实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
酶_肝脏_实验报告
实验名称：探究肝脏酶活性与肝功能的关系一、实验目的1. 了解肝脏酶活性与肝功能的关系；2. 掌握肝脏酶活性检测的方法；3. 分析肝脏酶活性与肝功能的关系。
二、实验原理肝脏是人体内最重要的代谢器官之一，具有多种生物催化功能。
肝脏酶活性反映了肝脏的代谢能力，对肝功能具有一定的指示作用。
本实验通过检测肝脏酶活性，分析肝脏酶活性与肝功能的关系。
三、实验材料1. 实验动物：健康成年大鼠；2. 仪器：离心机、分光光度计、恒温水浴锅、剪刀、镊子等；3. 试剂：血清酶活性检测试剂盒、生理盐水、酒精等。
四、实验方法1. 实验动物处死，无菌条件下取肝脏；2. 将肝脏组织匀浆，制成肝脏匀浆液；3. 测定肝脏匀浆液中ALT、AST、ALP、GGT等酶活性；4. 分析肝脏酶活性与肝功能的关系。
五、实验结果与分析1. 实验动物肝脏匀浆液中ALT、AST、ALP、GGT等酶活性检测结果如表1所示。
表1 实验动物肝脏匀浆液中酶活性检测结果酶名称平均值（U/L）ALT 200.0AST 100.0ALP 150.0GGT 80.02. 通过对实验结果的分析，得出以下结论：（1）ALT、AST、ALP、GGT等酶活性在肝脏匀浆液中均有不同程度的表达，说明肝脏具有一定的代谢功能；（2）ALT、AST、ALP、GGT等酶活性在肝脏匀浆液中的表达水平与肝功能具有一定的相关性，即酶活性越高，肝功能越好；（3）ALT、AST、ALP、GGT等酶活性在肝脏匀浆液中的表达水平存在差异，可能与肝脏组织结构、功能特点等因素有关。
六、讨论与展望1. 本实验通过检测肝脏酶活性，分析了肝脏酶活性与肝功能的关系，为临床肝功能评估提供了一定的理论依据；2. 肝脏酶活性检测在临床医学中具有广泛的应用前景，如诊断肝炎、肝硬化等肝脏疾病；3. 未来研究可进一步探讨肝脏酶活性与肝功能的关系，为肝脏疾病的早期诊断和治疗提供新的思路。
七、实验总结本次实验成功检测了肝脏酶活性，分析了肝脏酶活性与肝功能的关系，为临床肝功能评估提供了一定的理论依据。
动物体内过氧化物酶活性的
2.操作表
测定管
对照管
试剂一（ml)
2.4
2.4
试剂二应用液(ml)
0.3
0.3
试剂三应用液（ml) 0.2
双蒸馏水（ml)
0.2
样本
0.1
0.1
37℃水浴准确反应30分钟
试剂四（ml)
1.0
1.0
6、计算酶活性
选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算； 以每分钟OD值变化0.01ຫໍສະໝຸດ 为1个过氧化物酶活力单 位（U）。
/ 酶活力=（测定OD值-对照OD值）*反应总体积(ml)*1000 12*
比色光径（cm)*取样量(ml)*反应时间（30分钟）*匀浆蛋白浓度 (mgport/ml)
7.注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用， 酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验 误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用 排枪加样。。
5、实验步骤
1. 前处理
蝗虫幼虫匀浆的制备，准确称取幼虫的重量，按照重 量（g):体积（ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介 质（建议使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/l PH 7~7.4) 冰浴下制备成10%的幼虫匀浆液，4000转/ 分离心10分钟后，取上清420nm处，1cm光径。 100ul进行OD值的测定
3、POD的主要生理功能
参与活性氧代谢过程；
过氧化氢酶活性测定1
实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料马铃薯块茎。
（二）试剂1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。
2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
（三）仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。
三、实验步骤1 ．称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r ／ min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm下吸光度值，每隔 1min 读数一次。
四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
实验一 过氧化氢酶Km的测定 - 广东医学院---精品开放课 …
实验一 过氧化氢酶K m 的测定【原理】本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。
过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：2H 2O 2−−−−→−过氧化氢酶2H 2O+O 2↑H 2O 2浓度可用KMnO 4在硫酸存在下滴定测知。
2KMnO 4＋5H 2O 2＋3H 2SO 4 −→−2MnSO 4＋K 2SO 4＋5O 2↑＋8H 2O 求出反应前后H 2O 2的浓度差即为反应速度。
作图求出过氧化氢酶的米氏常数。
【试剂】1．0.05mol/L 草酸钠标准液 将草酸钠（AR ）于100～105℃烘12h 。
冷却后，准确称取0.67g ，用水溶解倒入100ml 量瓶中，加入浓H 2SO 4 5ml ，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。
2．约0.02ml KMnO 4储存液 称取KMnO 4 3.4g ，溶于1000ml 蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。
3．0.004mol/L KMnO 4应用液 取0.05mol/L 草酸钠标准液20ml ，于锥形瓶中，加浓H 2SO 4 ml ，于70℃水浴中用KMnO 4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO 4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L ，每次稀释都必须重新标定储存液。
4．约0.08mol/L H 2O 2液 取20%H 2O 2（AR ）40ml 于1000.0ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO 4标定之，稀释至所需浓度。
5．0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.0）。
【操作步骤】l ．血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml ，用蒸馏水稀释至10ml ，混匀。
取此稀释血液1.0ml ，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml ，得1：1000稀释血液。
2．H 2O 2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L 的H 2O 2 2.0ml 和25%H 2SO 4 2.0ml ，分别用0.004mol/L KMnO 4滴定至微红色。
过氧化氢酶活力测定CAT
过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。
学习几种测定CAT活性的方法，理解其测定原理。
一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。
H202的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。
其原理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。
根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。
其反应为：H2O2十2KI十H2S04→I2十K2S04十2H20I2+2Na2S2O3→2NaI+NaS406二、材料、设备与试剂1．植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。
2．主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml 三角瓶。
3．试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml 浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。
(3)10％的钼酸铵溶液：称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。
(4)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl2防腐)。
(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取Na2S2O3·5H2O 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，加入约0.1gNa2CO3，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。
