一种利用免疫细胞对结核分枝杆菌特定抗原的反应来检测T细胞免疫应答的方法。
其基本原理是通过检测T细胞在受到结核分枝杆菌特定抗原刺激后产生的γ干扰素水平来判断被检测者是否感染了结核分枝杆菌。
与传统的结核菌素试验相比，γ干扰素释放试验不受卡介苗免疫和非结核分枝杆菌的感染等因素的影响，具有更高的特异性和更好的区分力。
2.对活动性结核病和非结核分枝杆菌感染的区分γ干扰素释放试验不受卡介苗免疫和非结核分枝杆菌感染的影响，因此能够更好地区分活动性结核病患者和非结核分枝杆菌感染者。
这对于临床诊断和治疗的选择具有重要意义。
研究显示，γ干扰素释放试验在活动性结核病和非结核分枝杆菌感染的区分上具有更高的灵敏性和特异性，可以帮助医生更准确地判断患者的感染状态，从而更好地进行治疗和管理。
3.适用于特定人群γ干扰素释放试验适用于各种特定人群，包括HIV感染者、免疫抑制患者、接受生物制剂治疗的患者等。
这些人群在结核病的感染和发展过程中具有特殊的情况和风险，传统的检测方法在这些人群中存在一定的局限性。
而γ干扰素释放试验不受外部因素的干扰，可以为这些特定人群的筛查和诊断提供重要的帮助。
γ干扰素释放试验在临床实践中的应用前景广阔。
4.便捷、快速、安全γ干扰素释放试验不需要特殊的培养设备和条件，只需一次采血即可进行检测。
相比之下，结核菌素试验需要48-72小时的培养时间，且结果受到诸多因素的影响。
γ干扰素释放试验具有更快速、便捷的特点。
γ干扰素释放试验不使用活体结核分枝杆菌或卡介苗，减少了对实验人员和被检测者的潜在危害，具有更高的安全性。
结核感染T细胞干扰素释放试验要点
4、TB-IGRA阳性，表明机体曾经患过结核病，不能区分目前是否为活动性结核病；
5、TB-IGRA所用抗原为MTB特异性抗原，阴性检测结果代表目前机体没有MTB特异抗原致敏的T淋巴细胞，即受检者目前未感染MTB。
说明：近期有其它细菌感染、慢性病等可能会造成体内γ-干扰素升高，或者近期接受γ-干扰素治疗也会导致体内γ-干扰素水平过高。
免疫缺陷患者，应用免疫抑制剂、肾上腺皮质激素治疗患者，病危病人和免疫能力极其低下，在接受结核杆菌相关抗原刺激时，γ干扰素的分泌比较低，可能会产生阴性结果。
建议对该类患者检测前参考CD4含量水平或者T淋巴细胞水平。
结核感染T细胞(TB-IGRA)/γ-干扰素释放试验
项目名称
标本类型
临床意义
“结核感染T细胞(TB-IGRA)”(又称“γ-干扰素释放试验”）
肝素锂抗凝血（长绿管），采集静脉血不低于4mL
1、可用于结核病辅助诊断，特别是对于菌阴肺结核和肺外结核的辅助诊断有更大的临床意义；
2、潜伏性结核筛查(不受卡介苗接种和环境分枝杆菌的影响)，主要用于生物制剂/免疫抑制剂使用前后的结核感染筛查；
γ干扰素释放试验在检测结核分枝杆菌潜伏感染中的应用
γ干扰素释放试验在检测结核分枝杆菌潜伏感染中的应用1. 引言1.1 潜伏感染与结核病潜伏感染与结核病是结核分枝杆菌感染的两个重要阶段。
潜伏感染是指机体内结核分枝杆菌存在，但并未引起症状或临床表现的情况。
在潜伏感染期间，结核菌可长期潜伏在宿主内，随时可能激活引发结核病。
而结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，其临床症状多样，可侵及全身各器官，严重影响患者的生活质量。
早期诊断和治疗潜伏感染至关重要，可以有效预防结核病的发生和传播。
潜伏感染与结核病之间存在着复杂的关系，很多潜伏感染者最终并不会发展成为结核病患者，但也有一部分患者会在未来发展成为结核病。
