无血清培养基中蛋白类补充因子重组生产研究进展_宗超
重组人纤维连接蛋白对无血清培养的CIK细胞增殖及对K562细胞杀伤活性的影响
DOI：CNKI:61-1399/R.20110617.1135.010 网络出版时间：2011-06-17 11:35网络出版地址：/kcms/detail/61.1399.R.20110617.1135.010.html重组人纤维连接蛋白对无血清培养的CIK细胞增殖及对K562细胞杀伤活性的影响徐本玲1，袁龙2，高全立 3，张成娟1，张旭华1，范瑞华1，宋永平1（郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院：1.中心实验室；2.生物治疗科；3.普外科，河南 郑州 450008）摘要：目的探讨重组人纤维连接蛋白(RetroNectin, RN)诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK增殖、免疫特性及对人类K562细胞杀伤活性的影响。
方法密度梯度分离法分离外周血单个核细胞后分成两组，应用CD3单抗、IFN-γ、IL-2培养CIK细胞，一组含RetroNectin（RN组），一组不含RetroNectin（Non-RN组）。
记录两组细胞增殖速度；用流式细胞术动态测定免疫细胞表型；用CBA细胞因子试剂盒检测IFN-γ，TNF-α及IL-4的分泌；用CFSE/PI双标法测定CIK细胞对人红白血病细胞株（K562）的体外杀伤活性。
结果RN组细胞生长明显快于Non-RN组（P<0.05）；CD3+CD8+的细胞随着时间的延长逐渐增多，但两组间比较无统计学差异；CD3+CD56+细胞所占百分比在第5天和第10天时两组间比较均无统计学差异(P>0.05)，在第15天时RN组有大幅度升高，第15、20、25天两组比较均有统计学差异(P<0.05)。
细胞毒杀伤活性结果显示，RN 组与Non-RN组对K562细胞毒活性亦有统计学差异。
两组间细胞因子IFN-γ、TNF-α随着培养时间的延长，分泌量逐渐升高。
结论使用RN诱导的CIK细胞增殖速度快，杀伤肿瘤细胞活性高，是一种安全高效的细胞培养方法。
关键词：纤维连接蛋白；细胞因子诱导的杀伤性细胞；无血清培养；K562细胞中图分类号：R734.2 文献标志码：A 文章编号：1671-8259Influence of the recombinant RetroNectin on the behavior of CIK cells inserum-free culture mediumXU Ben-ling1, YUAN Long2, GAO Quan-li3, ZHANG Cheng-juan1, ZHANGXu-hua1, FAN Rui-hua1, SONG Yong-ping1收稿日期：2011-03-07 修回日期：2011-04-27基金项目：河南省卫生厅医学科技重大攻关资助项目（No. 201001013）。
重组蛋白在无血清培养基中发酵
重组蛋白在无血清培养基中发酵一、重组蛋白概述重组蛋白是通过基因工程技术将特定基因导入宿主细胞，使其表达出具有特定功能的蛋白质。
它在生物制药、医学研究、工业生产等多个领域都有着广泛的应用。
1.1重组蛋白的表达系统重组蛋白的表达系统主要包括原核表达系统和真核表达系统。
原核表达系统如大肠杆菌，具有繁殖快、成本低等优点，适合大规模生产一些结构简单的重组蛋白。
真核表达系统包括酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，能表达出更接近天然结构和功能的重组蛋白，但成本相对较高，培养条件也较为复杂。
1.2重组蛋白的应用领域在生物制药领域，重组蛋白可用于生产治疗性蛋白质药物，如胰岛素、干扰素等。
在医学研究中，它可作为工具蛋白用于研究蛋白质的结构和功能。
在工业生产方面，重组蛋白可用于生产生物酶、生物传感器等。
二、无血清培养基的特点与优势无血清培养基是一种不含有动物血清成分的细胞培养基。
2.1无血清培养基的成分它主要包含氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等基本营养成分，同时还添加了一些生长因子、激素、脂质等物质来满足细胞生长和蛋白质表达的需求。
2.2无血清培养基的优势与传统的含血清培养基相比，无血清培养基具有以下优点：成分明确，便于对培养过程进行精确控制；减少了血清带来的潜在污染风险，提高了产品质量和安全性；有利于下游产品的分离和纯化，降低了生产成本。
三、重组蛋白在无血清培养基中发酵的关键因素3.1宿主细胞的选择不同的宿主细胞对无血清培养基的适应性不同。
原核宿主细胞如大肠杆菌在无血清培养基中的生长和蛋白表达特性需要深入研究。
