蛋白表达纯化实验步骤
his蛋白纯化操作步骤全
His蛋白的纯化一目的蛋白样液的收集1：-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2：菌种复苏，将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基)，以未加菌的K+ LB培养基作空白对照，37度摇床培养12-16h。
3：扩大培养，将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6（2h左右）4：诱导表达，扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg，使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h，置-70度保存或立即进行下步操作5:收集包涵体，离心，5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵体，用PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5mlPBS）,放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌（有效时间30-40min，超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性）7：蛋白提取液的收集，离心，5000r 15min取上清（可4度保存），菌体保存，测菌体中目的蛋白含量大小使用8：介质处理，取出底帽滴出多余液体，柱子顶部朝上直立固定好，蒸馏水洗涤一次，再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子，最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。
9：介质与核酸结合，从柱子上部加入蛋白提取液，4度旋转混匀1h，收集流出液(若需要流出液再重新过柱一次，以最大限度提高结合力)10：取10ml 1*binding buffer洗树脂，洗2次，流出液标记洗涤顺序保存11：样品的收集，取10个1.5mlEP管分别标记1,2,3……10，每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴（第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可，若需要可适当增加）12：树脂的保存，若样品体积大于柱子体积，树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用，若不使用可用蒸馏水洗涤树脂，加入20%乙醇10ml -20度保存（一种蛋白树脂可重复使用，注意不要超过树脂的结合能力）二检测收集的样品中目的蛋白量的大小13：取13个1.5mlEP管，分别标记1#，2#，3#……10#，A,B,C从1号EP 管内取30ul样液于1#号EP管内，依次移取至10号于10#号，取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中，取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白纯化步骤
蛋白纯化步骤引言：蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。
为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。
一、细胞裂解和收集蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。
常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。
裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。
二、沉淀和上清液分离细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。
常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。
这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。
三、蛋白质分子量筛选蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。
这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。
常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。
四、亲和纯化亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。
亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。
通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。
五、离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。
根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。
通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。
六、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。
通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。
这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。
七、逆流层析逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。
该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。
通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。
蛋白质的表达纯化
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
蛋白质的表达纯化
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
蛋白质的表达纯化
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
• 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流 出液。
• 4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱， 分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
• 5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1 mL， 共收集6－10管，分别取1蛋0白u质l样的表品达纯用化于SDS-PAGE 分析。
蛋白质的表达纯化
实验步骤
• 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 • 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌
BL21菌株于5mL LB液体培养基中 （含100ug/mL 氨苄 青霉素），37℃震荡培养过夜。 • 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉 素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 • 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. • 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于20℃或-70℃冰箱中。
蛋白质的表达纯化
• 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配
方如下：
30%Arc- Tris-HCl H2O
Bis
MBP 蛋白纯化
1 诱导
预表达
5mlLB+100μL菌，37℃摇到OD=0.4~0.6（约2到3小时）；
加IPTG(1M IPTG一般2.5μL，可多设几个浓度)；
取样0h,2h,4h,6h,过夜；每次1ml
离心菌液，加20μL loading，沸水煮，跑胶检测
大量表达后菌液处理
12000rpm，2min,4℃,收集菌体；
CB洗1~2两次，10000 rpm，2min,4℃，
加CB重悬（100ML菌液一般2ML，可根据自己菌的多少和所需蛋白的浓度改变）；
然后超声或者冻融：
10000 rpm，20min,4℃，上清就是你要的啦（如果是第一次做可留一点检测上清中是否有你的蛋白，不要全部纯化啦）
MBP 蛋白纯化
一、溶液：
CB （Column buffer）:50ml
配方：
1M Tris-HCl pH 7.4 1ml
NaCl 0.585g
0.5M EDTA 100ul
Elution buffer：
50ml CB + 0.158g麦芽糖
二、纯化步骤
1、200ul beads 短离心，弃上清(15s)
2、用1ml CB 重悬，洗两次10000rpm
3、重悬在200ul CB中
4、加入200ul 粗提蛋白(上清)
5、4℃混匀60min，离心1min，弃上清
6、用1ml CB 重悬洗一次。
7、加入elution buffer，4℃混匀30 min
8、离心1min，取上清。
9、重复1次。
三、回收beads
1、水3倍体积
2、0.1% SDS 3倍体积
3、水1倍体积
4、CB 3倍体积
保存在20% 乙醇，4℃.。
(完整word版)蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA。
4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达.1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。
6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达).2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3）将有表达的菌株10％甘油保种,保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60％，使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140—180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1％的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1。
5，约5h左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1。
0左右（约2.5h～3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
）注：菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
蛋白质纯化实验流程
蛋白质纯化实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!蛋白质纯化实验流程一、实验准备阶段在进行蛋白质纯化实验之前，需要进行充分的准备工作。
简述蛋白质表达的主要操作流程
简述蛋白质表达的主要操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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(完整版)1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验
第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
蛋白纯化CSM-昆虫细胞中蛋白表达与纯化
14.2 His 标签蛋白表达纯化1、把His 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
2、第二天，小心地挑取培养菌落中的单克隆，加入到10mL 的加有适当抗性的LB液体培养基中，放在37℃的摇床中培养过夜。
3、把过夜培养的菌液倒入800mL 加有适当抗性的LB 液体培养基中，于37℃摇床中摇到大约OD600 值在0.6～0.8 之间，就可以拿出，把菌液放置于4℃冷却菌液20～30min。
4、在超净台中，加入诱导剂IPTG 至终浓度0.1mM，诱导蛋白表达，于18℃摇床中培养6-8h。
5、诱导完成以后，8000 rpm 离心10min，沉淀收集菌体。
6、在沉淀后的细菌菌体中，加入lysis buffer（10 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mMNaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）中重悬，1g 湿重的菌体沉淀用5mL 的裂解缓冲液，进行超声破碎，然后12000rpm 离心20min，离心后取上清。
7、在上清中加入1 mL Ni-NTA beads 到4 mL 裂解液中，于4℃冰箱中轻轻地混合60 min 左右。
8、加入4 mL 的wash buffer（300 mM NaCl，20 mM 咪唑，50 mM NaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂），在冰上洗4 次，每次孵育10min。