准确地判断潜伏感染的存在及其风险程度对于结核病的控制和预防至关重要。
γ干扰素释放试验是一种用于检测结核分枝杆菌感染的方法，可以辅助医生进行早期诊断和干预，有助于控制结核病的传播。
在接下来的正文中，我们将更详细地探讨γ干扰素释放试验在检测结核分枝杆菌潜伏感染中的应用及其优势和局限性。
1.2 γ干扰素释放试验简介γ干扰素释放试验（IFN-γ release ass ay，IGRA）是一种用于检测结核分枝杆菌感染的新型诊断方法。
相比传统的结核菌素皮试（TST），γ干扰素释放试验具有更高的特异性和耐受性，且不会受到疫苗接种和疫苗学效应的影响。
γ干扰素释放试验基本原理是利用结核菌蛋白质特异性的抗原刺激患者的淋巴细胞产生γ干扰素，并通过检测γ干扰素的释放量来判断是否感染结核分枝杆菌。
相比TST需要24-72小时的等待时间，γ干扰素释放试验只需一次采血，几个小时内就可得出结果，大大缩短了等待时间。
γ干扰素释放试验目前主要有两种商业化的产品：T-SPOT.TB和Quantiferon-TB Gold。
它们的原理和操作流程基本相同，在临床应用中具有较高的准确性和可靠性。
2. 正文2.1 γ干扰素释放试验在结核分枝杆菌感染中的应用γ干扰素释放试验（IGRA）是一种用于检测结核分枝杆菌感染的技术，它通过检测机体对结核分枝杆菌特异性抗原的γ干扰素释放来判断是否感染了结核菌。
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• 上述种检测方法的原理类似，检测技术和操作程序略有不同，均采用 的区基因编码抗原多肽作为特异性抗原，主要相对分子质量为 的早期 分泌抗原靶()和相对分子质量为 的培养滤液蛋白(一)抗原或抗原多肽
• ()自身免疫性疾病和器官移植患者在接受糖皮质激素或 • 拮抗剂治疗前，应单用或联合使用试验 • 筛查。
• 除感染者外，类风湿关节炎等自身免疫性疾病、器官移植等免疫功能 受损患者及糖尿病等特殊患者，因其自身原因，或接受糖皮质激素或 肿瘤坏死因子 拮抗剂等免疫抑制药物治疗导致免疫功能缺陷，这类患 者是发展为结核病的高风险人群，对这类患者也有必要进行筛查。
ห้องสมุดไป่ตู้验
γ干扰素 检测阴性
γ干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
的结核特异免疫抗原
• 和一主要存在于复合群，而在卡介苗和大多数中缺失，因 此的特异度较好。
• 但和—也存在于少数几种中，如堪萨斯分枝杆菌、海分枝 杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和胃分枝杆，故阳 性不能排除上述几种感染的可能。
干扰素释放试验的临 床应用
干扰素释放试验(． ），
是检测结核分枝杆菌()特异性抗原刺激细胞产生 的干扰素，以判断是否存在的感染。可弥补试验 的不足，目前多个国家已将其用于诊断潜伏感染( ，)，我国部分医院也已常规开展此项检测
• 目前国际上较成熟的有种：
• ()全血法：采用酶联免疫吸附试验()检测全血中致敏细胞再次受到特异 性抗原刺激后释放的．干扰素水平，称之为全血检测或结核感染细胞 免疫检测；
应行和检测的种情况（ ）
• 阳性者 • 肺结核病人的接触者 • 拟进行抗治疗的患者 • 拟透析的患者 • 拟行器官及造血细胞移植者 • 矽肺患者
结语 ()可用于诊断感染，但不能区分活动性结核病和，也不能准