真核宿主细胞如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞在无血清培养基中的营养需求和培养条件也各有差异。
3.2培养基配方的优化无血清培养基的配方需要根据宿主细胞的类型和重组蛋白的表达要求进行优化。
例如，对于需要大量表达特定重组蛋白的细胞，可能需要增加某些生长因子的含量。
同时，要考虑营养成分之间的平衡，以确保细胞的正常生长和蛋白表达。
无血清培养CHO细胞的研究进展
３ 无血清培养 Ｃ ＨＯ细胞 的研 究进展
随着生物制品的需求加大以及无血 清培养基诸多优势 ． 越来越多 的生物制药公司开始采用 无血清 培养基培养 Ｃ Ｈ ０细胞 ．研制适合 于 Ｃ ＨＯ细胞生长和产物表达 的低 成本 无血清培养基是生物制药领域关 注的热点 。 ３ ． １ 无血清培养基成分研究 无血清培养基的成分相对 比较清楚 ． 人们可根据培养 目的及 细胞 种类 的不 同． 对培养基成分进行调整优化 ． 以达 到更好地培养 目的 研究证 明． 在无血清培养基中添加蛋 白水解物可 以提 高最 大细胞 密度 和生产效率 酵母水解 物可作 为一种低成本 的无血清培养基添加 物， 用 以成产 人血小板生成素 （ ｈ Ｔ Ｐ Ｏ ） 。大豆水解物能较好地 支持细 胞生长和维 持细胞活性 Ｉ ８ １ 。Ｂ ａ ｌ ｌ ｅ ｚ 等１ ９ 研 发出一 种培养 Ｃ Ｈ Ｏ 一 ３ ２ ０细胞 生产 Ｉ Ｆ Ｎ ｙ的无蛋白培养基 ． 该培养基 中添加 了大米水解物 ． 最终最大 细胞密度能提高 ２ ５ ％． １ Ｆ Ｎ￣ ／ 浓度能提高 ６ Ｏ ％。 还有研究评价 激素 、脂类 及微量元素等成分对无血清 培养 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞 的影响 赵丽丽等Ｉ ｔ Ｏ ｌ 以表达重组 Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ — Ｆ ｃ 融合蛋 白的 Ｃ Ｈ ＯＫ Ｉ细 胞为研究对 象 ． 确定 大豆蛋 白水解 物和酵母提取 物的混合物 、 地 塞米 松及脂肪乳剂这几种关键组分对培养基的影 响 ． 为适合 于细胞 生长和 产物表达 的低成本无血清培养基的研 制提供 了参考 张大鹤等… 研 制 出两种适 于重组 Ｃ Ｈ ０ 一 Ｋ １ 细胞培养 的无血清培养基 微量元素完全 可 以替换无血清培养基中的蛋 白． 支持细胞 生长 和促进蛋 白表达 通 过优化调整其他 营养物质 ． 去除蛋 白水 解物 ． 且不需 添加任何小 肽化 合物后 ． 仍能支持高密度的 Ｃ Ｈ ０细胞培养 。 添加氨基酸有利于维持细胞活性与抗体合成 ：添加 Ｂ 族维生素能 促进细胞生长并延长培养 时间： 葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长 ． 而 浓度较低时又不能有效支持细胞的生长与抗体的合成 ．因此需要维持 适 当的浓度 通过合理调整这几类营养物 的浓度配比形成 的优化无蛋 白培养基 ． 可使培养的 Ｃ Ｈ Ｏ细胞最高密度达到 ５ ２ ． ６ ｘ １ ０ ５ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ／ ｍ Ｌ． 抗体 产量达到 ２ ７ ４ ｍｇ ／ Ｌ ， 与初 始培养基相比分别提高 了 ３ ３ ％和 ６ ３ ％＂ ２ Ｊ 通过对无血清培养基成分的适当调 整和改 进 ． 可 以实 现对某一类 细胞 或细胞 产物快速 、 专一 的培养 目的 ． 如何将这 些改进应用 到大规 模生产 中还需要进一步的研究 ３ ． ２ 适用 于悬浮培养的无血清培养基 悬浮培养是 哺乳动物细胞 大规模培养研究 和应用的重要模 式和 首要 选择ｉ ｔ ｓ － ｔ ４ １ Ｃ Ｈ Ｏ细胞 为贴壁依赖性细胞 ． 进行悬浮培 养面 临的最 大 问题就是细胞易集结成团使得细胞 生长缓慢 ． 且 细胞 团中央细胞因 营养不足而容易凋亡 对于 Ｃ Ｈ Ｏ细胞 的悬浮培养而言 ． 培养基是影响 细 胞生长 和 目标 表达 产物 生产 的最 重要 因素之 一 目前 已有适 于 Ｃ Ｈ Ｏ细胞大规模悬浮 培养的商业化无血清培养基 ． 但存在成分复 杂 、
植物源无血清培养基的研究进展
科技视界SCIENCE & TECHNOLOGY VISION0 引言与传统的培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他生物提取物，能支持细胞在体外长时间生长和繁殖，是继天然培养基和合成培养基之后的第三类培养基。