一天后进行标定。
标定方法：精确称取分析纯K2Cr207约0．15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解，加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr3+离子的颜色)为止。
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。
测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。
用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。
放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品氧电极仪记录仪电磁搅拌器超级恒温水浴注射器、微量注射器容量瓶反应杯亚硫酸钠过氧化氢酶50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。
操作步骤1.仪器的标定按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
2.绘制酶活性标准曲线(1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
(3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl(例如浓度为20、30、40、50U/ml等)，记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
(5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。
3.样品测定(1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。
(3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。
过氧化氢酶活性测定
过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与设备与试剂】1、材料小麦叶片等。
2、仪器设备研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；3、试剂0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
【方法】1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.酶活性测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。
表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。
然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。
过氧化氢酶活性U/(g.min)=Wt V V A S T⨯⨯⨯⨯∆1.0240∆A 240= A S0－2)(21S S A A +式中 A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, A S2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
2010年11月生物化学实验设计方案
猪肝过氧化氢酶的提取，纯化，活力测定和动力学分析实验目的：(1)培养设计实验的能力，团体协作的意识；(2)深入理解酶的提取，纯化，活力测定和动力学分析；(3)学会离心机，透析膜，分光光度机的使用。
实验原理：过氧化氢酶（CAT）广泛存在生物体中，特别是绿色植物的叶绿体，线粒体和动物的内脏中。
本实验就是应用猪肝中丰富的过氧化氢酶的特点，来展开实验，探究一系列的性质和特点。
CAT为大分子蛋白质不能通过半透膜，在盐析的方法沉淀下来，CAT 作用最适宜的pH接近中性在pH 6.8—7.5的范围内。
酶都具有专一性，CAT作用的底物为过氧化氢，而过氧化氢在405nm，500nm，540nm，629nm处有最大吸收（本实验用500那么进行实验）。
用不同浓度下的过氧化氢绘制出标准曲线。
酶活力是指酶催某个化学反应的能力。
因此测定酶活力实质上就是测定被酶催化的化学反应的速度（v）。
酶促反应速度可单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增量来表示。
从而求出酶的总活力和比活力。
在酶促但应开始后，于不同时间测定反应体系中产物的量，以产物的增加量对时间作图，便得酶促应进程曲线。
要真实反应出活力的大小，测定酶促反应初期的速度、即酶反应初速度。
酶的底物浓度与酶促反应的速度关系一般情况下符合米氏理论。
根据中间产物学说，酶促反应的动力学模型可以表示为E+S↔ES→E+PV=(Vm*[S])/( Km+[S])从米氏方程可见，当V=Vm/2，Km=[S]，米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。
实验测定CAT的Km和Vm，采用最常用的linweaver-burk双倒数作图法。
这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：1/V1/v=(Km/Vm)*(1/[S])+1/Vm1/[S]linweaver-burk双倒数作图酶活力是同样受调节控制的，许多化学因子都可以通过与酶分子结合会影响没活力。
在酶溶液中，加入不同浓度的Mg2+，测定酶活力的变化情况，判断Mg2+对CAT激活作用的强度;加入不同浓度的Ag+可以观察对CAT的抑制作用。
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定过氧化氢酶的活性测定——⾼锰酸钾滴定法（滴定法、⽐⾊法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于⾎红蛋⽩酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为⽔和分⼦氧，在此过程中起传递电⼦的作⽤，过氧化氢则既是氧化剂⼜是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的⽣成量测定该酶活⼒⼤⼩。
在反应系统中加⼊⼀定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，⽤标准⾼锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4--------5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和⽤具】研钵；三⾓瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温⽔浴；容量瓶25ml×1。
【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L⾼锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，⽤新煮沸冷却蒸馏⽔配制成1000ml，⽤0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2⼤约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释⾄1000ml，⽤标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进⾏标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4?2H2O 12.607g，⽤蒸馏⽔溶解后，定容⾄1L。
【⽅法】1.酶液提取取⼩麦叶⽚2.5g加⼊pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移⾄25ml容量瓶中，⽤该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转⼊容量瓶中，⽤同⼀缓冲液定容，4000rpm离⼼15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三⾓瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加⼊酶液2.5ml，对照瓶中加⼊⾼温灭活酶液2.5ml，再加⼊2.5ml0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温⽔浴中保温10min，⽴即加⼊10% H2SO4 2.5ml。
过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 - 生化实验技术
计算公式：标定的 KMnO4 C=0.2/V mol/L
（4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于 17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至 1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条 件下）进行标定；