9、加入elution buffer（250 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，用NaOH调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）洗脱重组蛋白4 次，每次用500μl。
14.3 GST 融合蛋白的表达与纯化1、把GST 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
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蛋白表达纯化实验步骤〔待改良〕1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因cDNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21〔DE3〕、Rosetta gami〔DE3〕、Bl21 codon〔DE3〕等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，参加IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速〔140-180rpm〕，诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一局部分成50μl一管，每次用一管，防止反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达，那么扩大摇菌。
1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml参加300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右〔约2.5h~3h〕，然后加IPTG〔浓度同包涵体检测中使用的浓度。
〕注：菌液浓度要适当的浓一些，否那么第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。
另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。
3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度〔18°左右〕，转速140rpm左右。
4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。
参加20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。
每250ml菌液用30ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。
可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。
10、超声波裂解。
1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。
注意：1.要冰浴。
2.要随时观察裂解情况以防意外。
3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。
一般溶液量比拟大的时候不会出现大量气泡。
4.正常声音为：孜孜声，锋利刺耳的声音说明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因，要与时调整。
溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠说明裂解完成〔后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好〕。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min〔即关闭总电源开关〕。
注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂〔PMSF〕，PMSF工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。
11、取得上清1〕将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。
10000rpm，15min，4°离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。
〔此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。
平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。
〕12、纯化上清---摸洗脱条件。
1）镍柱处理。
将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后参加平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。
〔假设是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。
〕取20μl过柱后的样品，以备跑胶。
3）分别加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。
每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。
每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。
注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进展下一个梯度的洗脱。
实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。
4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。
上样量为4.5ml〔将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管〕，留跑胶样品。
5）加MES将NI柱重生。
MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。
流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。
〔尿素可能对NI柱有损伤。
〕注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱与洗脱影响较大。
镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余Equilibration BufferpH=7.8 ，上清 pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。
13、跑胶验证。
1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓别离比要一样两块胶才会比拟一致。
2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3）300V快速压胶5min左右，160V别离样品50min左右。
〔也可以300V,30min，只是图没有160V好看。
〕4）考马斯亮蓝染色。
一般染色2h即可。
5）脱色。
先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。
14、纯化上清---收集目的蛋白1)将重生的镍柱再次平衡〔即加Equilibration Buffer 3ml〕。
2)重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。
15、跑胶验证。
同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点〔用160V〕，保存好。
16、透析。
1）配制2L透析液〔配方见附件1〕，并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。
2）透析袋〔剪10cm即可〕用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H2O充分洗净。
3）用透析夹将透析袋夹住〔将透析袋折叠一下会夹的更牢〕，将洗脱的蛋白样品参加其中，置入提前预冷的500ml透析液〔20mM PBS+50mM NaCl〕中。
冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。
透析3次即可。
注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。
冰浴以防活性降低。
17、浓缩。
1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。
2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，参加新的固体聚乙二醇。
3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。
4）透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。
注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。
如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。
用透析液将透析袋外表的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存。
18、超滤法浓缩、透析蛋白。
使用超滤法就可省去16、17两步。
1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液参加超滤管中。
2）配平。
3）7400g，30min，4°离心，完毕时4ml变为1ml左右。
浓缩4倍。
可根据需要选择不同的离心时间，以到达不同的浓缩倍数。
可以几次的Elution液一起浓缩。
4）参加需要的蛋白储存液至4ml，离心。
重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。
蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。
如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油〔1%-5%即可〕助溶。
5）收集。
将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度〔测量后〕，制备日期。
注：超滤管的使用方法见附件419、蛋白浓度测定。
见附件320、蛋白活性测试。
转染细胞测量荧光。
21、抗原处理。
蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。
22、注射兔子。
选择适宜的注射方式和适宜的免疫程序。
23、收集免疫血清。
提取抗体。
24、抗体效价评定。
附件1所需溶液配方：2)Equilibration Buffer〔平衡缓冲液〕: PBSwith 10 mM咪唑pH 7.43)Wash Buffer〔清洗缓冲液〕: PBSwith 25 mM/50mM/75mM咪唑 pH 7.44)Elution Buffer〔洗脱缓冲液〕:PBSwith 250 mM咪唑 pH 7.45)MES〔再生缓冲液〕: 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。
即0.3904g MES+0.5844g NaCl.6)透析袋处理液：2%〔w/v〕碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA7)透析液：20mM PBS+50mM NaCl〔2.92g〕TIPS:1—4的溶液可以一起配制。
先配10ml 8M的咪唑。
再配1L的PBS，用500ml水将试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer，再向其分别参加适当体积的8M咪唑。
最后，定容。
Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml，Equilibration Buffer配了300ml。
PBS配了500ml。
附件2包涵体检测1.摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。
培养至OD600=0.5后离心参加新的培养基和相应浓度的IPTG低温〔16-25度〕诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。
在离心前取500μl菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。
正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。
2.诱导完成后，用2mlEP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。
1.5mlPBS (50m MPBS,300m M NaCl )重悬细菌。
3.裂解细胞。
用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。
裂解3s，停止6s，裂解时冰上放置。
4.别离上清。
5000rpm，4min，4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。
然后，10000rpm，10min，4度。