目前商业化的无血清细胞培养基有明显的特征区别，通常可分为4种类型：无血清培养基（Serum -free medium ，SFM ）、 无动物源培养基（Animal -component -free medium ，ACFM ）、无蛋白培养基（Protein -free medium ，PFM ）、化学成分限定培养基（Chemically defined medium ，CDM ）。
无血清培养基中没有添加血清，但会添加一些额外的成分来维持细胞的生长，因此，无血清培养基通常是由基础培养基和合适比例的激素、生长因子、贴壁因子和结合蛋白等添加因子组成。
在过去的几十年里，血清已经被各种成分所取代，如重组表皮生长因子（Epidermal growthfactor ，EGF ）、胰岛素、转铁蛋白、皮质醇，最常见的是牛垂体提取物（Bovine pituitary extract ，BPE ）用于培养贴壁角质形成细胞。
在基础培养基中添加血清的主要目的是提供促细胞生长成分，作为营养物质、激素、生长因子以及蛋白酶抑制剂，同时血清能够使细胞贴壁以及平铺在细胞瓶中，提供特殊的保护机制来避免细胞的机械损伤和剪切力，还可以抑制有毒部分对细胞的冲击，提高培养基的缓冲能力[1-3]。
血清中含有可以转运脂类、脂肪酸、激素和微量元素（尤其是铁元素）的白蛋白和转铁蛋白。
但是随着欧洲许多国家爆发疯牛病（Bovine spongiform encephalopathy ，BSE ），血清的应用受到越来越多的质疑。
由于批量使用的动物血清来源于自然生物体（主要是新生牛），它本身携带和采集、加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，因此，使用新生牛血清存在作者简介：张凯茵，南京财经大学本科生，主要研究方向为粮油副产品生物转化技术。
CHO细胞无血清培养基的研究进展
CHO细胞无血清培养基的研究进展作者：杜秀冬来源：《科技风》2020年第21期摘要：由于血清会增加支原体、病毒和朊病毒污染，使纯化过程复杂化，因此中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞的悬浮培养最好使用无血清培养基（serumfree medium，SFM），但是没有通用的SFM以用于所有细胞系的培养。
因此，需要针对每种单独的细胞系开发特定的SFM。
本文综述了CHO细胞SFM的研究进展。
关键词：CHO细胞;无血清培养基;基因工程蛋白质中国仓鼠卵巢细胞已被最广泛地用于治疗性抗体的商业生产。
随着对治疗性抗体需求的不断增加，CHO细胞的流行性可能会持续存在。
通过动物细胞培养生产基因工程蛋白是获得糖蛋白（例如用于治疗目的的单克隆抗体）的常用方法。
由于其表达量低于原核和酵母表达系统，故提高外源基因在CHO细胞中的表达效率至关重要，这对培养方法提出了更高要求。
临床上使用的生物技术产品应在无血清的培养基中生产，因为动物来源的血清价格昂贵，并且可能含有不合格物质，会损害人体健康。
其次，CHO细胞使用悬浮培养方式，与静态培养方式相比具有更高的剪切力。
因此，为提高CHO细胞生长和外源基因表达量，需要通过大量的知识和合理的技术来设计适用于CHO细胞培养的SFM[1]。
1 CHO细胞表达系统CHO细胞表达系统经过多年的研究和开发，是目前全球研究较多的一种外源基因表达系统，在生物制药领域中应用广泛[2]。
CHO细胞是抗体生产中最常用的宿主细胞系，因为它们能够对治疗用途的mAb进行适当的翻译后修饰。
CHO细胞表达系统原核表达系统优势较大，与其他表达系统相比，优点主要有以下几方面：（1）目的蛋白易于表达，且能被分泌至培养基中;（2）具有准确的转录后修饰功能，表达的外源蛋白与天然产物生物学特性及相关理化性质相同;（3）能在无蛋白、无动物源培养基中进行高密度的悬浮培养，利于工业化生产;（4）分泌自身的内源蛋白较少，利于重组蛋白的分离和纯化[3]。
用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展
中国细胞生物学学报Chinese Journal of Cell Biology 2021，43(4): 905-916DOI: 10.11844/cjcb.2021.04.0025用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展李伟风^樊振林“2张洹瑜U2林艳^王天云G新乡医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，新乡453003;2河南省重组药物蛋白表达系统国际联合实验室，新乡453000;3新乡医学院护理学院，新乡453003)摘要 哺乳动物表达系统因其具有类似于人源化细胞的翻译后修饰方式，已经成为重组蛋白药物生产的主要表达系统。