（3）0.02mol/L高锰酸钾标准液配制：称取 KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水 配制成1000mL ，临用前用草酸钠标定。
高锰酸钾溶液标定：
取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4溶液于锥形瓶中， 加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶 液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动， 待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作 用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但 滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈 现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2 总反应式：2 H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定 该酶活力大小。
在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反 应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴 定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
实验二、过氧化氢酶的 活力和动力学常数测定
——高锰酸钾滴定法
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案：
（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液
一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用
二、实验原理：
1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧
2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞
匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质）
3、氯仿; Pr沉淀剂，CA T由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀
4、离心：离心机分离固液
三、实验步骤：
1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g
2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,
组织捣碎机匀浆3-5min
3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min
4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液
5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE
检测，-20℃冰箱保存。
另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。
（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理
二、实验原理：
1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程
2、盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出
3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子
的一种分离纯化技术
三、实验步骤：
1、向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态
下浴搅拌1h；
2、将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀；
3、用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助
溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀；
4、留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检
测，-20℃冰箱保存。
5、将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。
6、将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙
醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一
次透析液；
7、一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集
沉淀；
8、用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器
助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。
（测OD280，若
蛋白浓度小于1mg/ml）
9、留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，
-20℃冰箱保存。
10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用
11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样
品浓缩至400-500ul收样，放置4℃
（三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：
二、实验原理：
三、实验步骤：
1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾
斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天
2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。
将层
析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓
冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。
当凝集颗粒沉
积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。
关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。
3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲
液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。
凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的
高度不得出现干胶和断层，应保持凝胶面平衡
4、浓缩样品（前次实验已经操作）
5、加样：打开层析柱口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面齐平时，关上出口。
用吸管吸取待分离的浓缩后的样品溶液400-500ul，在接近凝胶床表面处沿层析柱内
壁缓缓加入。
打开层析柱口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。
待样品液恰好完
全进入凝胶上端内面时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸缓冲液小心冲洗管
壁上的蛋白质，然后再加入磷酸缓冲液至距凝胶柱表面约4cm高。
6、洗脱：洗脱过程中不断加入磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），保持0.3-0.5mL／min
（约5-10滴／min）的流速，洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。
7、收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，。
收集管依次在407nm和280nm
波长下，以磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8）调零，测定各管吸光度值。
以管号为横
坐标吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线
8、收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，再次测定OD407nm
和OD280nm波长下的吸光度值即为最终得到的纯化产物
9、留样：取2mL纯化产物存样备用于蛋白浓度及Km至测定，放置4℃冰箱保存.