确预测发展为活动性结核病的风险
()对疑似结核病患者具有辅助诊断作用，阴性结果对排除感 染有一定帮助
用于诊断肺结核：深圳第三人民医院的结果
结核患者 急性播散型肺结核 继发性肺结核 结核性胸膜炎 结核性脑膜炎 其他肺外结核
陈旧性肺结核 健康对照 新发肺结核密切接触者
例数 （）
() ()
（） （） （） （） （） （） （） （） （）
中国的国情适用吗？
干扰素释放试验在中国应用的建议
可以有
活动性肺结核患者密切接触者和医务工作者中的诊断
试验和均可用于的诊断和追踪，若考虑到 试验检测结果可能受卡介苗接种或影响时，可对试验阳性者
进一步采用帮助确认；
()不宜采用对大范围人群进行筛查；
()试验仍是在健康人群中动态筛查的首选。
• ()对感染人群进行筛查，单用试验的敏感度不高，应单用 或联合使用试验，在方法选择上优先考虑细胞检测技术。
对儿童结核病的辅助诊断
• 儿童结核病的临床症状不典型，重症及肺外结核病比例较 高，且结核病患儿的细菌载量低，咳嗽反射和气管纤毛运 动能力差，病原学检查阳性率很低，试验和联合诊断有一 定的辅助作用。
在诊断中的应用
• ．活动性肺结核患者密切接触者和医务工 作者中的诊断
• ．在感染等免疫抑制或缺陷患者诊断中的 应用
阳性对以下情况无法区分
• 卡介苗预防接种√ • 非结核分枝杆菌感染√ •√ • 活跃结核病√ • 结核病治愈、自愈后√
阳性
• 卡介苗预防接种ⅹ • 大多数非结核分枝杆菌感染ⅹ •√ • 活跃结核病√ • 结核病治愈、自愈后√
• 年 全国结核病流行病抽样调查 • 结核分枝杆菌复合群 ，非结核分枝杆菌
• 考虑到我国肺结核患者中菌阴肺结核所占 比例较高，在诊断这类患者缺乏细菌学依 据时，可发挥其辅助作用
• 应用于活动性结核病的辅助诊断 • 应用于诊断中
用于体液或组织标本？
近几年来国内有(仅限于方法)辅助诊断结核性胸膜炎和结 核性腹膜炎等肺外结核的报道，其中采用胸腔积液和腹水 等体液或组织标本检测的的敏感度和特异度高达％以上， 采用血液标本检测时则并未显示出优势。 此类研究报道数量不多，病例数也不足， 且国家食品药品监督管理总局批准的仅限于血液样 本的检测，即对体液或组织标本的研究尚未经过充分验证， 不能得出可靠的结论。
试验与的对比
• 试验作为诊断感染的传统方法，具有操作简便、成本低廉的特 • 点，至今仍广泛使用，但该方法使用的抗原成分复杂，易受卡介苗接种和非
结核分枝杆菌(，)的影响，特异度较低，且对人免疫缺陷病毒()感染及重症疾 病患者等免疫功能受损人群的敏感度不足。
• 荟萃分析结果显示，在感染人群中，的敏感度并未高于试验，但(尤其是细胞 检测)受细胞数量的影响小于试验，这可能因为检测过程已对单个核细胞数量 进行了标准化，即在检测程序上消除了淋巴细胞数量减少对检测结果的影响
()用于筛查时不受卡介苗接种的影响，较少受到 感染的影响，但不适用于流行病学筛查
()在感染人群中筛查的敏感度优于试验，但在其他人群中的 检测效率尚需进一步研究。
Thank you
• 年广州结核病流行病抽样调查：非结核分枝杆菌，且其中前位为阴性 的
的敏感性和特异性
• 美国认证临床实验数据： • 经培养确诊的结核病患者样本例 • 敏感性（∕）
• 例入伍新兵 • 特异性（ ∕ ）
• 对活动性结核病的辅助诊断：试验和均无法区分和活动性 结核病患者。国内的研究数据显示其敏感度和特异度差别 较大，敏感度为％一％，特异度为％～％(或以上)，但多 数文献报道的敏感度和特异度>％，提示的特异度优于试 验。