蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤〔待改良〕

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因cDNA.

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21〔DE3〕、Rosetta gami〔DE3〕、

Bl21 codon〔DE3〕等。

7、蛋白的诱导表达。

1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，参加IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度围。甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。

4）用上述IPTG浓度围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速〔140-180rpm〕，诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.

保种可以取一局部分成50μl一管，每次用一管，防止反复冻融。

8、包涵体检测。方案见附件2

9、如有上清表达，那么扩大摇菌。

1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml参加300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右〔约

2.5h~3h〕，然后加IPTG〔浓度同包涵体检测中使用的浓度。〕注：菌液浓度要适当

的浓一些，否那么第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。

3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度〔18°左右〕，转速140rpm左右。

4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。参加20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。

10、超声波裂解。

1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。

注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比拟大的时候不会出现大量气泡。

4.正常声音为：孜孜声，锋利刺耳的声音说明探头位置不对或者功率太大或者探头

松动等原因，要与时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠说明裂解完成〔后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好〕。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min〔即关闭总电源开关〕。

注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂〔PMSF〕，PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60

分钟，60分钟足够裂解。

11、取得上清

1〕将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。〔此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。〕

12、纯化上清---摸洗脱条件。

1）镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后参加平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。〔假设是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。〕取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

3）分别加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。

注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进展下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。

4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml〔将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管〕，留跑胶样品。

5）加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。〔尿素可能对NI柱有损伤。〕注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱与洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余Equilibration BufferpH=7.8 ，上清 pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。

13、跑胶验证。

1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓别离比要一样两块胶才会比拟一致。

2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES

3）300V快速压胶5min左右，160V别离样品50min左右。〔也可以300V,30min，只是图没有160V好看。〕

4）考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。

5）脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

14、纯化上清---收集目的蛋白

1)将重生的镍柱再次平衡〔即加Equilibration Buffer 3ml〕。

2)重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

15、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点〔用160V〕，保存好。

16、透析。

1）配制2L透析液〔配方见附件1〕，并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2）透析袋〔剪10cm即可〕用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H2O充分洗净。

3）用透析夹将透析袋夹住〔将透析袋折叠一下会夹的更牢〕，将洗脱的蛋白样品参加其中，置入提前预冷的500ml透析液〔20mM PBS+50mM NaCl〕中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。

注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。

17、浓缩。

1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，参加新的固体聚乙二醇。

3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。

4）透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。

注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋外表的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存。

18、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。

1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液参加超滤管中。

2）配平。

3）7400g，30min，4°离心，完毕时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以到达不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。

4）参加需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl

溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油〔1%-5%即可〕助溶。

5）收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度〔测量后〕，制备日期。

注：超滤管的使用方法见附件4

19、蛋白浓度测定。见附件3

20、蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。

21、抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

22、注射兔子。选择适宜的注射方式和适宜的免疫程序。

23、收集免疫血清。提取抗体。

24、抗体效价评定。

附件1

所需溶液配方：

2)Equilibration Buffer〔平衡缓冲液〕: PBSwith 10 mM咪唑pH 7.4

3)Wash Buffer〔清洗缓冲液〕: PBSwith 25 mM/50mM/75mM咪唑 pH 7.4

4)Elution Buffer〔洗脱缓冲液〕:PBSwith 250 mM咪唑 pH 7.4

5)MES〔再生缓冲液〕: 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodium

chloride; pH 5.0。即0.3904g MES+0.5844g NaCl.

6)透析袋处理液：2%〔w/v〕碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA

7)透析液：20mM PBS+50mM NaCl〔2.92g〕

TIPS:1—4的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS，用500ml水将试

剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer，再向其分别参加适当体积的8M咪唑。最后，定容。Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml，Equilibration Buffer配了300ml。PBS配了500ml。

附件2

包涵体检测

1.摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0.5后离心参加新的培养基和相

应浓度的IPTG低温〔16-25度〕诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。在离心前取500μl菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。

2.诱导完成后，用2mlEP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。1.5mlPBS (50m M

PBS,300m M NaCl )重悬细菌。

3.裂解细胞。用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。裂解3s，停止6s，

裂解时冰上放置。

4.别离上清。5000rpm，4min，4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm，

10min，4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加5微5*SDSloading buffer混匀，煮沸10min。

5.重悬包涵体。用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微

5*SDSloading buffer，煮沸10min。

6.正负对照的收集。离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40μl,参加10μ

l5*SDSloading buffer,煮沸10min裂解。

7.跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照与实验样品一起跑胶。一般顺序是: -,+,上清,包涵体.

附件3

蛋白浓度定量测试方案

1．将染色剂稀释。

稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H2μm的滤膜过滤于另50ml 离心管中。(此剂量可测4个样品。)

2．牛血清白蛋白〔BSA〕标准品的制备

1〕将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500μl/支(可以室温放置60天，-20度长期保存)。

2〕将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml，各180μl，另外加一管水

3．染色。

1〕取1.5ml已过滤的染色剂分别参加13支〔其中4支为待测样品〕1.5mlEP管中。4个梯度各做一个重复，共8支，另外加1个样品(或1+n个样品)和1个blank，共10支EP管(或10+n支)，分别对应标记。

2〕将30μl样品和30μl标准BSA与30μl H2O分别参加上述EP管中。涡旋混匀。

3〕室温孵育5min到60min。5min后即开场测量，在60min测完，越快越好，因为Absorbance

wil increase over time。

4.吸光度的测量。600nm处测量，并记录吸光度。注意：1.blank是染色液加30微升的水。

2.从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度围，据此决定sample 的测量顺序。

5.比色皿的洗涤。用100%乙醇浸泡洗涤。

6.标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。

附件4.

4ml millipore超滤离心管使用考前须知

1.用前用miliq 水润湿。

2.4度预冷。

3.离心力不能超过7500g。加速度设定为8.

4.离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开场离心，以使两膜所受的压力一

致。

5.使用完毕后，用miliq水洗净，参加1ml 0.1N NaOH泡24h，后参加1ml20%乙醇保存。

如果要短期保存几天，也可加水浸泡。

附件5

聚丙烯酰胺凝胶的制备与使用方法

附件6.

包涵体蛋白的提纯

与提上清中所用试剂不同之处：在Equilibration Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer 中各加了6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后，离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用Equilibration Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer中都含有6M尿素或盐酸胍。另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶。这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶。

如果要做包涵体，建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大，必须除去，除去后蛋白可能就析出了。尿素毒性相对较小，可以不用除去。这样可以省去很多麻烦。尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解：6mm变幅杆，15%功率，3s/6s，10min左右即可。也可以加上1%---5%的甘油助溶。甘油是加在Equilibration Buffer中的。

另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌，无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0.6左右。

乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE

1、1.5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl 100%乙醇，乙醇要-20度预冷，涡旋。

2、-20度放置10min。4度，15000rpm，10min，小心弃去上清，尽量去干净。此时管底可

见蛋白沉淀。

3、向管中加30μl 1.5*SDS-loading buffer。〔这里蛋白溶液已经浓缩了5倍〕。

4、上样，跑胶。

如有错误，敬请批评指正。

血清的提取

动物血采集后，室温自然凝固后立即4500g，10min离心，别离出血清。

抗血清保存有三种方法：

第一种是4℃保存，通常可保存3个月～半年，效价高时可保存一年左右；

第二种是-20℃～-40℃低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融；

第三种是真空冰冻枯燥保存，可保存5～10年。

注：耳缘静脉采血，为防止溶血请勿吸取流到外面的血，直接从静脉吸取的血液不会溶血。