10、留样：取浓缩后的层析纯化样品60ul，用20uL4×电泳上样Buffer制样，备用于
SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存放置。
四、实验结果
（四）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化氢酶分子量
一、实验目的：
二、实验原理：
1、电泳：带点粒子在电场中的泳动
条件：带电粒子、电场、介质
影响因素：1）电场强度2）带电粒子情况3)带电粒子形状4）带电粒子分子量
2、SDS-PAGE：上样缓冲液的成分1）溴酚蓝：指示剂2）油：比重剂
3）β-巯基乙醇：破坏蛋白二硫键4）SDS：破坏蛋白氢键和疏水键
3、测分子量：lgMW=A-BRf Rf=过氧化氢酶的迁移率/溴酚蓝的迁移率
三、实验步骤：
1、凝胶的制备（由实验室老师完成，包括装板、配胶、凝胶液的灌注和聚合）
2、蛋白质样品的处理：将样品放在沸水中煮沸5min
3、加样：在垂直板型电泳装置的两个槽内加电极缓冲液，必须使缓冲液高于电极，然
后用微量注射器分别在各个样品槽中加样，匀浆液加15ul，盐析液和透析液加30ul
4、电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始电流控制在15-20mA电
泳15min后再升到50mA,保持电流强度不变，待指示剂溴酚蓝迁移至下沿约1-1.5cm
处，停止电泳，需h
5、剥胶和固定：电泳结束后取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入
凝胶柱与玻璃管内壁之间，轻轻旋转玻璃管，一面注入蒸馏水，一面推针呈旋转式前进，是凝胶柱与管壁脱离
6、染色：将凝胶浸入染色液（0.1%考马斯亮兰R-250，40%甲醇和10%的冰醋酸）中，
染色0.5h，弃去染色液
7、脱色：加入脱色液（10%甲醇和10%的冰醋酸），脱色1-3h，期间更换2-3次脱色液，
然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清楚后为止
8、测量和数据处理
四、实验结果：如图所示
（五）过氧化氢酶米氏常数的测定
一、实验目的：学会滴定的方法和Km值的测定
二、实验原理：
1、V=Vmax［s］/Km+［s］1/V=Kmax/Vmax［s］+1/Vmax
2、2H2O2 2H 2O +O2(反应学原理)
剩余的用KMnO4滴定：2 KMnO4+5 H2O2+3 H2SO4 2MnSO4 + K2SO4+5O2+8H 2O 在酸性环境下（硫酸）紫红色变为滴定终点的微红色，记录滴定用的ml数，取平均值计算H2O2的准确摩尔浓度。
求出反应前后的浓度差及反应的速度（V），以1/［s］为横坐标，1/V为纵坐标作图可求出酶的H2O2Km值
三、实验步骤：
1、稀释样品匀浆：4ul匀浆+4mlPBS 层析：2ul层析+1mlPBS
2、取6个50ml干燥的锥形瓶，编号后按下表操作
要求：试剂加入准确而迅速，立即摇匀。
加入试剂10min后到时立即加入25% H2SO42.0ml，边加边摇匀，终止酶促反应
3、滴定：用标准的0.002mol/L KMnO4滴定，记录个瓶消耗的KMnO4ml数。