中国仓鼠印巢(Chinese hamster ovary,C H O)细胞是生产重组蛋白的理想哺乳动物细胞宿主，目前近70%批准上市的重组蛋白药物是由C H O细胞生产的。
常规细胞培养所用的培养基需要补充血清才能正常生长，但血清存在来源批次不一、下游分离纯化困难、支 原体污染潜在风险等缺点，因此，C H O细胞生产重组蛋白药物要求必须用无血清培养基培养避免以上问题产生。
近年来，围绕无血清培养基进行了大量研究，并取得了显著进展。
该文综述了CHO细 胞的特性、无血清培养基的基础成分及作用，以及一些特殊添加剂的作用等方面的研究进展。
关键词 C H O细胞;无血清培养基;糖蕋化;关键成分Advances of Serum-Free Medium for CHO Cells forthe Production of Recombinant ProteinLI W e i f e n g1’2,F A N Zhenlin1’2,Z H A N G H u a n y u1，2,L I N Y a n1’3,W A N G T i a n y u n1.2* {^Department o f B iochemistry and Molecular Biology, School o f B asic Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China\2H enan International Joint Laboratory o f R ecombinant Therapeutic Protein Expression System, Xinxiang 453000, China\z S chool o f N ursing, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)Abstract M a m m a l i a n expression s y s t e m has b e c o m e the m a i n expression s y s t e m for the production of recombinant protein,d u e to its similarity o f the post-translational modification to the h u m a n cells.C H O(Chinese h a m ster ov a r y)cells are ideal m a m m a l i a n expression hosts for r e c o m b i n a n t protein production.T h e m e d i u m used for routine cell culture requires supplemental s e r u m for n o r m a l g r o w t h.H o w e v e r,d u e to the disadvantages o f s e r u m,s u c h as different sources a n d batches,difficulty in d o w n s t r e a m separation a n d purification,a n d potential risk o f m y c o p l a s m a contamination.Therefore,serum-free culture m e d i u m is required for C H O cells to produce r ecombinant protein drugs to avoid the a b o v e p r o b l e m s.In recent years,a lot o f researches h a v e b e e n per f o r m e d o n serum-free m e d i u m,a n d remarkable progress has b e e n m a d e.In this r eview,the characteristics of C H O cells,the basic c o m p o n e n t s a n d functions o f serum-free m e d i u m,a n d the functions o f s o m e special additives are r e v i e w e d.K e y w o r d s C H O cells;serum-free m e d i u m;glycosylation;k e y c o m p o n e n t收稿H期:202(M O~22 接受日期:2021 -02-04河南省高等学校重点科研项目计划(批准号:20A350007)和河南省高校重点科研项目(批准号:19A350008)资助的课题*通讯作者。
无血清培养基在CHO细胞培养中的应用进展-细胞生物学论文-生物学论文
无血清培养基在CHO细胞培养中的应用进展-细胞生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——随着生物技术的飞速发展，单克隆抗体、细胞因子、疫苗和各种生物活性蛋白等生物制品在诊断和治疗中应用日益广泛，其需求量增加，因此，通过体外大规模培养动物细胞生产生物制品技术的研究越来越受到青睐。
CHO 细胞是生产蛋白类生物制品最重要的表达系统，采用无血清培养CHO 细胞相比含血清培养，能避免对实验动物的伤害、潜在的污染源影响、不同批次血清间的生物活性和因子的不一致及价格高等诸多弊端，因而受到生物制药领域的广泛关注。
1 CHO细胞CHO 细胞即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster OvaryCell），是最具代表性的动物细胞表达系统，被广泛应用于生物制药领域。
它建株于1957 年，由美国科罗拉多大学Theodore T. Puck 从一成年雌性中国仓鼠卵巢中分离得到，是一种连续细胞系，能传百代以上，具有永生性。
后来陆续又有很多科学家用药物加压、极端条件筛选和导突变等方法筛选得到了一系列不同表型的CHO 细胞株[1],如DUKX-B11、DG-44 和CHO-K1 等。
CHO 细胞能用于表达各种复杂的重组蛋白。
据统计，70%以上的动物细胞表达药物产品都是以CHO 细胞为表达宿主[2]. 2011 年 6 月批准的27 种单克隆抗体中，其中13 种就是通过CHO 细胞表达的，占了约50%的比例。
CHO 细胞之所以成为最受欢迎的宿主细胞，主要在于其易于培养以及基因操作，而且相比其他表达系统，它还具有许多优点[3-4]:①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；③具有外源重组基因的高效扩增和表达能力；④既可贴壁生长也可以进行悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，外源蛋白表达水平较高；⑤CHO 细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的后分离。
Materials Studio 软件辅助晶体结构教学
0引言晶体的结构及其规律性是固体物理课程的重要组成部分,同时也是材料科学与基础、固体电子学等课程的重要基础内容[1-4]。
其所涉及的晶体结构复杂,概念、原理抽象,学生普遍反映难学、教师感觉难教。
鉴于晶体结构的教学对于后续课程内容的基础地位,如何激发学生学习这部分内容的兴趣进而提高教学效果,教师教学观念的转变、教学方法的改进以及先进教学手段的引入就显得尤为重要。
Materials Studio是一款功能强大,操作简便且可在一般PC机上运行的分子模拟软件[5]。
该软件不仅能方便地建立各种晶体的三维结构模型,还能计算和模拟晶体的X射线、中子及电子等粉末衍射图谱,进而确定晶体的结构[6-7]。
本文选取晶体结构教学中晶体的结构及其对称性、晶胞/原胞、晶面/晶向、X射线衍射等概念及原理,使用Materials Studio分子模拟软件对这些知识点、概念及原理进行了可视化及具体的计算分析,以期为提高晶体结构的教学效果提供参考。
1Materials Studio(MS)软件应用1.1直观显示晶体结构,加深对晶体对称性的认识图1YBa2Cu3O7晶体的结构从MS软件菜单命令File→Import→Structure中导入不同的晶体结构,图1给出了超导体YBa2Cu3O7的晶体结构,向学生直观、生动形象地展示了YBa2Cu3O7晶体的3D结构,以开阔学生的视野;通过旋转、移动、缩放所建晶体结构,使学生从不同角度观察认识所建的晶体结构及其对称性;再从菜单命令Build→Show Symmetry→Symmetry Group,向学生讲解菜单对话框中各种符号的含义,加深学生对晶体对称性的认识。
1.2晶胞、原胞的区别晶胞与原胞是晶体学中两个重要且易混淆的概念。
在教学中一般告诉学生原胞是晶体中最小的周期性重复单元,而晶胞是晶体最小周期性重复单元的几倍。
多数教材此处是以简立方、体心立方、面心立方结构为例向学生说明原胞、晶胞的区别[1-3]。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。